遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 沈陽 110032

新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）是由新型冠狀病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）引起的急性呼吸道傳染病，2019年12月于武漢爆發(fā)，臨床表現(xiàn)主要為發(fā)熱、干咳、乏力，胸片提示雙肺浸潤性病灶，少數(shù)患者為重癥感染，表現(xiàn)為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒癥休克等[1-3]。國家衛(wèi)健委于2020年1月21日將COVID-19納入乙類傳染病，采取甲類傳染病的防控措施。目前已確認2019-nCoV病傳播途徑為呼吸道飛沫和密切接觸，可以人傳人，在潛伏期（1～14d）亦具有傳染性，為防治帶來巨大困難[4-5]。

關(guān)于本病的治療，現(xiàn)代醫(yī)學目前沒有確認有效的治療方法，利巴韋林與磷酸氯喹等藥物在臨床試用，但容易出現(xiàn)難以耐受的不良反應(yīng)，目前的治療手段仍以對癥支持治療為主[6-7]。武漢金銀潭醫(yī)院張定宇院長表示，COVID-19實為自限性疾病，通過生活調(diào)養(yǎng)，提升機體免疫力，亦能改善癥狀或者痊愈。上海華山醫(yī)院感染科張文宏主任則表示，對抗COVID-19最有效的藥物就是自身的免疫功能。

本病屬中醫(yī)“疫病”范疇，病程分為醫(yī)學觀察期和臨床治療期，并根據(jù)病情分為輕型（寒濕郁肺證及濕熱蘊肺證）、普通型（濕毒郁肺證及寒濕阻肺證）、重型（疫毒閉肺證及氣營兩燔證）和危重型（內(nèi)閉外脫證）[8-9]。目前的臨床治療及研究結(jié)果表明，中西醫(yī)結(jié)合治療COVID-19的療效明顯優(yōu)于西藥治療，能夠明顯降低死亡率和輕轉(zhuǎn)重癥率[10-12]，故中醫(yī)藥治療被納入國家衛(wèi)健委和國家中醫(yī)藥管理局共同發(fā)布的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案 （試行第五、六、七版）》[13-15]。

《素問遺篇·刺法論》：“正氣存內(nèi)，邪不可干。”對于COVID-19的防控，最主要治法還是提升人體的正氣。扶正解毒合劑是遼寧中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院以國家級名中醫(yī)張靜生教授為核心的團隊根據(jù)COVID-19發(fā)生發(fā)展特點擬定的有效方劑，可用于流感、輕型及重癥肺炎的治療，有效預(yù)防COVID-19發(fā)病，緩解病情，改善預(yù)后。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學對扶正解毒合劑的有效化學成分進行篩選，找出其治療COVID-19的靶點基因及信號通路，進而探討該合劑治療COVID-19的分子作用機制，為進一步研究中醫(yī)藥作用機制提供科學依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 扶正解毒合劑的中藥化學成分篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP） （http://lsp.nwu.edu.cn/index.php）檢索扶正解毒合劑中8味中藥的有效成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，藥物相似性（drug likeness，DL）≥0.18為標準，分別對每味中藥化合物的藥物動力學進行篩選，其中OB是指藥物經(jīng)口服給藥后被機體吸收進入血液循環(huán)的相對量和速率，DL反映化合物中的特定功能基團與已知藥物的相似性，二者對中藥化學成分活性的評估具有重要意義。

1.2 扶正解毒合劑與COVID-19的共同作用靶點篩選 利用TCMSP數(shù)據(jù)庫搜索扶正解毒合劑關(guān)鍵化學成分的靶點信息，并通過Uniprot數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）查詢與靶點相對應(yīng)的人類基因名稱，再與通過基因組注釋數(shù)據(jù)庫平臺 （genome annotation database platform，Gene Cards）（https://www.genecards.org/）、在線人類孟德爾遺傳（0nline Mendelian Inheritance in Man，OMIM）數(shù)據(jù)庫（https://www.omim.org/）篩選出的COVID-19的疾病靶點基因進行映射，得到藥物-疾病靶點基因及與之對應(yīng)的關(guān)鍵化學成分。

1.3 關(guān)鍵化學成分-靶點的網(wǎng)絡(luò)可視化 將藥物關(guān)鍵化學成分與疾病的共同靶點基因?qū)隒ytoscape3.7.2軟件進行可視化處理，將關(guān)鍵化學成分與共同靶點基因的相互關(guān)系以網(wǎng)絡(luò)圖的形式進行呈現(xiàn)。在網(wǎng)絡(luò)圖中，關(guān)鍵化合物和靶點以節(jié)點表示，節(jié)點之間相互作用的關(guān)系以邊來表示。

1.4 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將扶正解毒合劑與COVID-19的共同靶點基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/Version 10.5），選擇研究物種為人類（Homo sapiens），篩選評分＞0.7的蛋白關(guān)系并隱藏出現(xiàn)的游離蛋白，從而得到PPI網(wǎng)絡(luò)。下載PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并篩選排名前15的PPI網(wǎng)絡(luò)核心基因。

1.5 基因本體（gene ontology，GO）信號通路富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）信號通路富集分析 通過Bioconductor數(shù)據(jù)庫（http://bioconductor.org/bioc Lite.R）查詢藥物-疾病共同靶點基因的基因ID。利用R語言安裝Bioconductor平臺相關(guān)安裝包，設(shè)置P值=0.05，q值=0.05，進行GO富集分析和KEGG富集分析，輸出結(jié)果并繪制barplot柱狀圖，并運用Cytoscape繪圖軟件構(gòu)建靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 扶正解毒合劑化學成分的篩選 利用TCMSP對扶正解毒合劑的8味中藥中所含的化學成分進行檢索，并通過OB≥30%、DL≥0.18標準進行篩選，共得到199個化學成分，其中白術(shù)7個、陳皮5個、防風18個、甘草92個、廣藿香11個、黃芪20個、金銀花23個、連翹23個。 見表1。

2.2 藥物-疾病靶點預(yù)測 通過TCMSP查詢扶正解毒合劑有效化合物的靶點信息，通過Uniprot進行基因ID的注釋。通過Gene Cards和OMIM數(shù)據(jù)庫搜索COVID-19的靶點基因，輸入“New coronavirus”，獲取相關(guān)疾病靶點基因共343個，將藥物與疾病的靶點基因進行映射，得到藥物-疾病共同靶點基因共51個。記錄共同靶點所對應(yīng)的扶正解毒合劑有效化合物，最終得到扶正解毒合劑和COVID-19的關(guān)鍵化學成分共126個，共同基因靶點共51個，分別為前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、PTGS1、二肽基肽酶-4（dipeptidyl peptidase-4，DPP4）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB p65（nuclear factor kappa B p65，NF-κB p65/RELA）、B細胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2，BCL-2）、B細胞淋巴瘤-2樣蛋白1（B ceulympnoma-2 like protein 1， BCL-2L1）、B細胞淋巴瘤-2相關(guān)死亡啟動子（B cell lymphoma-2 associated death promoter，BAD）、B細胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白（B cell lymphoma-2 associated X protein，BAX）、絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、MAPK1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase 3，CASP3）、CASP8、超氧化物歧化酶1（superoxide dismutase 1，SOD1）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARG）、谷氨草酰乙轉(zhuǎn)氨酶1（glutamic-oxaloacetic transaminase 1，GOT1）、 鈣 調(diào) 蛋 白 1（camodulin 1，CALM1）、一氧化氮合酶2（nitric oxidesynthase 2，NOS2）、NOS3、 絲裂原活化蛋白激酶8（mitogen-activated protein kinase 8，MAPK8）、MAPK14、環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白1（cyclic adenosine monophosphate response element binding protein 1，CREB1）、磷脂酶A2組4A（phospholipase A2 group 4A，PLA2G4A）、白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）、IL-6、IL-1β、IL-2、IL-1A、信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）、 血 紅 素 加 氧 酶 1（hemeoxygenase1，HMOX1）、細胞間黏附分子1（intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM1）、 視 網(wǎng) 膜 母 細 胞 瘤 1（retinoblastoma 1，RB1）、細胞周期蛋白依賴性激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、低聚果糖 （fructooligosaccharide，F(xiàn)OS）、 蛋 白 激 酶 C alpha（protein kinase C alpha，PRKCA）、PRKCB、熱休克蛋白A5（hot shock protein A5，HSPA5）、HSPB1、趨化因子配體2（chemokine ligand 2，CCL2）、趨化因子配體11（chemokine ligand 11，CXCL11）、CXCL2、絲氨 酸蛋白酶抑制蛋白E1（serine/cysteine proteinase inhibitor E1，SERPINE1）、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP1）、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、CXCL10、CD40配體（CD40 ligand，CD40LG）、干擾素調(diào)控因子1（interferon regulatory factor 1，IRF1）、白蛋白（albumin，ALB）、髓細胞白血病1（myeloid cell leukemia 1，MCL1）、含纈酪肽蛋白 （valosin containing protein，VCP）。 見圖1。

表1-1 扶正解毒合劑的有效化學成分Tab.1-1 Effective chemical components of Fuzheng Jiedu mixture

表1-2 扶正解毒合劑的有效化學成分Tab.1-2 Effective chemical components of Fuzheng Jiedu mixture

表1-3 扶正解毒合劑的有效化學成分Tab.1-3 Effective chemical components of Fuzheng Jiedu mixture

圖1 扶正解毒合劑與COVID-19交叉基因韋恩圖Fig.1 Venn diagram of coincidence targets between Fuzheng Jiedu mixture and COVID-19

2.3 藥物關(guān)鍵化學成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過Cytoscape3.7.2軟件對藥物-關(guān)鍵化合物-疾病-靶點基因網(wǎng)絡(luò)進行可視化處理。見圖2。圖中矩陣代表靶點，圓圈代表化合物，其中不同顏色代表化合物來源于不同的藥物。其中藥物活性成分以“degree”來表示，排名前10的關(guān)鍵化合物為槲皮素（quercetin，MOL00098，degree=36）、木犀草素（luteolin，MOL000006，degree=18）、山奈酚（kaempferol， MOL000422，degree=14）、漢黃芩素（wogonin，MOL000173，degree=14）、柚皮素 （naringenin，MOL004328，degree=12）、 川陳皮素（nobiletin，MOL005828，degree=11）、甘草查爾酮A（licochalconea，MOL000497，degree=11）、 鳶 尾 內(nèi) 酯 （irisolidone，MOL005916，degree=10）、 異 鼠 李 素 （isorhamnetin，MOL000354，degree=8）、 芒柄花黃素（formononetin，MOL000392，degree=8）。 排名前10的靶點有PTGS2、CALM1、NOS2、PPARG、PTGS1、MAPK14、DPP4、RELA、BCL2、CASP3。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析 將藥物-疾病共有的51個靶點基因?qū)隨tring數(shù)據(jù)庫，研究物種選擇人類（Homo sapiens），獲取蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系，篩選評分＞0.7的蛋白關(guān)系，并繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖。見圖3。圖中以藍色連線代表基因共進化證據(jù)，紅色連線代表基因融合證據(jù)，黃色連線代表文本挖掘證據(jù)等。該網(wǎng)絡(luò)包括51個節(jié)點，313條邊，其中評分≥0.995的互作蛋白為BADBCL2L1、RB1-CDK4、CASP8-CASP3、CASP8-BCL2L1、BCL2L1-BAX、IL1B-IL1A、BCL2-CASP8、MCL1-BAX、SOD1-CAT、IL6-IL4。這些蛋白之間的相互作用在網(wǎng)絡(luò)中非常重要，通過計算每個基因連接節(jié)點的數(shù)目，找出前15個PPI核心基因，分別為IL-6、MAPK1、MAPK8、CASP3、IL-1B、RELA、MAPK3、PTGS2、MAPK1 4、CCL2、FOS、IL-2、STAT1、EGFR、ICAM1，這些即為扶正解毒合劑治療COVID-19的核心基因。見圖3、4。

圖2 扶正解毒合劑關(guān)鍵化學成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 The key ingredients-target network diagram of Fuzheng Jiedu mixture

2.5 GO功能富集分析 GO主要包括生物過程（biological process，BP）、 細胞組成 （cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）3部分。 主要富集的BP包括脂多糖應(yīng)答（response to lipopolysaccharide）、細菌起源分子應(yīng)答（response to molecule of bacterial origin）、 金屬離子應(yīng)答（response to metal ion）、細胞對生物刺激的反應(yīng)（cellular response to biotic stimulus）等。見圖5。富集的CC包括膜筏（membrane raft）、膜 微區(qū) （membrane microdomain）、膜 區(qū)（membrane region）等。見圖6。富集的MF包括細胞因子受體結(jié)合（cytokine receptor binding）、磷酸酶結(jié)合（phosphatase binding）、細胞因子活性（cytokine activity）、蛋白磷酸酶結(jié)合 （protein phosphatase binding）等。 見圖7。

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，扶正解毒合劑治療COVID-19的關(guān)鍵靶點蛋白主要富集的信號通路包括晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體（advanced glycation end products-receptor for advanced glycation end products，AGE-RAGE） 信號通路、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）信號通路、IL-17信號通路等。見圖8。

2.7 靶點-通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 應(yīng)用Cytoscape軟件將得到的通路和靶點信息繪制成網(wǎng)絡(luò)圖，根據(jù)連接節(jié)點數(shù)目設(shè)定degree，形狀越大表示富集越顯著，網(wǎng)絡(luò)中的核 心 靶 點 為 IL-6、RELA、MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK14、STAT1、CASP3等。 見圖9。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network

圖4 PPI核心基因Fig.4 PPI core genes

圖5 扶正解毒合劑主要作用靶點BP氣泡圖Fig.5 The bubble chart of biological process of main targets of Fuzheng Jiedu mixture

圖6 扶正解毒合劑主要作用靶點CC氣泡圖Fig.6 The bubble chart of cellular component of main targets of Fuzheng Jiedu mixture

圖7 扶正解毒合劑主要作用靶點MF氣泡圖Fig.7 The bubble chart of molecular function of main targets of Fuzheng Jiedu mixture

圖9 靶點-通路網(wǎng)絡(luò)Fig.9 Target-pathway network

3 討論

冠狀病毒廣泛存在于人類和其他哺乳動物中，包含4個病毒屬，大多數(shù)冠狀病毒感染較輕。2019-nCoV是一種新出現(xiàn)的β冠狀病毒，Zhuo等[16]發(fā)現(xiàn)2019-nCoV病毒的基因序列與重癥急性呼吸綜合征（severe acute respiratory syndromes，SARS）病毒的相似度高達75%。且有研究發(fā)現(xiàn)，蝙蝠是該病毒的來源宿主，因為該病毒與一組蝙蝠來源的SARS樣冠狀病毒的親緣性最高，核苷酸相似性高達89.1%[17]。隨后，研究人員發(fā)現(xiàn)穿山甲的冠狀病毒基因組與2019-nCoV基因組相似率高達92.4%，揭示穿山甲可能是2019-nCoV的中間宿主[18]。

而2019-nCoV究竟來自何方，何時會發(fā)生突變，是科學界所關(guān)心的問題。病毒突變速度快，人類對病毒的研究永遠跟隨其后，而中醫(yī)早在千年以前就有過抗疫經(jīng)歷，根據(jù)天人合一的思想，以不變應(yīng)萬變，通過提高機體免疫力的方式來應(yīng)對外界各種變化，在戰(zhàn)略上做到先發(fā)制人，故中醫(yī)藥在對2019-nCoV的抗擊過程中展現(xiàn)出明顯優(yōu)勢。

本研究提示，扶正解毒合劑所含的槲皮素、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素、柚皮素、川陳皮素、甘草查爾酮A、鳶尾內(nèi)酯、異鼠李素、芒柄花黃素等化合物在與靶點基因的匹配中，具有較高的自由度。槲皮素又名櫟精，具有較好的祛痰、止咳功效，并具有一定平喘作用，多用于慢性支氣管炎的治療；同時還具有抗血小板聚集、抗腫瘤、防止心肌損傷等作用[19]。木犀草素是天然黃酮類化合物，具有較好的鎮(zhèn)咳和祛痰功效，對于支氣管哮喘、慢性咽炎等疾病的局部炎癥浸潤具有較強的抗炎作用。木犀草素與炎癥細胞因子TNF-α、IL-6等的κ產(chǎn)生密切相關(guān)，且與NF-κB介導的基因表達有關(guān)，此外還具有抗腫瘤、抗過敏、抗肺纖維化和舒張血管等作用[20-21]。山奈酚屬于黃酮類化合物，可通過抑制炎癥因子的表達來達到抗炎效果，同時可通過抑制IL-6、TNF-α的表達，從而降低小鼠肺損傷程度，且具有抗癌、抗動脈粥樣硬化、增強胰島素敏感性等功效[22]，其與芒柄黃花素均可通過降低肌酸激酶（creatine kinase，CK）、 乳酸脫氫酶 （lactate dehydrogenase，LDH）活性來保護受損心肌細胞[23]。柚皮素是柚皮甙的甙元，具有抗炎、抗纖維化、抗腫瘤和抗病毒作用，研究表明其可通過降低IL-6、TNF-α含量來顯著降低小鼠肺泡灌洗液中的白細胞計數(shù)和炎癥因子含量；同時還可提高SOD活性，緩解小鼠急性肺損傷[24]。異鼠李素為黃酮類化合物，具有較好的氧自由基清除作用，同時具有抗心肌缺血、降低膽固醇、保護心血管等生物學效應(yīng)，研究表示異鼠李素可能通過磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/Akt）/糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）/環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）信號通路發(fā)揮細胞保護作用[25]。

本研究中的關(guān)鍵靶點蛋白有IL-2、IL-6、MAPK1、MAPK3、MAPK8、MAPK14、CASP3、RELA、STAT1 等 。IL家族功能復雜，在免疫細胞的成熟、增殖、免疫調(diào)節(jié)等過程中發(fā)揮重要作用[26]。IL-6能夠刺激B細胞及T細胞增殖和分泌抗體，還能活化細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic lymphocyte，CTL）[27]。 MAPK與細胞增殖、免疫調(diào)控相關(guān)，宿主細胞可通過抑制MAPK來抑制病毒的活性[28]。RELA與中性粒細胞的凋亡密切相關(guān)，且與哮喘嚴重性有關(guān)[29]。CASP3與細胞凋亡的執(zhí)行階段密切相關(guān)，同時參與淀粉樣β4A前體蛋白的裂解[30]。STAT1與細胞因子信號轉(zhuǎn)導相關(guān)，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，可促進炎性因子的釋放，誘發(fā)炎癥反應(yīng)[31]。

GO富集分析結(jié)果顯示，BP主要包括脂多糖應(yīng)答、細菌起源分子應(yīng)答等。脂多糖通過細胞膜中的TLR4來表現(xiàn)作用，后者與炎性細胞因子的表現(xiàn)相關(guān)，在免疫應(yīng)答中起著重要作用，可以上調(diào)炎性因子，加重肺損傷[32]。KEGG富集分析所涉及的通路有AGE-RAGE信號通路、TNF信號通路、IL-17信號通路。RAGE在炎癥反應(yīng)中擔任促炎性介質(zhì)的角色，而RAGE的配體中，AGEs在促炎癥反應(yīng)中起到非常重要的作用[33]。TNF信號通路對促進細胞生長、分化、凋亡及誘發(fā)炎癥具有較強的效應(yīng)[34]。IL-17信號通路對宿主防御功能十分重要，與自身免疫性疾病及癌癥的發(fā)病密切相關(guān)[35]。

綜上所述，本研究闡述了扶正解毒合劑治療COVID-19的關(guān)鍵化學成分、作用靶點及作用信號通路，結(jié)果提示扶正解毒合劑可通過抑制炎癥反應(yīng)、提高機體免疫能力等途徑對COVID-19起到治療作用。探討扶正解毒合劑治療COVID-19多成分、多靶點、多通路的復雜作用機制，為未來的實驗研究及更廣泛的臨床應(yīng)用提供了科學依據(jù)。