于 博，王吉喆，孫 東

(大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 耳鼻喉科教研室，遼寧 大連 116027)

慢性鼻竇炎并發(fā)鼻息肉是臨床上常見的鼻科疾病，多見于成年人，好發(fā)于上頜竇，篩竇，中鼻道等部位，特別是后鼻孔息肉，多來自于上頜竇，經(jīng)上頜竇自然開口而墜入后鼻孔[1]。其病理表現(xiàn)為鼻黏膜長期慢性炎癥或鼻竇膿性分泌物經(jīng)常刺激，鼻黏膜增生，充血，腫脹，靜脈淤血，滲出增加，加之細(xì)菌毒素的作用，促使小血管滲出增加及黏膜水腫加重，久而發(fā)生鼻息肉變[2]。

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)作為一種高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的因子，具有促進(jìn)血管通透性增加、細(xì)胞外基質(zhì)變性、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖和血管形成等作用[3]。VEGF參與許多血管生成依賴性疾病的發(fā)展及其進(jìn)展，包括息肉，癌癥，某些炎癥疾病等。

研究發(fā)現(xiàn)鼻息肉阻塞上頜竇自然口后，造成上頜竇內(nèi)存在多種病理性環(huán)境，包括低氧，內(nèi)毒素，各種細(xì)胞因子等，都可對VEGF增高及鼻息肉形成有促進(jìn)作用[4]，其中低氧作為其中最主要的一種病理環(huán)境，對VEGF的增生刺激尤為明顯。但是病理狀態(tài)下上頜竇內(nèi)的低氧環(huán)境具體氧分壓數(shù)值一直以來鮮有明確研究，本文針對臨床上慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者群，測出上頜竇內(nèi)低氧壓力平均值，結(jié)合基礎(chǔ)實驗方法，分離出鼻息肉內(nèi)纖維原細(xì)胞，體外模擬鼻竇內(nèi)低氧環(huán)境，研究低氧對纖維原細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2015年3月至2019年3月在大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院耳鼻喉科門診診斷慢性鼻竇炎伴鼻息肉并進(jìn)行了鼻竇穿刺治療的患者16例。其中男11例，女5例，年齡17～62歲,平均年齡(48.19±9.42)歲。患者慢性鼻竇炎臨床病史均超過1年，臨床保守藥物治療無明顯改善，患者近3個月內(nèi)無藥物治療，通過氧分壓測定儀得出鼻竇內(nèi)低氧的數(shù)據(jù)?；颊呤中g(shù)摘除鼻息肉，標(biāo)本均離體30 min內(nèi)送至實驗室，細(xì)切，至培養(yǎng)皿中培養(yǎng)原代成纖維細(xì)胞。16例患者中6例存在上頜竇內(nèi)積液，取6例患者的鼻腔分泌物、鼻竇內(nèi)積液和血漿，用ELISA試劑盒檢測上清液中VEGF蛋白濃度。本實驗涉標(biāo)本已告知患者本人，簽署知情同意書，并通過大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

使用JUHN-TYM-TAP吸引器(XOMED，Jacksonville，F(xiàn)L)從鼻孔中段采集鼻息肉。使用商用試劑盒(英國Biosource公司)通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)測定血管內(nèi)皮生長因子濃度，杜貝克培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)。

1.3 方 法

1.3.1 氧分壓的測定：16例慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者臨床結(jié)合鼻竇CT確診后，下鼻道局部表面麻醉，鼻竇穿刺針于下鼻甲附著處斜上方進(jìn)入上頜竇內(nèi)，氧分壓探針沿穿刺針管芯進(jìn)入鼻竇，測出鼻竇氧分壓數(shù)值。操作方法見示意圖1。

圖1 上頜竇穿刺模擬圖 Fig 1 Maxillary sinus puncture simulation

1.3.2 鼻竇積液、鼻涕、血漿的獲?。罕歉]積液獲?。捍┐提樳M(jìn)入上頜竇積液患者鼻竇后，負(fù)壓抽出竇內(nèi)分泌物；鼻腔分泌物獲取：鼻內(nèi)鏡下直達(dá)竇口鼻道復(fù)合體位置，采取液體標(biāo)本。血漿: 抽取靜脈血2 mL，EDTA紫管，離心，取上清液。

1.3.3 鼻息肉摘除手術(shù)：全麻鼻內(nèi)鏡手術(shù)下摘除鼻孔中段息肉樣腫物，經(jīng)病理確診為鼻息肉。

1.3.4 原代成纖維細(xì)胞提取及培養(yǎng)：用磷酸鹽生理鹽水徹底清洗鼻息肉標(biāo)本，切碎，并在95%空氣和5%二氧化碳的加濕環(huán)境下，在DMEM液中培養(yǎng)。用0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)提取成纖維原代細(xì)胞，在相同條件下分成兩個培養(yǎng)皿傳代，傳代5～6次。這些多重通道不影響成纖維細(xì)胞的功能和生存能力。在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)的原代成纖維細(xì)胞的性質(zhì)和純度。用臺盼藍(lán)排斥法測定細(xì)胞存活率，在實驗期間細(xì)胞存活率>95%。

1.3.5 ELISA檢測：DMEM全培養(yǎng)基(含10%FBS，雙抗)培養(yǎng)原代成纖維細(xì)胞于37 ℃，5%CO2孵箱4～5 d。胰酶消化后DMEM全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以1×103個/孔接種于96孔板。次日待細(xì)胞貼壁后，換用DMEM培養(yǎng)基(無10%FBS，無雙抗)。對照組繼續(xù)37 ℃，5%CO2培養(yǎng)，實驗組使用Gaspak袋(Becton公司)建立和維持缺氧培養(yǎng)條件；氧分壓(PO2)在40～60 mmHg范圍內(nèi)。各組分別培養(yǎng)5、10、20 h后，ELISA檢測VEGF水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，上頜竇內(nèi)氧分壓非正態(tài)分布，采用Md(P25，P75)表示。其余實驗結(jié)果均屬于計量資料，符合正態(tài)分布，用Mean±SD表示，組間比較采用t檢驗的方法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 上頜竇內(nèi)氧分壓及鼻腔分泌物、鼻竇積液、血漿中VEGF蛋白含量的測定

慢性鼻竇炎伴鼻息肉患者鼻竇氧分最低氧分壓30 mmHg左右，最高氧分壓73 mmHg左右，平均氧分壓47.74(36.72,56.84)mmHg。 ELISA結(jié)果顯示，6例存在上頜竇內(nèi)積液的患者的鼻腔分泌物中VEGF蛋白的含量明顯高于鼻腔分泌物和血漿(P<0.05，P<0.005)。見表1，圖2。

表1 上頜竇內(nèi)氧分壓及鼻腔分泌物、鼻竇積液、血漿中VEGF蛋白含量的測定

ND :鼻腔分泌物；SE :鼻竇積液；PLA :血漿。*P<0.05，** P<0.005圖2 鼻腔分泌物、鼻竇積液及血漿中VEGF蛋白的濃度Fig 2 Expression of vascular endothelial growth factor in sinus effusion,nasal discharge and plasma

2.2 低氧環(huán)境對鼻息肉內(nèi)纖維原細(xì)胞分泌VEGF產(chǎn)生的影響

ELISA結(jié)果顯示息肉內(nèi)提取的纖維原細(xì)胞在低氧環(huán)境下培養(yǎng)5 h產(chǎn)生的VEGF與普通氧分壓環(huán)境下無差異；而10、20 h產(chǎn)生的VEGF比普通氧分壓環(huán)境下明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

3 討 論

VEGF是最有效的促血管生成細(xì)胞因子之一，它在調(diào)節(jié)正常組織和致病組織的血管生成過程中起著重要作用，VEGF還在增加血管通透性，導(dǎo)致血管外滲出和水腫等方面發(fā)揮著病理作用。這些生理特征表明VEGF與慢性炎癥，如鼻息肉和慢性鼻竇炎黏膜水腫增生病理變化有關(guān)，在鼻竇黏膜和鼻息肉中，已知上皮細(xì)胞和炎性細(xì)胞，如巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和漿細(xì)胞，能產(chǎn)生血管內(nèi)皮生長因子。而我們實驗選擇的鼻息肉成纖維細(xì)胞，也是產(chǎn)生VEGF的重要來源[5]。本實驗通過ELISA和體外培養(yǎng)細(xì)胞研究，證明了在鼻腔和鼻竇內(nèi)膿汁中都存在大量的VEGF，表明VEGF在鼻腔和鼻竇黏膜中都有局部產(chǎn)生。其中鼻竇內(nèi)產(chǎn)生的VEGF數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他部位，這也側(cè)面證實了為什么鼻息肉多由上頜竇內(nèi)發(fā)生。

表2 在普通環(huán)境下及低氧環(huán)境中成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF含量比較

刺激VEGF增生的一個常見因素就是低氧環(huán)境，由于耳鼻喉科的特殊解剖特點，健康人上頜竇自然口正常狀態(tài)下與鼻道相通，上頜竇內(nèi)氧分壓與空氣中氧分壓大致相當(dāng)。當(dāng)鼻竇竇腔在特定病理條件下處于堵塞狀態(tài)，氧分壓必然低于常態(tài)。因此，我們首先確定了慢性鼻竇炎患者上頜竇內(nèi)一個重要病理因素，低氧環(huán)境[6]，并由此測定了臨床量化低氧分壓。而在體外模擬大致相同的低氧環(huán)境，并在此環(huán)境下培養(yǎng)纖維原細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)對比普通氧分壓狀態(tài)的培養(yǎng)基，低氧環(huán)境中纖維原細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF含量有統(tǒng)計學(xué)意義的增強(qiáng)。因而盡快解決鼻竇炎鼻竇的低氧狀態(tài)，開放堵塞的鼻竇竇口，對改善鼻竇炎的滲出及治療有一定的臨床指導(dǎo)意義。

缺氧最常見誘導(dǎo)人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎滑膜組織成纖維細(xì)胞產(chǎn)生VEGF[7]，然而，盡管成纖維細(xì)胞是鼻竇和鼻竇黏膜中的主要細(xì)胞成分，并且能夠產(chǎn)生VEGF，但鼻腔內(nèi)息肉成纖維細(xì)胞產(chǎn)生VEGF的研究仍不多見。本研究中鼻息肉成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF水平低于滑膜成纖維細(xì)胞，可能是因為缺氧條件下的鼻竇內(nèi)氧濃度仍然相對較高。在較低的氧分壓下，鼻竇成纖維細(xì)胞可能產(chǎn)生更高水平的VEGF。鼻竇成纖維細(xì)胞比滑膜成纖維細(xì)胞產(chǎn)生VEGF低的另一個原因可能與它們的生理反應(yīng)不同有關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)提示成纖維細(xì)胞產(chǎn)生VEGF的能力取決于組織來源和炎癥的存在與否。

因為慢性鼻竇炎病理條件下，鼻竇內(nèi)不止單單存在低氧條件，還存在大量病理性細(xì)胞因子[8]，近期我們的研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)的鼻息肉成纖維細(xì)胞產(chǎn)生VEGF被鼻竇內(nèi)多種因素聯(lián)合影響并增強(qiáng)。由此考慮，炎癥因子和缺氧聯(lián)合作用條件下的鼻竇增加了VEGF的產(chǎn)生，它們可能與慢性鼻竇炎的發(fā)病機(jī)制和持續(xù)性密切相關(guān)。