平俐 盛小紅 辛向陽

視網(wǎng)膜母細胞瘤是兒童最常見的眼內(nèi)惡性腫瘤，約占所有兒童惡性腫瘤的3%[1]。目前大部分視網(wǎng)膜母細胞瘤患兒的預(yù)后較差，主要與就診不及時，且該病缺乏有效的治療手段有關(guān)[2，3]。此外，目前對視網(wǎng)膜母細胞瘤的預(yù)后預(yù)測尚不夠準(zhǔn)確，特別是對于微轉(zhuǎn)移風(fēng)險的評估[4]。因此，對視網(wǎng)膜母細胞瘤的分子標(biāo)記物進行研究，鑒定出能預(yù)測其預(yù)后的分子標(biāo)記物，并作為潛在的靶標(biāo)進行藥物設(shè)計，有深遠的意義。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是長度超過200個核苷酸的、具有高度異質(zhì)性的一類非編碼RNA[5]。越來越多證據(jù)支持lncRNA參與了廣泛的腫瘤生物學(xué)行為，包括細胞增殖、凋亡和侵襲[6]。目前多種lncRNA被鑒定出在視網(wǎng)膜母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演著抑癌基因或癌基因的角色[7，8]。本研究擬首先對就診本科室的視網(wǎng)膜母細胞瘤患兒中的lncRNA測序數(shù)據(jù)進行分析，篩選出新型lncRNA HOXA-AS2，進一步擴大樣本以驗證其預(yù)后價值。

資料與方法

一、一般資料

隨機選取2018年5月就診我科的3例(3只眼)視網(wǎng)膜母細胞瘤患兒的癌組織及同期就診的的3例(3只眼)正常視網(wǎng)膜樣本，對兩組間的組織樣本進行l(wèi)ncRNA表達譜分析，篩選差異表達lncRNA。然后挑選出HOXA-AS2，回顧性選取標(biāo)本庫中2012年1月至2017年12月就診我科的60例視網(wǎng)膜母細胞瘤的手術(shù)標(biāo)本進行PCR驗證，根據(jù)HOXA-AS2表達水平進行分組，評估HOXA-AS2對視網(wǎng)膜母細胞瘤的診斷效能及其表達水平與預(yù)后的關(guān)系。最后預(yù)測HOXA-AS2的靶基因，并對靶基因進行生物功能基因本體(gene ontology,GO)富集。

二、患者納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)術(shù)后病理確診視網(wǎng)膜母細胞瘤；(2)術(shù)后生存隨訪數(shù)據(jù)和組織標(biāo)本庫質(zhì)量合格。

2.排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并多原發(fā)癌或其他惡性腫瘤史；(2)拒絕參與研究者。

本研究已取得我院倫理學(xué)委員會審核并通過，所有納入者自愿參與，已簽訂知情同意書。

三、試劑和設(shè)備

NanoDrop2000分光光度計(美國Applied Biosystems公司)，StepOnePlus實時熒光定量PCR儀(Thermofisher)，Trizol試劑(碧云天公司)，PrimeScript RT reagent Kit(Takara)，SYBR Premix ExTaq II Kit(Takara)。

四、RT-PCR

對患者術(shù)后進行標(biāo)本取材，于30 min內(nèi)-80 ℃保存。按照RNA提取Trizol試劑盒說明書提取總RNA，并定量測定RNA濃度和純度。當(dāng)吸光度A260 nm/A280 nm為1.9～2.1時，說明純度達標(biāo)，選擇用于進行進一步分析。對HOXA-AS2進行qRT-PCR驗證，根據(jù)PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix ExTaq II Kit說明書逆轉(zhuǎn)錄提取RNA后進行qPCR，以GAPDH作為內(nèi)參。

五、生物信息學(xué)分析

運用Multi Experiment Matrix(MEM)在線數(shù)據(jù)庫進行HOXA-AS2的靶基因預(yù)測，該網(wǎng)站基于多數(shù)據(jù)集的共表達相關(guān)性進行靶基因預(yù)測，選擇前200名靶基因，運用STRING網(wǎng)站進行GO分析[9]。

六、統(tǒng)計學(xué)方法

計數(shù)資料采用卡方檢驗進行比較。總生存率分析采用Kaplan Meier法，并運用用Log Rank法比較，預(yù)后相關(guān)多因素分析采用Cox風(fēng)險回歸模型，采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、視網(wǎng)膜母細胞瘤的差異lncRNA及HOXA-AS2表達

對3例視網(wǎng)膜母細胞瘤和3例健康對照組的視網(wǎng)膜組織的lncRNA表達譜進行比較分析，共篩選出141個差異lncRNA，其中上調(diào)lncRNA共110個，下調(diào)lncRNA共31個(表1，為前5名差異基因)。選擇差異倍數(shù)最大的HOXA-AS2(logFC 4.54，P=3.94E-07)作為后續(xù)研究的進一步驗證。

表1 3例視網(wǎng)膜母細胞瘤和3例對照組的視網(wǎng)膜組織的差異lncRNA(前5名)

二、HOXA-AS2對視網(wǎng)膜母細胞瘤的預(yù)測價值

進一步搜集于2012年1月至2017年12月就診我科的60例視網(wǎng)膜母細胞瘤的手術(shù)標(biāo)本進行qRT-PCR驗證，年齡(2.5±1.8)歲(0.6～6歲)，以HOXA-AS2表達中位值為截點進行分組，結(jié)果提示： 視網(wǎng)膜母細胞瘤HOXA-AS2高表達組的3年OS明顯低于HOXA-AS2低表達組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(51.2%比96.0%，P=0.006，圖1)。

三、HOXA-AS2低表達組和HOXA-AS2高表達組臨床病理資料比較

對HOXA-AS2高表達組和HOXA-AS2低表達組的臨床病理資料進行比較，結(jié)果提示，兩組間不同性別、組織分型、腫瘤分期和視神經(jīng)侵犯相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。HOXA-AS2高表達組的脈絡(luò)膜浸潤率高于HOXA-AS2低表達組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(35.5%比10.3%，P=0.021)。

四、視網(wǎng)膜母細胞瘤患兒的總生存期預(yù)后多因素分析

進一步對視網(wǎng)膜母細胞瘤患兒的總生存期(overal survival,OS)相關(guān)因素進行Cox風(fēng)險回歸多因素分析，結(jié)果提示：只有HOXA-AS2表達水平入選回歸方程(OR=2.632，95%CI：1.228-5.641，P=0.013)，是視網(wǎng)膜母細胞瘤患者預(yù)后總生存期的獨立危險因素。

表2 HOXA-AS2低表達組和HOXA-AS2高表達組臨床病理資料比較

表3 視網(wǎng)膜母細胞瘤患者的預(yù)后進行Cox風(fēng)險回歸多因素分析

五、HOXA-AS2的靶基因

運用Multi Experiment Matrix(MEM)在線數(shù)據(jù)庫進行HOXA-AS2的靶基因預(yù)測，采用STRING數(shù)據(jù)庫對HOXA-AS2的靶基因數(shù)據(jù)集進行GO分析，結(jié)果提示，HOXA-AS2的靶基因主要富集于“早期胚胎發(fā)生后腦發(fā)育中前Hox基因的激活”的生物學(xué)過程中(FDR=5.60E-06)(圖2)。

討 論

隨著二代基因測序技術(shù)的發(fā)展與成熟，研究者發(fā)現(xiàn)很多疾病的發(fā)生與發(fā)展和lncRNA的異常表達有關(guān)，臨床中l(wèi)ncRNA常被應(yīng)用于診斷和預(yù)測，但其參與的相關(guān)機制尚不明了。目前關(guān)于視網(wǎng)膜母細胞瘤的lncRNA表達譜研究較少[10]，本研究首先通過對視網(wǎng)膜母細胞瘤患兒和健康對照組的lncRNA表達譜進行比較，篩選出141個差異lncRNA，其中上調(diào)lncRNA共110個，下調(diào)lncRNA共31個，有助于為今后視網(wǎng)膜母細胞瘤的lncRNA研究提供參考。

我們進一步選擇差異倍數(shù)最大的HOXA-AS2(logFC 4.54，P=3.94E-07)進一步驗證。lncRNA HOXA-AS2是一個長度為1048bp的長鏈反義lncRNA。由于其轉(zhuǎn)錄本位于HOXA3和HOXA4之間的HOXA集落中，HOXA-AS2被認為廣泛參與了多種癌腫的病理生理過程，并在多種癌腫中表達上調(diào)，如肝癌[11]、胃癌[12]和結(jié)直腸癌[13]等。此外，HOXA-AS2在這些癌腫中均具有預(yù)后預(yù)測價值，但其在視網(wǎng)膜母細胞瘤中的預(yù)后價值目前尚無研究探討。我們進一步搜集既往就診我科的60例視網(wǎng)膜母細胞瘤的手術(shù)標(biāo)本進行qRT-PCR驗證，發(fā)現(xiàn)HOXA-AS2高表達組的3年OS低于HOXA-AS2低表達組,(51.2%比96.0%，P=0.006),進一步對臨床資料進行分析，發(fā)現(xiàn)性別、組織分型、腫瘤分期和視神經(jīng)侵犯與HOXA-AS2表達無關(guān)。HOXA-AS2高表達組的脈絡(luò)膜浸潤率高于HOXA-AS2低表達組(35.5%比10.3%，P=0.021)，提示HOXA-AS2高表達的視網(wǎng)膜母細胞瘤生物學(xué)行為較差，侵襲性較強，HOXA-AS2在視網(wǎng)膜母細胞瘤的進展過程中扮演癌基因的角色。Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)體外敲除HOXA-AS2，可通過導(dǎo)致G1期阻滯，促進膽管癌細胞的凋亡，從而降低其增殖水平。在視網(wǎng)膜母細胞瘤方面，HOXA-AS2的促癌機制尚無研究，本研究對HOXA-AS2的靶基因數(shù)據(jù)集進行GO分析，結(jié)果提示，HOXA-AS2的靶基因主要富集于“早期胚胎發(fā)生后腦發(fā)育中前Hox基因的激活”的生物學(xué)過程中(FDR=5.60E-06) 提示其可能通過調(diào)節(jié)HOX家族表達參與視網(wǎng)膜母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展。HOXA-AS家族另一個成員HOXA11-AS通過吸附miR-506-3p，使其靶基因NEK6上調(diào)，從而促進視網(wǎng)膜母細胞瘤增殖[15]。HOXA-AS2在視網(wǎng)膜母細胞瘤方面的促癌機制及其靶標(biāo)設(shè)計值得進一步研究。

目前HOXA-AS2在乳腺癌[16]和胰腺癌[17]方面的預(yù)后價值已經(jīng)得到證實。為了進一步探討HOXA-AS2是否具有視網(wǎng)膜母細胞瘤的預(yù)后預(yù)測價值，我們對可能影響視網(wǎng)膜母細胞瘤患兒的OS的相關(guān)因素進行Cox風(fēng)險回歸多因素分析，發(fā)現(xiàn)只有HOXA-AS2表達水平入選回歸方程，較高的HOXA-AS2表達水平(OR=2.632，95%CI：1.228-5.641，P=0.013)是視網(wǎng)膜母細胞瘤患者預(yù)后(OS)的獨立危險因素。提示HOXA-AS2有望成為視網(wǎng)膜母細胞瘤的預(yù)后標(biāo)記物。

本研究篩出了HOXA-AS2是視網(wǎng)膜母細胞瘤潛在的生物標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜母細胞瘤HOXA-AS2高表達組的3年OS明顯低于HOXA-AS2低表達組，發(fā)現(xiàn)視網(wǎng)膜母細胞瘤組織HOXA-AS2高表達可作為視網(wǎng)膜母細胞瘤不良預(yù)后的獨立因素，并且HOXA-AS2的靶基因主要富集于“早期胚胎發(fā)生后腦發(fā)育中前Hox基因的激活”的生物學(xué)過程中，因此HOXA-AS2有望成為視網(wǎng)膜母細胞瘤的預(yù)后標(biāo)記物。