向 俊

(湖南省食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410111)

磺胺類藥物(SAs)價(jià)廉易得、抗菌力強(qiáng)且能迅速完全吸收，因而在畜牧業(yè)及獸醫(yī)臨床畜禽細(xì)菌性疾病的預(yù)防與治療中得到廣泛應(yīng)用。然而，磺胺類藥物會(huì)在體內(nèi)存在較長(zhǎng)的代謝時(shí)間，易蓄積在人體內(nèi)，一旦超出某個(gè)值的蓄積濃度，就會(huì)危害人體健康。長(zhǎng)時(shí)間小劑量或短時(shí)間大劑量蓄積，會(huì)引發(fā)慢性或急性中毒，導(dǎo)致機(jī)體免疫、泌尿系統(tǒng)受到影響，對(duì)肌肉、甲狀腺及腎臟等組織產(chǎn)生損害。本文選擇UPLC-MS/MS法，對(duì)畜禽肉內(nèi)8種SAs殘留同時(shí)進(jìn)行了測(cè)定。

1 試驗(yàn)材料

1.1 材料

WatersXevo TQ-S超高效液相色譜——串聯(lián)質(zhì)譜儀；TTL-DCⅡ氮吹儀；T18均質(zhì)機(jī)；Allegra 64R高速冷凍離心機(jī)；Milli-Q超純水系統(tǒng)[1]。

8種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)品：磺胺醋酰(STD)、磺胺甲噻二唑(STZ)、磺胺二甲異惡唑(SIX)、磺胺氯噠嗪(SCP)、磺胺嘧啶(SDZ)、磺胺甲基異惡唑(SMZ)、磺胺噻唑(ST)、磺胺甲基嘧啶(SMR)(純度≥99%)。異丙醇、無水硫酸鈉(分析純)；正己烷、乙腈、乙酸銨(色譜純)；650℃環(huán)境下灼燒無水硫酸鈉，持續(xù)4h，轉(zhuǎn)至干燥器備用。實(shí)驗(yàn)室用水為Milli-Q超純水。

豬肉、牛肉、羊肉、雞肉(當(dāng)?shù)厥袌?chǎng)購買)。

1.2 儀器條件

色譜分析條件：Waters BEH-C18色譜柱，2.1mm×100mm，1.7μm；乙腈為A相，pH=7.0、10mmol·L-1的乙酸銨水溶液為B相，柱溫35℃、流速0.4mL·min-1、進(jìn)樣體積10μL；梯度洗脫程序，0～5.0min—95%～85%B，5.0～7.0min—85%～45%B，7.0～7.5min—45%～95%B，10min—95%B。

質(zhì)譜分析條件：電噴霧電離ESI(+)(離子源)，接口電壓3.5kV，溫度120℃；電子倍增電壓650V；脫溶劑氣溫度350℃；霧化氣，氮?dú)?00L·min-1；碰撞氣，氬氣；掃描模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

配制1mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：在多個(gè)10mL容量瓶?jī)?nèi)分別放入精確量取的8種SAs標(biāo)準(zhǔn)品各10.00mg，用甲醇定容至刻度，保存至冰箱(-20℃)。

配制1μg·mL-1的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液：在同一容量瓶?jī)?nèi)放入適量的上述儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋后，保存至冰箱(4℃)。

2.2 樣品前處理

動(dòng)物組織在均質(zhì)機(jī)內(nèi)均勻化絞碎后，精確稱取5.00g放入塑料離心管(50mL)內(nèi)，按先后順序加入無水硫酸鈉20g、乙腈20mL，經(jīng)渦旋混勻后超聲提取30min，隨后進(jìn)行離心，8000r·min-1，10min。收集上清液，轉(zhuǎn)入雞心瓶(150mL)，殘?jiān)?0mL乙腈(無水硫酸鈉除水)清洗，收集上清液，轉(zhuǎn)入雞心瓶。將提取液合并，移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器內(nèi)，在水浴(50℃)條件下濃縮，約1mL時(shí)放入離心管(10mL)。雞心瓶?jī)?nèi)的殘?jiān)?mL乙腈溶解后，轉(zhuǎn)至離心管內(nèi)合并，吹干有機(jī)相(40℃氮?dú)獗Ｗo(hù))。加入1mL初始流動(dòng)相，渦旋1min后溶解殘?jiān)?。乙腈飽和正己?mL充分渦旋，復(fù)溶液重復(fù)1～2次萃取，將脂肪去除。將上層有機(jī)相摒棄，下層清液過濾(濾膜：0.22μm)，待測(cè)。

3 結(jié)果與分析

3.1 質(zhì)譜條件確定

采取流動(dòng)注射方式，于正離子模式下將8種100mg·L-1濃度的磺胺類藥物進(jìn)行質(zhì)樸參數(shù)調(diào)諧優(yōu)化。掃描各種化合物母離子，將分子離子確定后，手動(dòng)進(jìn)行錐孔電壓的調(diào)節(jié)，得到不同目標(biāo)物在響應(yīng)值最大的條件下所對(duì)應(yīng)的錐孔電壓值[2]。以此為基礎(chǔ)對(duì)子離子碰撞能量進(jìn)行優(yōu)化，通過調(diào)節(jié)子離子質(zhì)譜信號(hào)豐度，得到子離子碰撞最佳電壓，干擾偏低、豐度較強(qiáng)的子離子作為定量定性離子。

3.2 色譜條件確定

SAs含有弱堿性氨基，所以對(duì)流動(dòng)相pH值調(diào)節(jié)，可對(duì)弱堿離解發(fā)揮抑制作用，改變保留時(shí)間。鑒于pH>5的磺胺類藥物會(huì)有負(fù)電荷，選擇pH值為7.0的固定流動(dòng)相乙酸鈉水溶液。通過試驗(yàn)結(jié)果得知，11min內(nèi)，8種磺胺類藥物分離完全，保留時(shí)間重現(xiàn)性良好，且具有理想峰型。

3.3 方法線性范圍及檢出限

通過空白基質(zhì)加標(biāo)制備混合標(biāo)準(zhǔn)溶液方式的應(yīng)用，可在一定程度上弱化離子化基質(zhì)效應(yīng)，有利于定量結(jié)果準(zhǔn)確性的提高。精確稱取5.00g陰性樣品共6份，提取方法按照上述處理方法進(jìn)行，獲取空白基質(zhì)液，配制濃度不同的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別為5ng·mL-1、10ng·mL-1、20ng·mL-1、80ng·mL-1、100ng·mL-1，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，橫坐標(biāo)為SAs濃度，峰面積則為縱坐標(biāo)，取得線性回歸方程，根據(jù)表1得知，該方法在5～100ng·mL-1范圍內(nèi)，線性關(guān)系較好。在空白樣品內(nèi)依次加入8種SAs標(biāo)準(zhǔn)溶液，得知該方法目標(biāo)物的檢出限和定量限分別為2μg·kg-1、5μg·kg-1。

3.4 方法回收率與精密度

表1 8種磺胺類藥物殘留檢測(cè)方法線性范圍及檢出限

在空白基質(zhì)內(nèi)分別將8種SAs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液加入，執(zhí)行2.2中樣品前處理方法后，實(shí)施添加回收率及精密度試驗(yàn)，對(duì)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差進(jìn)行計(jì)算[3]。根據(jù)表2數(shù)據(jù)得知，8種磺胺類藥物在添加水平為10μg·kg-1、20μg·kg-1、100μg·kg-1時(shí)，分別得到84.0%～114.2%和0.73%～7.96%的平均回收率與RSD。

3.5 實(shí)際樣品測(cè)定

對(duì)本地市場(chǎng)購買的雞肉、豬肉、羊肉及牛肉進(jìn)行抽檢，實(shí)際樣品內(nèi)并未檢測(cè)出殘留磺胺類藥物[4]。為對(duì)方法適用性加以驗(yàn)證，實(shí)施加標(biāo)試驗(yàn)測(cè)定，試驗(yàn)對(duì)象為雞肉、羊肉及牛肉，回收率不低于80%。

表2 空白基質(zhì)中8種磺胺類藥物添加回收率及精密度(n=6)

4 結(jié)論

超高效液相色譜——串聯(lián)質(zhì)譜法為一種靈敏快速、準(zhǔn)確度高、分離范圍廣的檢測(cè)方法，其對(duì)樣品的要求較低，對(duì)化合物結(jié)構(gòu)破壞小，適用有機(jī)分子和生物分子的分離。由于獸藥殘留的多樣化及其復(fù)雜程度，檢測(cè)獸藥殘留不僅限于一種藥物殘留的監(jiān)測(cè)，單類監(jiān)測(cè)獸藥殘留具有效率低、耗時(shí)長(zhǎng)的缺點(diǎn)，因此超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法被廣泛應(yīng)用于獸藥的檢測(cè)中。

本實(shí)驗(yàn)中，經(jīng)乙腈提取、濃縮后的樣品，正己烷脫脂下用電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜展開測(cè)定。通過檢測(cè)結(jié)果得知，該方法前處理簡(jiǎn)單，檢出限低，具有較好的重現(xiàn)性，在畜禽肉磺胺類藥物殘留測(cè)定中，可最大限度滿足實(shí)際工作需求。