周丹丹 王杰敏 楊科 張麗萍 鄭荃 白俊 胡雅瓊 牟青杰 尹崇高 李洪利

預(yù)后差、發(fā)病率逐年增高是肺癌患者死亡的主要原因[1]。肺癌患者的5年生存率低于20%，只有16%的患者在早期被診斷[2]，與其他肺癌亞型相比，肺腺癌的患病率有所上升[3]，越來越多的不吸煙者和從不吸煙者正在發(fā)展成肺腺癌[4]。因此迫切需要識別有效的生物標志物，探索新的治療靶點。

DERL3屬于Derlin家族（DERL1、DERL2和DERL3）的一員，介導(dǎo)錯折疊蛋白的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)之一[5]。據(jù)報道，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)有助于癌癥進展[6,7]。雖然DERL1在非小細胞肺癌[8]、乳腺癌[9]和結(jié)腸癌[10]中均有報道過高表達，但尚未有研究探討DERL3在肺腺癌進展中的作用。

本文將通過研究DERL3在肺腺癌中的異位表達情況進一步探討其促進肺腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制，從而確定DERL3是否是肺腺癌潛在的生物標志物和治療靶點。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)與試劑 正常肺上皮BEAS-2B細胞與肺腺癌A549細胞從ATCC（Manassas, VA, USA）獲取。BEAS-2B與A549按照ATCC要求常規(guī)培養(yǎng)。E-cadherin（1:500）、Vimentin（1:500）單克隆抗體購自Abcam公司。

1.2 細胞轉(zhuǎn)染 將對照質(zhì)粒Scr及敲低DERL3質(zhì)粒用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染入A549細胞。質(zhì)粒由Invitrogen合成。細胞分為兩組：①轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒的細胞命名為Scr/A549；②轉(zhuǎn)染敲低DERL3的質(zhì)粒的細胞命名為si-DERL3/A549。

1.3 Western blot實驗 Western blot參照文獻[11]轉(zhuǎn)染后細胞培養(yǎng)72 h后提取各組蛋白質(zhì)，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，一抗、二抗孵育后，用ECL超敏化學(xué)發(fā)光劑顯影，X線膠片曝光。β-actin作為內(nèi)參。利用NIH Image J軟件（Rockville, MD, USA）對Western blot中條帶灰度值定量分析，3次獨立重復(fù)實驗。

1.4 5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷（EDU）增殖實驗 將各組細胞中加入與培養(yǎng)液等體積的10 mmol/L EDU工作液，繼續(xù)孵育細胞2 h后去除培養(yǎng)液，并加入多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗滌細胞3次。每孔用0.3% Triton X-100通透液，室溫孵育15 min，PBS洗滌細胞3次。每孔加入Click反應(yīng)液，室溫避光孵育30 min。吸除Click反應(yīng)液，用PBS洗滌3次。使用Hoechst 33342進行細胞核染色。

1.5 Transwell侵襲與遷移實驗 按文獻[12]處理各組細胞，細胞懸液添加至上室，下室加入含20%胎牛血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后4%多聚甲醛固定，吉姆薩染色后于顯微鏡下隨機選取5個視野計數(shù)，取平均值作為最終結(jié)果。實驗獨立重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示。兩組計量資料之間的比較采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌基因芯片分析 使用肺腺癌mRNAs基因芯片對3例有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌組織（z2, z3, z4）和3例無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺腺癌組織（t1, t2, t3）的總RNA進行檢測，篩選條件為|logFC|≥2.0（P＜0.05）。結(jié)果顯示有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移肺腺癌組織有400個mRNAs表達下調(diào)，1,314個mRNAs表達上調(diào)。其中，DERL3表達上調(diào)明顯，logFC=11.514,687,3。熱圖顯示部分差異表達的mRNAs（圖1）。

圖 1 微陣列基因芯片中有或無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移部分差異表達mRNA的聚類熱圖Fig 1 The cluster heat map of partial differentially expressed mRNAs with or without lymph node metastasis in microarray gene chip

2.2 高表達DERL3影響肺癌患者生存預(yù)后 使用GEDs在線數(shù)據(jù)庫查詢DERL3在癌癥中的表達情況，結(jié)果顯示DERL3不僅在肺腺癌中表達升高，還在肺鱗癌（lung squamous cell carcinoma, LUSC）、胰腺癌（pancreatic adenocarcinoma, PAAD）、宮頸鱗癌與宮頸腺癌（cervical squamous cell carcinoma and endocervical adenocarcinoma, CESC）、乳腺浸潤癌（breast invasive carcinoma, BRCA）、子宮體子宮內(nèi)膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma, UCEC）、頭頸部鱗狀細胞癌（head and neck squamous cell carcinoma, HNSC）、膀胱尿路上皮癌（bladder urothelial carcinoma, BLCA）、膽管癌（cholangio carcinoma, CHOL）、肝細胞癌（liver hepatocellular carcinoma, LIHC）、嗜鉻細胞瘤和副神經(jīng)節(jié)瘤（pheochromocytoma and paraganglioma,PCPG）、腎透明細胞癌（kidney renal clear cell carcinoma,KIRC）、肉瘤（sarcoma,SARC）、前列腺腺癌（prostate adenocarcinoma, PRAD）、多形性膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma multiforme, GBM）中表達升高（圖2A），在淋巴腫瘤彌漫性大B細胞淋巴瘤（lymphoid neoplasm diffuse large B-cell lymphoma, DLBC）、急性髓性白血病（acute myeloid leukemia, LAML）、卵巢漿液性囊腺癌（ovarian serous cystadenocarcinoma, OV）、胃腺癌（stomach adenocarcinoma, STAD）、睪丸生殖細胞瘤（testicular germ cell tumors, TGCT）、甲狀腺癌（thyroid carcinoma, THCA）、結(jié)腸腺癌（colon adenocarcinoma,COAD）、直腸腺癌（rectum adenocarcinoma, READ）、間皮瘤（mesothelioma, MESO）、胸腺瘤（thymoma,THYM）、食管癌（esophageal carcinoma, ESCA）、皮膚黑色素瘤（skin cutaneous melanoma, SKCM）、子宮癌肉瘤（uterine carcinosarcoma, UCS）、腎乳頭狀細胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma, KIRP）、腎上腺皮質(zhì)癌（adrenocortical carcinoma, ACC）、腎嫌色細胞（kidney chromophobe, KICH）、葡萄膜黑色素瘤（uveal melanoma, UVM）、腦低級別膠質(zhì)瘤（brain lower grade glioma, LGG）中無明顯差異或表達降低。所以我們選擇DERL3為下一步的研究對象[13]。使用Kaplan-Meierplot[14]查詢生存曲線，結(jié)果顯示，高表達DERL3患者生存率明顯低于低表達肺癌患者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.047）（圖2B）。結(jié)果說明DERL3在多種癌癥中高表達且影響肺癌患者生存預(yù)后。

2.3 DERL3在肺腺癌細胞A549中高表達 使用Western blot實驗檢測正常肺上皮細胞BEAS-2B和肺腺癌細胞A549中DERL3的蛋白表達程度。結(jié)果顯示，DERL3在A549中的表達明顯高于BEAS-2B，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

2.4 si-DERL3質(zhì)粒敲減效率 Western blot實驗檢測si-DERL3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。結(jié)果顯示，與對照組細胞Scr/A549相比敲減組DERL3表達顯著降低，提示敲減質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）（圖4）。

2.5 DERL3促進A549細胞的遷移與侵襲能力 Transwell實驗測定DERL3對A549細胞遷移與侵襲能力的影響。結(jié)果顯示，與Scr/A549組相比，si-DERL3/A549組的細胞遷移與侵襲能力明顯降低（遷移：0.594±0.033vs1.162±0.038；侵襲：0.413±0.069vs1.113±0.024），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖5）。結(jié)果表明DERL3可以提高肺腺癌細胞的遷移與侵襲能力。

2.6 敲低DERL3抑制肺腺癌細胞增殖能力 EDU實驗檢測Scr/A549與si-DERL3/A549細胞增殖能力，結(jié)果顯示，與Scr/A549組相比，si-DERL3/A549組EDU染色陽性率明顯降低，表明該組增殖能力受到了明顯的抑制，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖6）。

2.7 肺腺癌A549細胞中E-cadherin以及Vimentin的表達水平 Western blot檢測Scr/A549與si-DERL3/A549中的E-cadherin以及Vimentin的表達。si-DERL3/A549組中Vimentin下降，E-cadherin的表達上升，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖7）。

圖 2 高表達DERL3影響肺癌患者生存預(yù)后。A：DERL3在癌組織和癌旁組織的表達；B：DERL3的生存曲線（P=0.047）。Fig 2 High expression of DERL3 affects survival prognosis of lung cancer patients.A: The expression level of DERL3 in tumor and normal adjacent tissues; B: The survive curve of DERL3 in lung cancer patients (P=0.047).

圖 3 Western blot檢測DERL3在肺腺癌A549細胞和正常肺上皮BEAS-2B細胞中的表達。A：Western blot驗證DERL3表達；B：相對灰度值表達比較柱狀圖（*P＜0.05）。Fig3 The expression of DERL3 in lung adenocarcinoma A549 cells and normal lung epithelial BEAS-2B cells was detected by Western blot.A: Western blot to verify DERL3 expression; B: The bar chart compares the expression of relative gray values(*P＜0.05).

圖 4 使用Western blot檢測DERL3敲減效率。A：Western blot驗證DERL3表達；B：相對灰度值表達比較柱狀圖（**P＜0.01）。Fig 4 The DERL3 knockdown efficiency was detected by Western blot.A: Western blot to verify DERL3 expression; B: The bar chart compares the expression of relative gray values (**P＜0.01).

圖 5 Transwell實驗檢測轉(zhuǎn)染后肺腺癌細胞遷移與侵襲能力。A：遷移實驗檢測穿過基底膜細胞數(shù)量；B：細胞遷移率的柱狀圖比較（*P＜0.05）；C：侵襲實驗檢測穿過基底膜細胞數(shù)量；D：細胞侵襲率的柱狀圖比較（*P＜0.05）。Fig 5 The ability of invasion and migration of lung adenocarcinoma cell after transfection was detected by transwell.A: The number of cells passing through the basement membrane was detected by the migration experiment; B: Histogram comparison of cell mobility (*P＜0.05); C:Invasion assay detected the number of cells passing through basement membrane; D: Histogram comparison of cell invasion rate (*P＜0.05).

圖 6 EDU實驗檢測敲低DERL3后A549細胞增殖能力。A：紅色代表EDU染色陽性的細胞，藍色代表細胞核；B：EDU染色陽性率的柱狀圖比較（*P＜0.05）。Fig 6 EDU assay detected the proliferation ability of A549 cells after knockdown of DERL3.A: Red for EDU positive cells, blue for nucleus; B:Histogram comparison of positive rate of EDU staining (*P＜0.05).

圖 7 Western blot檢測E-cadherin以及Vimentin在Scr/A549和si-DERL3/A549細胞中的表達。A：Western blot驗證E-cadherin以及vimentin表達；B：相對灰度值表達比較柱狀圖（*P＜0.05）。Fig 7 The expression of E-cadherin and Vimentin in Scr/A549和si-DERL3/A549 cells was detected by Western blot.A: Western blot to verify the expression of E-cadherin and vimentin; B: The bar chart compares the expression of relative gray values (*P＜0.05).

3 討論

肺癌5年相對生存率只有17%，是全球癌癥死亡的主要緣由之一[15]，因為大部分患者在診斷時已經(jīng)轉(zhuǎn)移，或者在初次手術(shù)或放療后復(fù)發(fā)。本文通過對肺腺癌基因芯片的分析找到在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌組織中表達較高的DERL3基因，使用在線數(shù)據(jù)庫進行預(yù)測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在多種癌癥中高表達，且高表達DERL3基因的肺癌患者生存率明顯低于低表達患者。所以在本研究中我們將關(guān)注DERL3在肺腺癌細胞侵襲、轉(zhuǎn)移方面的作用。

已有文獻[16-19]報道DERL3通過激活PI3K/AKt和EGRF-EPK途徑促進癌細胞增殖和侵襲能力，從而參與肺癌的惡性表型。我們通過在線數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)DERL3不僅在肺腺癌中高表達，在肺鱗癌、胰腺癌、宮頸癌、骨髓瘤、甲狀腺癌等多種癌癥中表達升高，這說明DERL3可能作為癌基因調(diào)控多種癌癥的發(fā)展過程。此外，生存曲線結(jié)果表明高表達DERL3肺癌患者預(yù)后較差。隨后我們通過Transwell遷移和侵襲實驗證明敲減DERL3后穿過基底膜細胞數(shù)明顯降低，說明敲減DERL3能夠抑制細胞遷移與侵襲能力。EDU增殖實驗證實敲減DERL3后細胞EDU染色陽性率明顯下降，說明敲減DERL3能夠抑制A549細胞增殖能力。以上實驗證實DERL3可能通過促進肺腺癌A549細胞增殖、遷移和侵襲能力從而促進肺腺癌發(fā)生發(fā)展過程。

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是由一個充分分化的上皮細胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)表型的過程，伴有上皮標志物的丟失、間充質(zhì)特性的獲得、遷移增強的細胞骨架的重組[18]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化在生理和病理上參與多種癌癥的癌變過程[19]。已有文獻[16,17]報道在非小細胞肺癌和膀胱癌中，DERL1的過表達通過影響上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而影響癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移。而我們證實敲減A549中的DERL3導(dǎo)致E-cadherin上調(diào)，Vimentin下調(diào)，所有這些生物標志物變化提示上皮細胞向間充質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)變。DERL3在肺腺癌細胞A549中通過調(diào)控上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而導(dǎo)致更惡性的表型。這是關(guān)于DERL3在上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化中作用的第一篇報道。

此外本研究有一定的局限性，這些結(jié)果來自體外數(shù)據(jù)，需要通過體內(nèi)研究來進一步驗證。DERL3在其他癌癥中的分子機制有賴于進一步探究。綜上所述，DERL3能促進肺腺癌惡性表型，在肺腺癌組織中DERL3的高表達導(dǎo)致預(yù)后不良，可能是一個潛在的肺腺癌預(yù)后標志物。

Author contributions

Zhou DD, Wang JM and Yang K conceived and designed the study.Zhang LP and Zhou DD performed the experiments.Zheng Q, Bai J and Hu YQ analyzed the data.Mou QJ, Yin CG and Li HL contributed analysis tools.Mou QJ, Yin CG and Li HL provided critical inputs on design, analysis, and interpretation of the study.All the authors had access to the data.All authors read and approved the final manuscript as submitted.