黃 曼， 于淑坤， 張 琳， 劉永勝， 苗 敏

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230601)

番茄是一種世界性經(jīng)濟(jì)作物，在果蔬供應(yīng)中占有舉足輕重的地位。但由于植物的固著性，容易受到各種生物和非生物脅迫的影響，尤其是病原微生物的攻擊對植物個體或群體造成的損傷較為嚴(yán)重。因此，植物在長期的進(jìn)化過程中形成了復(fù)雜的免疫機制，以抵御病原微生物的傷害，維持正常生長和發(fā)育[1]。

植物的免疫機制可以分為兩類：① 基礎(chǔ)抗性，是植物通過識別來自病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)或微生物相關(guān)分子模式(microbe-associated molecular pattrns,MAMPs)所引發(fā)的免疫反應(yīng)(PAMP-triggered immunity,PTI)，是植物抗性的基礎(chǔ)[2]；② 基因?qū)蚩剐?，是通過寄主的抗性基因(R)識別病原體的無毒性基因(avr)引發(fā)的，如病原體效應(yīng)因子引發(fā)的免疫反應(yīng)(effector-triggered immunity,ETI)[3]，往往伴隨著細(xì)胞程序性死亡或過敏反應(yīng)，是一種更加劇烈和有效的防御反應(yīng)[4]。

ETI系統(tǒng)所產(chǎn)生的免疫受體都是由抗病R基因編碼產(chǎn)生的，多數(shù)R基因由核苷酸結(jié)合位點(nucleotide-binding site，NBS)結(jié)構(gòu)域和富含亮氨酸重復(fù)序列(leucine-rich repeat,LRR)結(jié)構(gòu)域組成[5-7]。根據(jù)N端的信號肽的不同，將NBS-LRR基因劃分為2種結(jié)構(gòu):一種類型包括TIR(Toll/白細(xì)胞介素-1受體類似結(jié)構(gòu))，形成結(jié)構(gòu)TIR-NBS-LRR；另一種類型包括編碼卷曲螺旋(coiled-coil,CC)結(jié)構(gòu)，形成CC-NBS-LRR結(jié)構(gòu)[8]。

本文發(fā)現(xiàn)了番茄中的一個典型抗性基因，命名為SlNBRP1，以SlNBRP1基因的編碼序列為靶標(biāo)，構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-35S::SlNBRP1，并利用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將重組基因轉(zhuǎn)化到野生型番茄中，得到共抑制(co-suppression,CoR)轉(zhuǎn)基因陽性植株。

通過在番茄幼苗上接種丁香假單胞菌番茄致病變種Pst DC3000，觀察番茄植株病斑擴展與細(xì)菌生長狀況，計算相同位置葉片1 cm2的菌落數(shù)。比較發(fā)現(xiàn)，共抑制轉(zhuǎn)基因苗與野生型植株的差異較明顯，表現(xiàn)出對病原菌的高度敏感，對病原菌的繁殖抑制作用降低，從而發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植株SlNBRP1 CoR削弱了番茄抗病性，是番茄免疫反應(yīng)的正向調(diào)控因子。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型番茄(SolanumLycopersicumMill. cv. Aillsa Craig)，由美國康奈爾大學(xué)THOMPSON植物研究所提供，后由本實驗室繁衍保存。

限制性內(nèi)切酶、Taq酶、高保真Pfu DNA polymerase、T4 DNA Ligase、pEASY Blunt Simple載體購自TaKaRa公司；TRIZOL購自Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TOYOBO公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega公司；引物由上海生工技術(shù)有限公司合成，測序由上海生工技術(shù)有限公司完成；植物組織培養(yǎng)試劑購自Sigma公司；其他試劑均為國藥國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

大腸桿菌(Escheriachiacoli) DH5α、根瘤農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHAl05、丁香假單胞桿菌(PstDC3000)、植物表達(dá)載體pBI121、pBTEX、植物綠色熒光蛋白融合表達(dá)載體pART27-GFP均由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 基因在番茄中的組織差異性表達(dá)

從野生型番茄幼苗的根、莖、葉、花、不同發(fā)育時期的果實中提取總RNA，通過反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以這些cDNA為模板，以番茄UBI3基因作為內(nèi)參基因(GenBank登錄號：X58253)，利用實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chainreaction，PCR)的方法分析不同組織中SlNBRP1基因的表達(dá)情況。反應(yīng)條件為：94 ℃ 30 s,94 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，42個循環(huán)。采用Step One Real-time PCR儀(AB Applied Biosystems)進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，基因相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt計算方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.2SlNBRP1目的基因的克隆

根據(jù)番茄SlNBRP1基因序列(SGN登錄號：Solyc05g008070.2.1)設(shè)計引物NBRP1-F1、NBRP1-R1、NBRP1-F2、NBRP1-R2，見表1所列，利用巢式PCR擴增SlNBRP1基因全長編碼序列。反應(yīng)條件為：94 ℃ 2 min，51 ℃ 20 s，72 ℃ 160 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min，獲取目的基因PCR產(chǎn)物。

表1 用于擴增SlNBRP1基因的PCR引物

1.2.3SlNBRP1基因過量表達(dá)載體的構(gòu)建

以pBI121為植物表達(dá)載體，通過插入其多克隆位點區(qū)域構(gòu)建SlNBRP1過量表達(dá)載體。用SmaⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶處理植物表達(dá)載體pBI121和基因SlNBRP1，利用T4連接酶連接并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取重組質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定陽性克隆[9]。將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒命名為pBI121-35S::SlNBRP1，構(gòu)建流程示意圖如圖1所示。

圖1 植物表達(dá)載體pBI121-35S::SlNBRP1示意圖

1.2.4 SlNBRP1蛋白的亞細(xì)胞定位

將SlNBRP1基因的編碼序列構(gòu)建到含有增強綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)編碼序列的載體上。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)得煙草瞬時表達(dá)系統(tǒng)，在35S啟動子的作用下，編碼出有活性的SlNBRP1-eGFP融合蛋白，通過激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞中綠色熒光的位置，進(jìn)而確定SlNBRP1蛋白的亞細(xì)胞定位。

1.2.5 番茄的遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株陽性鑒定

將獲得的重組質(zhì)粒pBI121-35S::SlNBRP1通過凍融法轉(zhuǎn)化導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105菌株中[10]，番茄轉(zhuǎn)化通過葉盤法進(jìn)行[11]。獲得轉(zhuǎn)基因番茄植株后，利用CTAB法提取基因組DNA。pBI121載體中的卡那霉素抗性基因NPTⅡ(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ，GenBank登錄號：AF485783)為篩選標(biāo)記，設(shè)計引物見表1所列。PCR陽性鑒定擴增反應(yīng)過程為：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s,30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。待陽性幼苗的根生長健全后移入田間栽培。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因植株的實時熒光定量PCR分析

按照1.2.1所述方法，提取野生型和轉(zhuǎn)基因番茄植株T1代幼葉的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到第1條cDNA。以番茄UBI3為內(nèi)參基因(GenBank 登錄號:X58253)，根據(jù)表1所示的引物UBI3-F和UBI3-R以及NBRP1-qF和NBRP1-qR進(jìn)行實時熒光定量PCR分析。

1.2.7 病原菌PstDC3000的抗病性分析

病原菌PstDC3000侵染誘導(dǎo)表型按文獻(xiàn)[12]方法培養(yǎng)PstDC3000，低速離心收集菌體，用含10 mmol/LMgCl2的緩沖液稀釋至OD600=0.000 01。挑選生長6周左右生長環(huán)境相同、長勢良好的野生型和轉(zhuǎn)基因植株，用真空滲透法[13]將稀釋后的菌液分別注入番茄植株內(nèi)，每個株系3個重復(fù)。按文獻(xiàn)[14]方法取樣，計算出單位面積葉片上PstDC3000菌落數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 SlNBRP1基因生物信息學(xué)分析

SlNBRP1基因的編碼區(qū)全長為2 511 bp，位于番茄8號染色體上，分別以ATG和TGA為起始和終止密碼子，SlNBRP1基因編碼836個氨基酸，相對分子質(zhì)量為207 279.72，理論等電點為4.94。推測半衰期大于20 h，不穩(wěn)定參數(shù)為35.09，屬于穩(wěn)定蛋白，蛋白質(zhì)的親水性平均數(shù)為0.705，表明SlNBRP1屬于疏水性蛋白。脂肪指數(shù)為32.62。SlNBRP1蛋白的結(jié)構(gòu)域分析如圖2所示，其編碼序列包含CC和NBS2個保守結(jié)構(gòu)域，2個結(jié)構(gòu)域均與植物抗病有關(guān)。

圖2 SlNBRP1蛋白結(jié)構(gòu)域分析

2.2 SlNBRP1基因表達(dá)的組織特異性分析

利用實時熒光定量 PCR儀分析SlNBRP1基因在不同組織中的表達(dá)量差異如圖3所示，由圖3可知，SlNBRP1基因在多數(shù)組織中均有表達(dá)，在番茄根、莖和紅果中的表達(dá)量較低，在變色期的果實中表達(dá)量最高，在花中的表達(dá)量次之。

圖3 SlNBRP1基因的表達(dá)模式分析

2.3 SlNBRP1蛋白的亞細(xì)胞定位分析

構(gòu)建pART27-SlNBRP1-GFP融合表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV2260感受態(tài)細(xì)胞，將構(gòu)建好的載體通過注射介導(dǎo)在煙草中進(jìn)行瞬時表達(dá)。36 h后，取被注射區(qū)域的葉片下表皮細(xì)胞在激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行綠色熒光的觀察，同時，用DAPI對細(xì)胞核進(jìn)行染色，從而確定細(xì)胞核位置，SlNBRP1蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)中，如圖4所示。

圖4 SlNBRP1蛋白的亞細(xì)胞定位

2.4 轉(zhuǎn)基因植株的分子水平鑒定

利用實時熒光定量 PCR的方法，分析轉(zhuǎn)基因植株葉片中SlNBRP1的表達(dá)水平。提取野生型和6個獨立轉(zhuǎn)基因植株的葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以此為模板進(jìn)行實時熒光定量PCR分析,結(jié)果如圖5所示，圖5中，轉(zhuǎn)基因株系與野生型株系有顯著差異，**P<0.01，***P<0.001，下同。從圖5可以看出，轉(zhuǎn)基因植株中3個獨立株系(CoR-1、CoR-2和CoR-3)SlNBRP1基因的表達(dá)量相對野生型植株在53%～75%范圍內(nèi)下調(diào)，初步判斷轉(zhuǎn)基因植株中出現(xiàn)了共抑制現(xiàn)象。

圖5 轉(zhuǎn)基因株系中SlNBRP1基因表達(dá)水平分析

2.5 轉(zhuǎn)基因植株對Pst DC3000的抗病響應(yīng)

為了研究SlNBRP1在番茄抗病防御過程中的作用，用相對低濃度(OD600=0.000 01)的PstDC3000滲透野生型植株與轉(zhuǎn)基因植株，觀察侵染后第2天和第4天植株的表型及葉片中細(xì)菌的生長情況，如圖6所示。由圖6可知，轉(zhuǎn)基因株系葉片病斑性狀比野生型更嚴(yán)重，說明SlNBRP1對PstDC3000具有一定的抵抗作用。

圖6 番茄植株接菌發(fā)病情況

2.6 轉(zhuǎn)基因植株菌落數(shù)量差異

按照1.2.8所述方法，統(tǒng)計野生型與轉(zhuǎn)基因株系經(jīng)PstDC3000菌液侵染2～4 d后葉片中的菌落數(shù)目如圖7所示，由圖7可知，轉(zhuǎn)基因型植株與野生型相比，葉片菌落數(shù)顯著增多，轉(zhuǎn)基因株系菌落數(shù)與野生型株系菌落數(shù)差異顯著。

圖7 菌落數(shù)差異分析

3 討 論

植物病害是造成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)巨大損失的原因之一，因此在農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展中，合理有效地治理植物病害至關(guān)重要。目前，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，對植物病害的防治主要依賴于化學(xué)藥劑，這不僅會帶來食品安全問題，也會造成病原物抗性問題和環(huán)保問題。在育種中開發(fā)利用植物本身的抗病性可以有效解決病害問題。

本文通過采用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將含有CC-NBS結(jié)構(gòu)域的SlNBRP1轉(zhuǎn)化到野生型的愈傷組織中，得到轉(zhuǎn)基因番茄，結(jié)合定量分析判斷轉(zhuǎn)基因植株中出現(xiàn)共抑制現(xiàn)象，通過接種一定濃度的PstDC3000菌液發(fā)現(xiàn)共抑制轉(zhuǎn)基因植物比野生型在一定程度上減弱了抗病能力。因此初步推斷SlNBRP1在番茄的抗病防御過程中起正調(diào)控作用。探索R基因為揭示植物抗病機制奠定了重要的基礎(chǔ)，通過利用R基因可以改進(jìn)抗病育種、減少植物因病害造成的減產(chǎn)或劣質(zhì)，從而實現(xiàn)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。本文通過基因工程技術(shù)增強了番茄抗病性，提供了抗病分子靶標(biāo)，提高了番茄種植的經(jīng)濟(jì)價值。隨著生物技術(shù)的飛速發(fā)展，學(xué)科之間的交叉滲透，依據(jù)植物病理學(xué)和分子生物學(xué)的原理，越來越多的R基因?qū)⒈豢寺?，人類對植物病害的認(rèn)識和防治必將有跨越式的進(jìn)步。