楊小平，曾慧君，虞偉明，陳瓊，酈娟，楊永

（武漢食品化妝品檢驗所，武漢430012）

0 引言

葉酸是指葉酸和具有葉酸生物活性的一類物質(zhì)的總稱[1]，攝入不足易引發(fā)巨幼紅細(xì)胞貧血和胎兒神經(jīng)管發(fā)育缺陷[2]，人體自身無法合成葉酸，只能通過飲食攝入，因此保證足夠的葉酸攝入量非常重要，特別是對于嬰幼兒而言。

檢測食品中葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜檢測法[3]，HPLC法[4]和微生物法[5]。色譜法測定嬰幼兒配方乳粉中葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，由于奶粉基質(zhì)及成分復(fù)雜等因素，靈敏度和回收率均比微生物法低[6]，因此國際仲裁方法為微生物法。本研究在微生物法原理的基礎(chǔ)上，用2 mL的EP管代替?zhèn)鹘y(tǒng)的試管進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液和樣品溶液的培養(yǎng)，經(jīng)過一系列的優(yōu)化措施，極大降低了檢驗工作量，命名為EP管法，更適用于日常批量檢驗。

1 實驗

1.1 材料與儀器

鼠李糖乳桿菌，CICC 6224；乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，BD，美國；葉酸測定培養(yǎng)基，青島海博；乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基，BD，美國；葉酸標(biāo)準(zhǔn)品，純度97.0%，SUPELCO，美國；瓷珠菌種保存管，青島海博；一次性無菌過濾器，0.45μm，密理博。

嬰幼兒配方乳粉，中國檢驗檢疫科學(xué)研究院，貨號QC-IP-016，特性值為142.0μg/100g，能力評定標(biāo)準(zhǔn)差23.4μg/100g，量值范圍為95.2～188.8μg/100g。

超純水機，密理博；imark多功能酶標(biāo)儀，BIORAD公司；全自動生化鑒定系統(tǒng)，美國Biomerieux公司；UV2700紫外可見分光光度計，島津公司。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)量控制措施

測定葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)必須有足夠的質(zhì)量控制措施，包括：玻璃器皿，培養(yǎng)基，菌株，葉酸標(biāo)準(zhǔn)品，葉酸質(zhì)控樣品及加標(biāo)試驗。

玻璃器皿先用自來水洗刷干凈，沸水煮30 min，再在1∶50的稀鹽酸中浸泡24 h以上，二級水沖洗干凈，200℃烘2 h待用；葉酸測定培養(yǎng)基的驗證，參照GB 5009.211-2014設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，驗證培養(yǎng)基對各梯度濃度的葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)程度，以未接種0對照管作空白對照，測定接種的標(biāo)準(zhǔn)0管的吸光度值，若吸光度值在0.1以下，說明培養(yǎng)基中葉酸本底符合要求，同時驗證測定培養(yǎng)基、工作菌株和標(biāo)準(zhǔn)溶液三者之間配合響應(yīng)程度；菌株的驗證。觀察菌株在平板上的顏色、形態(tài)、大小、劃線的觸感，并使用厭氧菌和棒狀桿菌鑒定卡在全自動生化鑒定系統(tǒng)上進(jìn)行生化特征驗證；關(guān)于葉酸標(biāo)準(zhǔn)品，因為標(biāo)準(zhǔn)品可能會含水，所以需要用分光光度計進(jìn)行標(biāo)定，經(jīng)稀釋后配制成葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，分裝至2 mL的EP管，-20℃保存；葉酸質(zhì)控樣品及加標(biāo)實驗，試驗時需要用葉酸質(zhì)控樣品進(jìn)行比對，同時進(jìn)行加標(biāo)試驗，計算回收率，驗證測試體系的有效性。

1.2.2 工作菌株的制備

取鼠李糖乳桿菌凍干管，復(fù)蘇菌株，按照瓷珠菌種保存管的方法，-20℃保存作為標(biāo)準(zhǔn)儲備菌株。需要時，取一顆瓷珠到乳酸桿菌瓊脂平板上，充分接觸接種，傳三代左右，按照國標(biāo)的方法制備接種菌液，將此菌液與60%甘油按一定的比例混合，分裝于2 mL的EP管中-20℃保存，此凍存液可作為下次實驗的工作菌液。

1.2.3 樣品的制備及稀釋

根據(jù)奶粉標(biāo)簽值稱取0.3～0.5 g奶粉，用氫氧化鈉乙醇溶液溶解并超聲使其完全溶解分散，定容至100 mL，再用水做適當(dāng)稀釋，使樣液中葉酸質(zhì)量濃度在0.2～0.5 ng/mL，用注射器吸取樣液0.45μm無菌濾膜過濾出約1 mL樣液備用。

1.2.4 樣品測定管的制備

將2 mL EP管插入雙面板中，分別吸取樣液0.05，0.1，0.2 mL至3個EP管中，補水至0.5 mL，再加入0.5 mL含菌液的測定培養(yǎng)基，每個樣品做兩個平行，結(jié)果如表1所示。

表1 樣品測定管的制備體積 mL

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

按表2的順序制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，各標(biāo)準(zhǔn)系列管中葉酸的量分別為0.000，0.005，0.010，0.020，0.030，0.040，0.050，0.060，0.080，0.100 ng。另3支EP管設(shè)置為0對照管，設(shè)置同S1但不加菌液。如表2所示。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線管的制備體積 mL

1.2.6 培養(yǎng)

將上述制備好的樣品管和標(biāo)準(zhǔn)曲線管放入培養(yǎng)箱36℃培養(yǎng)40～44 h，直至葉酸消耗完。

1.2.7 測定

培養(yǎng)結(jié)束后，混勻培養(yǎng)液，各取0.2 mL培養(yǎng)液到本底均一的空白酶標(biāo)板中，靜置1 h后在630 nm波長下讀取吸光度值，保存數(shù)據(jù)。

1.2.8 結(jié)果計算

應(yīng)用拜發(fā)試劑盒的計算軟件，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線點的質(zhì)量濃度和數(shù)量，根據(jù)每個孔的吸光度值計算出每個樣品孔內(nèi)葉酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，再根據(jù)稀釋倍數(shù)和稱樣量計算出樣品中葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 各質(zhì)量控制因素的影響

基于微生物法原理測定葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，質(zhì)量控制措施非常必要。試驗中用到的玻璃器皿要注意有機物的污染，清洗完成后，高溫烘烤可去除有機物殘留，避免有機物或抗生素等對實驗的影響[7-8]。

選擇合適的測定培養(yǎng)基是試驗成功的關(guān)鍵。2017年以前多使用BD葉酸酪蛋白培養(yǎng)基，2017年以后，葉酸酪蛋白培養(yǎng)基停產(chǎn)，大部分實驗室使用青島海博或北京陸橋的葉酸測定培養(yǎng)基。葉酸測定培養(yǎng)基的關(guān)鍵是酪蛋白，酪蛋白中若未去除殘留的葉酸，則在測定中本底偏高，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)性也較差，不適合做葉酸的定量檢測[9]。

微生物法測定葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的菌株有3種：鼠李糖乳桿菌，糞鏈球菌和啤酒小球菌。每種菌株對不同結(jié)構(gòu)的葉酸敏感程度不同，糞鏈球菌只對非甲基化葉酸敏感；鼠李糖乳桿菌則對單谷氨酸葉酸、含2或3個谷氨酸的葉酸及其還原型衍生物均敏感，是3種菌株中反應(yīng)譜帶最寬的一種，也是最為常用的菌種[5]。為保證在運輸、傳代、儲存過程中菌株性能的穩(wěn)定性，使用前需要對菌株的關(guān)鍵生化指標(biāo)進(jìn)行驗證，評價工作菌株是否適用。

加標(biāo)實驗可以確認(rèn)培養(yǎng)體系中是否有抑制劑存在，低回收率說明抑制劑存在。關(guān)于標(biāo)準(zhǔn)品，S O’Broin等人使用鼠李糖乳桿菌測定葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)時，無論采用葉酸，5-甲基-四氫葉酸或5-甲酰-四氫葉酸，繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線基本相同，說明這幾種常見形式的標(biāo)準(zhǔn)品對葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定結(jié)果幾乎無影響[10]。

2.2 工作菌液制備方式的優(yōu)化

菌株的傳代次數(shù)與培養(yǎng)時間應(yīng)根據(jù)實際情況而定，以菌株活力能滿足實驗要求為宜。關(guān)于最終測定體系中的接種量，實驗發(fā)現(xiàn)，菌液的透光率在80%左右，菌液與培養(yǎng)基的體積比為1：200為宜。菌量太大，則吸光度值的波動較大。將工作菌株冷凍保存在由等量60%甘油和葉酸測定培養(yǎng)基組成的冷凍保護(hù)液中，能有效防止冰晶對菌體的損害。將解凍后的工作菌液按比例加入到測定培養(yǎng)基中進(jìn)行混合，培養(yǎng)體系均勻性更好，有利于保證數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性。

2.3 測定體系的優(yōu)化

與國標(biāo)法相比，本方法將測定體系等比例10倍縮小為1 mL，但體系中葉酸的質(zhì)量濃度不變。優(yōu)化后，使用EP管代替試管，EP管架代替試管架，移液器代替各種移液管。樣液及葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液均采用0.45μm濾膜過濾除菌，消除了高溫高壓滅菌對試驗結(jié)果的影響。過濾除菌的樣液及標(biāo)準(zhǔn)工作液均可-20℃短期存放，方便了試驗數(shù)據(jù)的復(fù)測。

2.4 測定方式的優(yōu)化

紫外分光光度計測量每根試管的吸光度值耗時耗力，測量時間的間隔不一致，測定條件不統(tǒng)一。EP管法培養(yǎng)結(jié)束后將菌液混合均勻，吸取培養(yǎng)液到空白酶標(biāo)板中測定吸光度值，可大大縮減讀數(shù)時間，且各管測定時間間隔一致，保證了測量結(jié)果的可靠性。

2.5 結(jié)果的計算

拜發(fā)微孔板法葉酸測定試劑盒采用微生物法原理測定樣品中添加及原生的葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，其自帶的計算軟件默認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)曲線為四項式，該軟件可以個性化設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量和質(zhì)量濃度，通過設(shè)置樣品孔的數(shù)量及布局，可自動計算各樣品孔中葉酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，再通過稱樣量和稀釋倍數(shù)即可計算樣品中葉酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。相比傳統(tǒng)的手繪標(biāo)準(zhǔn)曲線更省時省力，計算各管中葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)更加準(zhǔn)確方便。

2.6 EP管法標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和定量限

EP管法標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示，其R2可達(dá)0.99以上，表明相關(guān)性良好。對于標(biāo)準(zhǔn)曲線的設(shè)置，可以參考GB 5009.211-2014，也可以根據(jù)樣品中葉酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，增加或減少標(biāo)準(zhǔn)曲線點數(shù)量的設(shè)置，擴大或縮小標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍。

微生物法不同于一般的化學(xué)方法，只有在葉酸達(dá)到一定量后，才能刺激鼠李糖乳桿菌的生長并得到線性的生長響應(yīng)，所以檢出限的確定主要考慮標(biāo)準(zhǔn)曲線的最低響應(yīng)值。在本方法中，葉酸的量大于0.005 ng可以被穩(wěn)定檢出，但當(dāng)樣品中葉酸的量低于0.005 ng時無法外推預(yù)估，因此僅能以最低標(biāo)準(zhǔn)點進(jìn)行計算；葉酸的量在0.01～0.08 ng之間時能保證3個樣品管的葉酸質(zhì)量濃度有兩個在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)；本方法主要針對嬰幼兒配方乳粉，其添加的葉酸為強化葉酸，不需要考慮原生葉酸及酶源酶空白葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以奶粉稱樣量0.5 g計算，檢出限和定量限分別為

圖1 EP管法標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.7 加標(biāo)回收率

配制質(zhì)量濃度為100 ng/mL的葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，以葉酸質(zhì)控樣品作為實驗樣品，分別稱取4次0.3 g的試驗樣品，各加入0,0.5,1.0,2.0 mL上述葉酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，則所加入的葉酸的量分別為0，50，100，200 ng；將實驗樣品和葉酸標(biāo)準(zhǔn)品稀釋定容至100 mL，按EP管法步驟進(jìn)行3次測試，結(jié)果如表3所示。加標(biāo)回收率=（加標(biāo)樣品測定量-樣品本底測定量）/加入標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的量×100%，其范圍為98.0%～107.5%,根據(jù)GB/T 27404-2008的要求，EP管法加標(biāo)回收率符合要求。

表3 EP管法加標(biāo)回收率實試驗結(jié)果

2.8 重復(fù)性實驗

分別對質(zhì)控樣品和3種不同品牌的市售奶粉進(jìn)行檢測，每個樣品做6次平行對照，實驗結(jié)果如表4所示，分別計算各樣品的RSD值，葉酸質(zhì)控樣品的RSD值為4.7%，3個市售奶粉的RSD值在7.8%～9.2%之間，說明本方法的重復(fù)性良好。

表4 EP管法的重復(fù)性試驗結(jié)果 μg/100g

2.9 不同稀釋倍數(shù)對測量值的影響

稱取質(zhì)控樣品，采取四個不同的稀釋倍數(shù)，每個稀釋倍數(shù)做兩組平行進(jìn)行檢測，結(jié)果如表5所示。分析不同稀釋倍數(shù)下的檢測結(jié)果的波動范圍，結(jié)果表明在不同的稀釋倍數(shù)下，測定結(jié)果較為穩(wěn)定，測量值均在可接受的范圍內(nèi)。

2.10 EP管法和國標(biāo)法的比較

稱取質(zhì)控樣品和3種市售奶粉，國標(biāo)法按照GB5009.211-2014進(jìn)行檢測，按照2.7的要求設(shè)置加標(biāo)回收實驗，分別計算回收率，檢測結(jié)果如表6所示。

表5 不同稀釋倍數(shù)下QC-IP-016葉酸質(zhì)量分?jǐn)?shù) μg/100g

表6 EP管法和國標(biāo)試管法檢測結(jié)果 μg/100g

2.11 試劑的穩(wěn)定性

將含甘油的工作菌液，葉酸標(biāo)準(zhǔn)工作液和質(zhì)控樣品過濾液分裝于EP管中，-20℃保存，第一個月每兩周測量一次，以后每個月測量1次，連續(xù)6個月，測定結(jié)果見表7,試驗結(jié)果表明-20℃保存條件下關(guān)鍵試劑的穩(wěn)定性良好。試劑的穩(wěn)定性提示我們，工作菌液、標(biāo)準(zhǔn)工作液和質(zhì)控樣品稀釋液可以一次配制，分裝冷凍保存，按需取用，這將大大縮減試驗時間。

表7 QC-IP-016試劑穩(wěn)定性評估實試驗 μg/100g

3 結(jié)論

EP管法，試管法和微孔板法都采用微生物法的原理測定葉酸，但這3種方法又具有各自的特點。試管法的方法設(shè)置嚴(yán)謹(jǐn)，思路清晰，但準(zhǔn)備工作較繁瑣，工作量大，難以應(yīng)對大批量的樣品檢驗；微孔板法操作簡便，應(yīng)用較成熟，但對于大批量樣品檢驗成本較高；而EP管法則融合了試管法和微孔板法的優(yōu)點，用EP管代替試管進(jìn)行培養(yǎng)，縮小了培養(yǎng)體積，采用凍存的工作菌株，可以縮短實驗的準(zhǔn)備時間，整體極大的提高了實驗的可操作性，有效縮短了檢驗周期，能適應(yīng)大批量的樣品檢驗工作。EP管法的檢出限達(dá)到0.1μg/100g，加標(biāo)回收率范圍為98.0%～107.5%，方法的重復(fù)性較好，且關(guān)鍵試劑（工作菌液、標(biāo)準(zhǔn)工作液和質(zhì)控樣品稀釋液）在-20℃保存條件下6個月內(nèi)穩(wěn)定性良好，具有微孔板法操作簡便的特點，但成本較微孔板法大大降低。EP管法不但適用于測定嬰幼兒配方乳粉中的葉酸，還可應(yīng)用于其他以微生物法原理為基礎(chǔ)測定的維生素，如泛酸，維生素B12，生物素，肌醇和煙酸，適合在各級常規(guī)實驗室推廣應(yīng)用。