馬潔，葛武鵬，趙麗麗，郗夢露，崔秀秀,郝果，王雨馨

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌712100；2.西安百躍羊乳集團(tuán)有限公司，西安710000；3.陜西省羊乳產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，陜西富平711700；4.陜西中檢檢測技術(shù)有限公司，西安710068）

0 引 言

分泌型免疫球蛋白A（secretory immunoglobulin A,sIgA）是外分泌液中的一種抗體，主要存在于乳汁和胃腸液等外分泌液中，是腸道黏膜免疫系統(tǒng)中主要的效應(yīng)因子，它區(qū)別于血清型免疫球蛋白A（immunoglobulin A,IgA）而被命名為sIgA[1-2]。sIgA可阻止腸道內(nèi)病原微生物黏附在黏膜表面，促進(jìn)吞噬細(xì)胞的吞噬作用，保護(hù)黏膜不受微生物的侵襲[3-4]。當(dāng)腸道中sIgA的含量減少時(shí)，會使腸道中產(chǎn)氣莢膜梭菌增加，致使嬰幼兒腸道免疫功能降低，腸道菌群失調(diào)[5]。研究發(fā)現(xiàn)，sIgA是嬰兒出生后最早獲得的免疫物質(zhì)，保護(hù)初生嬰幼兒免受病原微生物的感染，在維持嬰兒腸道的微生物穩(wěn)態(tài)和嬰兒腸道免疫功能方面具有重要意義[6]。嬰幼兒的免疫系統(tǒng)發(fā)育緩慢，自出生起的4-6月內(nèi)，新生兒消化道和呼吸道等防御病原微生物的免疫力主要來源于母乳中的sIgA[7]。相關(guān)研究證明母乳中的sIgA含量與喂養(yǎng)小孩的患病有相關(guān)性，較高的sIgA含量可被認(rèn)為是健康嬰兒的生物標(biāo)志物[8]。因此對母乳中sIgA含量的檢測，分析母乳的質(zhì)量尤為重要。出生6個(gè)月后，嬰幼兒的sIgA可由自身腸粘膜固有層的漿細(xì)胞合成，但合成能力不及成人一半[6,9]。母乳喂養(yǎng)雖然是嬰幼兒sIgA來源的重要保證，但受到社會、生理、心理、個(gè)人健康等因素的影響，我國純母乳喂養(yǎng)率仍然很低。據(jù)中國發(fā)展研究基金會于2019年發(fā)布的《中國母乳喂養(yǎng)影響因素調(diào)查報(bào)告》顯示，我國嬰兒6個(gè)月內(nèi)純母乳喂養(yǎng)率僅為29.2%，這對嬰幼兒免疫系統(tǒng)的形成與健康成長帶來隱憂，因此，嬰幼兒配方奶粉作為母乳替代品是千萬母嬰家庭的必然選擇。但喂養(yǎng)嬰幼兒配方奶粉是否能增加sIgA含量，改善嬰兒腸道免疫健康，以及針對不同分娩方式、出生月齡的嬰幼兒在喂養(yǎng)嬰配奶粉后，腸道健康又會有怎么樣的差異，目前還尚不清楚。

藉此，通過酶聯(lián)免疫分析法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）檢測樣品中的sIgA的含量，本研究依據(jù)簽署的道德協(xié)議，采用非損傷采樣法采集1-4月齡純母乳喂養(yǎng)嬰兒的健康乳母乳汁和對應(yīng)嬰兒糞便，探究不同階段純母乳喂養(yǎng)嬰兒，糞便和母乳（初乳、成熟乳）中sIgA含量變化關(guān)系，為預(yù)測新生兒感染性疾病的發(fā)生提供資料；采集不同月齡（0～6月齡、6～12月齡、12～36月齡），不同喂養(yǎng)方式（純母乳、混合、嬰配羊奶粉、嬰配牛奶粉）以及不同分娩方式（順產(chǎn)、剖宮產(chǎn)）下的健康嬰幼兒糞便，通過進(jìn)行差異分析，為嬰幼兒科學(xué)喂養(yǎng)奶粉配方優(yōu)化提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人分泌型免疫球蛋白A酶聯(lián)免疫分析試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司；氯化鉀（分析純）；氯化鈉（分析純）；磷酸二氫鉀（分析純）；磷酸氫二鈉（優(yōu)級純）。

ME303E型精密電子天平（0.001g），瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；VORTEX-5型旋渦混合器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司；HC-3018型高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；Rayto RT-6100酶標(biāo)分析儀，深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣本分組信息

母乳喂養(yǎng)定義為出生后只采用純母乳喂養(yǎng)，不添加任何母乳替代品；混合喂養(yǎng)定義為出生后因母乳不足由嬰配羊奶粉或牛奶粉補(bǔ)充喂養(yǎng)，且母乳占比約為50%；嬰配羊奶粉喂養(yǎng)（嬰配牛奶粉喂養(yǎng)）定義為出生后因無法母乳喂養(yǎng)而采用純嬰配羊奶粉喂養(yǎng)（嬰配牛奶粉喂養(yǎng)）。

1.2.2 樣本的采集

在陜西省楊凌示范區(qū)醫(yī)院采集孕期或哺乳期間無感染性疾病、代謝性疾病及其它惡性消耗性疾病的健康乳母的母乳；足月（＞37周）、正常體重（＞2 500 g）、一月內(nèi)無腹瀉、無胃腸道病史、未使用過任何抗生素類藥物的健康嬰幼兒。所有樣本采集時(shí)間為每月25號（±2 d）上午9～12點(diǎn)，樣本采集完成均先凍存于-18℃家用冰箱，后于2 h內(nèi)用冰盒冷鏈送至實(shí)驗(yàn)室，于-80℃冰箱中保存。

糞便樣本：當(dāng)嬰兒自然排便后，將新鮮糞便立即收集于無菌干凈的糞便采樣管中，采樣時(shí)取糞便中間，避免混入尿液或其他雜物，留取3～5 g于便采樣盒內(nèi)。其中試驗(yàn)共采集0～4月純母乳喂養(yǎng)的嬰兒對應(yīng)糞便樣本51份，樣品信息見表1。0～36月齡嬰兒糞便114份，詳細(xì)分組見表2。

表1 糞便樣本信息（份）

表2 嬰幼兒糞便樣本基本信息（個(gè)）

母乳樣本：采集純母乳喂養(yǎng)健康乳母1天至4個(gè)月的乳汁，采樣時(shí)，將乳房局部清潔后，直接將乳汁擠入50 mL消毒滅菌的試管中。共采集分娩后6 d內(nèi)初乳44份，1～4月的成熟乳46份。

表3 母乳樣本信息（份）

1.2.3 樣本的前處理

母乳樣本：吸取母乳樣本0.1 mL，按照10%的勻漿比例加入濃度為0.01 mol/L，p H=7.2～7.4的磷酸鹽緩沖液，然后以2 000～3 000 r/min離心20 min，棄上層脂質(zhì)和低層沉淀物，仔細(xì)收集中層乳清，-20℃冰柜保存待用。

糞便樣本：稱取糞便樣本0.2 g，按照10%的勻漿比例加入濃度為0.01 mol/L，p H=7.2～7.4的磷酸鹽緩沖液，用渦旋混合器震蕩10 min，使其充分混勻。2 000～3 000 r/min，離心20 min，收集上清。分裝后一份待檢測，其余-80℃冷凍備用。

1.2.4 樣本中sIgA含量的測定

采用ELISA，按照sIgA試劑盒說明書操作步驟，分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔和待測樣品孔，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程均以復(fù)孔操作，其中空白對照不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步驟操作相同。標(biāo)準(zhǔn)品孔準(zhǔn)確加入不同濃度梯度sIgA標(biāo)準(zhǔn)品50μL，待測樣品孔先加樣品稀釋液40μL，然后再加待測樣品10μL，輕輕晃動混勻；除空白孔外每孔加酶標(biāo)試劑100μL，用封板膜封板后置37℃溫育60 min；小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿20倍稀釋后洗滌液，靜置30 s后棄去，如此重復(fù)5次，拍干；每孔先加入顯色劑A 50μL，再加入顯色劑B 50μL，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min；每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)；以空白空調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。

1.2.5 樣本中的sIgA含量計(jì)算

測量不同濃度梯度的sIgA標(biāo)準(zhǔn)品相應(yīng)OD值，以O(shè)D值為橫軸，sIgA標(biāo)準(zhǔn)品為縱軸制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，根據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算糞便樣本對應(yīng)的OD值的sIgA濃度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用IBM SPASSStatistics 20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析；使用Origin 9作圖。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。方差齊性者組間比較采用方差分析，多重比較使用Duncan法進(jìn)行，P＜0.05為差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 sIgA的標(biāo)準(zhǔn)曲線

sIgA標(biāo)準(zhǔn)品按照濃度梯度進(jìn)行分析，以濃度與所對應(yīng)的OD值作圖，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1，標(biāo)準(zhǔn)品在各自濃度區(qū)間范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=29.68 x-1.587，相關(guān)系數(shù)R2值為0.998，表明線性關(guān)系良好。

圖1 sIgA的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 純母乳喂養(yǎng)的嬰兒中母乳和對應(yīng)糞便sIgA含量關(guān)系

2.2.1 初乳和糞便樣本sIgA含量關(guān)系

如表4所示，相同天數(shù)的條件下，初乳和對應(yīng)糞便中的sIgA含量差異極顯著（P＜0.01），且不同天數(shù)的初乳和糞便中的sIgA含量變化趨勢相同，表明初乳中sIgA對嬰兒糞便中的sIgA有顯著影響。

表4 1～6d初乳和糞便樣本中sIgA含量 μg·mL-1

2.2.2 成熟乳和糞便樣本sIgA含量關(guān)系

如表5所示，1～4月，母乳中的sIgA含量均極顯著高于純母乳喂養(yǎng)對應(yīng)的嬰幼兒糞便中sIgA含量（P＜0.01）；且隨著月齡的增加，母乳和糞便中的sIgA均呈現(xiàn)上升趨勢；母乳和糞便樣本中的sIgA含量在不同月齡間的差異性相同，4月齡的sIgA含量與2月齡、1月齡差異顯著，2月齡與3月齡sIgA含量差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果說明0～4月齡母乳中sIgA對嬰幼兒糞便中的sIgA有影響，母乳能為嬰幼兒提供大量的sIgA。

表5 1～4月母乳和糞便樣本中sIgA含量 μg·mL-1

2.2.3 月齡對母乳和糞便中sIgA含量的影響

如表6可得，初乳中的sIgA含量顯著高于成熟乳中的sIgA含量（P＜0.05），但1～6 d嬰幼兒糞便中的sIgA含量雖高于1～4月齡嬰幼兒的sIgA含量，但差異不顯著（P＞0.05）。這與王鳳英[10]等人之前的研究結(jié)果相似，表明母乳中sIgA的產(chǎn)生和分泌與嬰幼兒腸道中sIgA的產(chǎn)生和分解能力可能是相適應(yīng)的，使得嬰兒在自身的腸道免疫功能尚未成熟之前可以得到穩(wěn)定的免疫保護(hù)。

表6 母乳和糞便樣本在不同時(shí)間段的sIgA含量 μg·mL-1

2.3 分娩方式對嬰幼兒糞便中sIgA含量的影響

其中“*”表示分娩方式組間差異顯著，P＜0.05；“**”表示組間差異極顯著，P＜0.01。

由圖2可知，在0～36月齡范圍內(nèi)，不同喂養(yǎng)方式下的順產(chǎn)嬰幼兒糞便中的sIgA含量與剖宮產(chǎn)嬰兒的差異顯著。在0～6月齡時(shí)，純母乳、混合、嬰配羊奶粉喂養(yǎng)組順產(chǎn)嬰兒的sIgA顯著高于同組剖宮產(chǎn)嬰兒（P＜0.01）。在6～12月齡時(shí)，純母乳、混合、嬰配牛奶粉喂養(yǎng)組順產(chǎn)嬰兒的sIgA顯著高于同組剖宮產(chǎn)嬰幼兒（P＜0.05）。12～36月齡時(shí)，嬰配羊奶粉、嬰配牛奶粉喂養(yǎng)組順產(chǎn)嬰兒的sIgA含量均顯著高于同組剖宮產(chǎn)嬰兒組（P＜0.01）。結(jié)果說明在0～36月齡內(nèi)，順產(chǎn)嬰兒的腸道健康要優(yōu)于剖宮產(chǎn)嬰幼兒的腸道，這可能是由順產(chǎn)嬰兒與剖宮產(chǎn)嬰兒腸道菌群組成差異引起的。已有研究證實(shí)，定殖在嬰幼兒腸道中的早期微生物會受分娩方式的影響[11-12]。順產(chǎn)嬰兒腸道中內(nèi)富含雙歧桿菌、埃希氏菌和擬桿菌等，剖宮產(chǎn)嬰兒則有較多的腸球菌和腸桿菌等[13-14]。其中，雙歧桿菌具有促進(jìn)嬰幼兒腸道sIgA分泌的作用[15-16]。另外，分娩方式也可通過影響母乳中sIgA的含量，影響嬰幼兒腸道內(nèi)sIgA的含量。Shao等人[14]研究發(fā)現(xiàn)，順產(chǎn)組的初乳中sIgA含量顯著高于剖宮產(chǎn)組。由此可知，順產(chǎn)組嬰兒糞便中sIgA含量高于剖宮產(chǎn)喂養(yǎng)組，可能是剖宮產(chǎn)會破壞雙歧桿菌在母嬰間的傳遞，引起新生兒的腸道菌群失衡，或是通過降低母乳中的sIgA含量，造成嬰幼兒腸道中sIgA的含量降低。

2.4 喂養(yǎng)方式對嬰幼兒糞便中sIgA含量的影響

如表7所示，0～12月齡時(shí)，在分娩方式相同且同月齡的嬰幼兒中，純母乳喂養(yǎng)組嬰幼兒sIgA含量較高，顯著高于嬰配牛奶粉和羊奶粉喂養(yǎng)的嬰幼兒（P＜0.05），結(jié)果與Hua[17]和Bakker-Zierikzee[18]的研究結(jié)果是一致的，這可能因?yàn)樵?～12月齡內(nèi)，嬰兒自身合成sIgA的能力較弱，主要依靠母乳攝入。母乳喂養(yǎng)組嬰幼兒sIgA含量和混合喂養(yǎng)組無顯著差異（P＞0.05）；嬰配羊奶粉、嬰配牛奶粉喂養(yǎng)組sIgA水平顯著低于混合喂養(yǎng)組（P＜0.05），這可能是嬰幼兒糞便中sIgA含量與母乳喂養(yǎng)量呈正相關(guān)[5]。母乳中sIgA可進(jìn)入新生兒及嬰兒胃腸道，防止病原微生物的侵入，保護(hù)嬰兒胃腸道免受感染[19]。母乳喂養(yǎng)的嬰幼兒腸道中雙歧桿菌數(shù)量較高[20]，可促進(jìn)兒童腸道sIgA分泌。而且母乳能促使嬰兒局部免疫系統(tǒng)發(fā)育成熟，增加?jì)雰鹤陨砟c道sIgA的產(chǎn)生[21]。說明，在0～12月齡內(nèi)，母乳喂養(yǎng)對嬰兒腸道健康更重要。

表7 不同喂養(yǎng)方式對嬰幼兒糞便中sIgA含量的影響

0～36月齡內(nèi)，嬰配羊奶粉喂養(yǎng)組的嬰幼兒糞便中sIgA含量均顯著高于嬰配牛奶粉喂養(yǎng)組（P＜0.05）。這一結(jié)果與楊莉[22]和王逸斌[23]研究證實(shí)的嬰配羊奶粉對嬰兒健康成長有一定促進(jìn)作用的結(jié)果一致。相關(guān)研究證明羊乳具有低致敏性和高營養(yǎng)價(jià)值的特點(diǎn)，更適合作為嬰幼兒配方奶粉的原料[24-27]，與本研究嬰配羊奶粉喂養(yǎng)的嬰兒sIgA含量是高于嬰配牛奶粉的結(jié)果相符。

2.5 月齡對嬰幼兒糞便中sIgA含量的影響

圖3 不同月齡對嬰幼兒糞便中sIgA含量的影響

如圖3可知，不同喂養(yǎng)方式下，隨著月齡的增長，嬰幼兒糞便中的sIgA含量呈遞增趨勢。其中，嬰配羊奶粉順產(chǎn)組0～6月、6～12月和12～36月的sIgA含量顯著增加（P＜0.01），剖宮產(chǎn)組0～6月到6～12月的sIgA含量顯著增加（P＜0.01），但6～12月和12～36月剖宮產(chǎn)嬰幼兒的sIgA含量增加不顯著（圖3a）。嬰配牛奶粉順產(chǎn)組0～6月、6～12月和12～36月的sIgA含量增加顯著（P＜0.01），剖宮產(chǎn)組0～6月到6～12月的sIgA含量增加不顯著（P＞0.05），但6～12月到12～36月增加顯著（P＜0.01）（圖3b）。純母乳喂養(yǎng)組、混合剖宮產(chǎn)喂養(yǎng)組在0～6月到6～12月的sIgA含量增加顯著（P＜0.01），混合順產(chǎn)嬰兒的sIgA含量在0～6月到6～12月增加顯著（P＜0.05）（圖3c、3d）。隨月齡的增長，純母乳喂養(yǎng)組、混合喂養(yǎng)組、嬰配羊奶粉喂養(yǎng)組和嬰配牛奶粉喂養(yǎng)組糞便的sIgA含量均出現(xiàn)了顯著遞增的趨勢，且12～36月齡喂養(yǎng)組嬰兒糞便中sIgA的含量顯著高于0～6月和6～12月的水平。有研究指出維生素C能促進(jìn)腸道sIgA含量的增加[5]。水果和蔬菜作為嬰幼兒12月以后最常見的輔食，是維生素C的主要食物來源[28]。因此，隨著月齡的增加，sIgA含量呈現(xiàn)上升的趨勢，是因?yàn)閶胗變弘S輔食的逐漸引入，飲食的種類趨向多樣化，攝入營養(yǎng)更加豐富，腸道微生物豐度差異變大，使得嬰兒腸道自身產(chǎn)生了大量的sIgA[29]。

3 結(jié)論

本研究通過酶聯(lián)免疫分析技術(shù)探討了不同月齡、喂養(yǎng)方式和分娩方式對嬰幼兒腸道內(nèi)sIgA含量的影響，評估嬰幼兒不同階段的免疫健康狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)：母乳在4個(gè)月內(nèi)能夠?yàn)閶胗變禾峁┐罅康膕IgA，母乳中的sIgA含量均極顯著高于對應(yīng)嬰幼兒糞便組的sIgA含量，不同時(shí)間的母乳和糞便中的sIgA含量有著相同的變化趨勢。0～36月齡，嬰幼兒順產(chǎn)組sIgA含量明顯高于剖宮產(chǎn)組；母乳喂養(yǎng)嬰幼兒sIgA含量最高，混合喂養(yǎng)組次之，嬰配羊奶粉喂養(yǎng)sIgA含量顯著高于嬰配牛奶粉喂養(yǎng)；隨著月齡增長，嬰幼兒糞便中的sIgA含量明顯呈現(xiàn)上升的趨勢。因此，為保證嬰幼兒的腸道免疫健康和科學(xué)合理喂養(yǎng)，嬰兒在出生時(shí)盡可能選擇順產(chǎn)，產(chǎn)后保持母乳喂養(yǎng)。本研究為嬰幼兒的科學(xué)喂養(yǎng)提供理論依據(jù)，為嬰幼兒的健康、免疫狀態(tài)的預(yù)判提供參考依據(jù)。