柯桂林 謝景輝 孔浩然 徐前明

摘要?[目的]調(diào)查和分析羊巴貝斯蟲未定種在安徽省蕪湖市某地區(qū)的流行情況。[方法]2019年4月下旬在蕪湖市某地區(qū)的3個山羊養(yǎng)殖場采集245份血液樣品，應(yīng)用血涂片鏡檢和PCR方法進(jìn)行檢測。[結(jié)果]鏡檢結(jié)果顯示有2個養(yǎng)殖場受到感染，總體陽性率為0.82%;PCR檢測結(jié)果顯示3個養(yǎng)殖場均有感染，總體陽性率為2.04%。[結(jié)論]蕪湖市山羊感染羊巴貝斯蟲未定種的情況與全國總體平均情況較為接近。

關(guān)鍵詞?山羊;羊巴貝斯蟲未定種;流行病學(xué)調(diào)查;PCR;血涂片鏡檢

中圖分類號：S858.27?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A?文章編號：2095-3305（2020）03-037-02

DOI：?10.19383/j.cnki.nyzhyj.2020.03.017

巴貝斯蟲是一類可寄生于人和動物紅細(xì)胞內(nèi)的傳染性血液原蟲，隸屬于梨形蟲目、巴貝斯科、巴貝斯屬。巴貝斯蟲病的潛伏期為10～15?d，感病動物主要表現(xiàn)為發(fā)熱、血紅蛋白尿、貧血和死亡，嚴(yán)重危害畜牧業(yè)發(fā)展[1]。我國羊巴貝斯蟲病最早報道于20世紀(jì)80年代，首先發(fā)現(xiàn)于四川盆地和東北部分地區(qū)，此后又相繼在華中、華東和西南等地區(qū)被發(fā)現(xiàn)[2-5]。從華中、東北和西部等地區(qū)分離到9株不同種的羊巴貝斯蟲，通過分子分類學(xué)和生物學(xué)特性方法鑒定發(fā)現(xiàn)這些巴貝斯蟲可以分為?2個種群，即莫氏巴貝斯蟲種群（B.?motasi）和巴貝斯蟲未定種種群（Babesia?sp.）[5-8]。據(jù)2016年楊強(qiáng)等[9]采用實時熒光定量PCR對我國10個省份羊巴貝斯蟲病進(jìn)行流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示羊巴貝斯蟲未定種的總體陽性率為0.85%，其中與安徽省相鄰的湖北省的陽性率為4.55%、浙江省的陽性率為0，可見羊巴貝斯蟲未定種在我國部分地區(qū)仍有存在，且各地區(qū)間的陽性情況有所差異，而在安徽省尚未見該種巴貝斯蟲的報道。

臨床上可根據(jù)臨患病動物是否表現(xiàn)發(fā)熱、貧血、血尿、消瘦等癥狀，再結(jié)合發(fā)病季節(jié)、地點和是否在野外放牧等流行病學(xué)數(shù)據(jù)，對巴貝斯蟲病做出初步診斷，而確診則必須查到病原體。確診該病常用的方法之一是血涂片染色鏡檢，巴貝斯蟲感染紅細(xì)胞后，血涂片經(jīng)染色處理可在顯微鏡下觀察到蟲體。目前，分子檢測技術(shù)已在疫病檢測和診斷中的得到廣泛應(yīng)用，其中PCR方法具有較高敏感性和特異性，現(xiàn)已逐漸應(yīng)用于疫病的鑒別診斷、病原種類鑒定以及流行病學(xué)調(diào)查[9]。但是到目前為止，安徽省蕪湖市某地區(qū)尚未有山羊感染羊巴貝斯蟲未定種的情況調(diào)查報告，基于此，筆者對從該地區(qū)的3個羊場采集的245份山羊抗凝血樣品，應(yīng)用血涂片染色鏡檢和PCR方法進(jìn)行檢測，以確認(rèn)山羊感染羊巴貝斯蟲未定種的情況，旨在為該地區(qū)進(jìn)行羊巴貝斯蟲未定種的預(yù)防控制提供部分流行病學(xué)數(shù)據(jù)。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?試劑?DNeasy?Blood&Tissue?Kit購自Qiagen公司;擴(kuò)增試劑Fast?Taq?premix（with?dye）購自TOLOBIO公司。

1.1.2?調(diào)查對象?該次研究收集的樣品均于2019年4月采集于安徽省蕪湖市某地區(qū)的3個山羊養(yǎng)殖場，共計1?215頭山羊。

1.2?方法

采用吉姆薩染色法檢查：對先樣品進(jìn)行集中處理（低速離心1?100×g），取上層紅細(xì)胞進(jìn)行血涂片鏡檢。吸取離心后的上層紅細(xì)胞5?μl，置于干燥干凈載玻片的1/4處，然后用推片輕觸血滴，使約呈“一”字型鋪開，充滿推片寬度。然后使推片與載玻片之間形成約30°的夾角（視血液粘稠情況和操作習(xí)慣適當(dāng)調(diào)節(jié)角度），在操作過程中保持一定的速度將血液向載玻片的另一段推動，使在載玻片上留下一層均勻的薄膜，以通過薄膜可看清紙上的字體為宜。完成推片，待血液薄膜風(fēng)干固定在玻片上之后，進(jìn)行DIFF?QUIK染色。將風(fēng)干的血涂片置于A染液中55?s以固定涂片，然后從A液中取出，稍微甩干殘留在玻片上面的液體，然后放入B液中進(jìn)行染色55?s，接著從B液中取出，稍微甩干后再放入C液中進(jìn)行染色40～50?s。染色完成后將玻片晾干，最后在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2?結(jié)果與分析

2.1?血涂片檢查結(jié)果

在制作的245個血涂片中，僅有2個分別來自甲、乙場的血涂片疑似感染羊巴貝斯蟲未定種（圖1），鏡檢檢出率為0.82%（2/245）。

2.2?PCR檢測結(jié)果

PCR結(jié)果顯示該次調(diào)查的3個養(yǎng)殖場均有羊巴貝斯蟲未定種感染情況的發(fā)生，245份樣品中有5份感染，樣品總體陽性率為2.04%（表1）。

3?討論

羊感染巴貝斯蟲病輕則會使生產(chǎn)和生長性能下降，飼養(yǎng)成本增高，重則會導(dǎo)致死亡，造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。Guan等[9]運(yùn)用ELIS方法對2005—2010年間收集的樣品進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)總體陽性率為31.66%，其中安徽省的陽性率為40.26%，處于較高水平，但由于該方法調(diào)查的數(shù)據(jù)只能反映抗體陽性率，而不能反映巴貝斯蟲的實時感染情況。在Guan等[10]的研究中還表明羊感染羊巴貝斯蟲未定種后，其抗體在8個月以后仍可保持在高水平，而羊感染后體內(nèi)的蟲血癥最多只能存在2個月[11]。因此，使用核酸檢測方法檢測目的基因組相比于ELISA檢測抗體更能反映羊感染巴貝斯蟲未定種的實時情況。Guan等[11]對于2004—2005年間采自甘肅的365份和新疆的145份樣品，應(yīng)用特異LAMP?檢測方法進(jìn)行羊巴貝斯蟲未定種檢測，結(jié)果陽性率為3.5%。楊強(qiáng)等[12]對2010—2014年間采自我國10個省份的365份樣品應(yīng)用實時熒光PCR方法進(jìn)行檢測，其結(jié)果顯示羊巴貝斯蟲未定種的感染率為0.85%。在該次調(diào)查的245份樣品中，PCR結(jié)果顯示3個養(yǎng)殖場均有感染情況，樣品總體陽性率為2.04%，較Guan等[11]報道的陽性率（3.5%）低，但較楊強(qiáng)等[12]報道的陽性率（0.85%）高，表明該地區(qū)羊感染羊巴貝斯蟲未定種的情況與其他地區(qū)的感染情況相近，且在過去的5—10年間，該病在羊群中的感染情況基本維持在同一水平。出現(xiàn)這種情況可能是因為這段時間中規(guī)?；B(yǎng)殖場發(fā)展較快，農(nóng)戶的飼養(yǎng)水平提高，羊接觸硬蜱的機(jī)會下降，從而導(dǎo)致羊巴貝斯蟲未定種未進(jìn)一步傳播，但與此同時巴貝斯蟲可在蜱蟲體內(nèi)進(jìn)行休眠從而長時間存在，加之蜱蟲活動范圍廣，繁殖力強(qiáng)，很難被滅絕，所以該病尚未得到完全的控制和根絕。

參考文獻(xiàn)

[1]?高永利，鄭龍.我國巴貝斯蟲病流行病學(xué)研究現(xiàn)狀[J].西北國防醫(yī)學(xué)雜志，2018，39（6）：365-369.

[2]?EMMANU?C，KAMEL?H?K，AMINA?D，et?al.Sequencing?of?the?smallest?Apicomplexan?genome?from?the?human?pathogen?Babesiamicroti[J].NucleicAcidsRes，2017，40（18）：9102-9144.

[3]?MCCOSKER?P?J.The?global?importance?of?babesiosis[M].New?York：Academic?Press，1981：1-24.

[4]?李寶福，劉文余，邱桐禮.山羊焦蟲病的診治[J].遼寧畜牧獸醫(yī)，1996（2）：27.

[5]?陳德明.綿羊焦蟲病調(diào)查報告[J].獸醫(yī)科技雜志，1982（3）：33-34.

[6]?張銀河，宋慶華.新安縣兩鄉(xiāng)鎮(zhèn)小尾寒羊梨形蟲病的診治[J].中國獸醫(yī)寄生蟲病，2004（1）：50.

[7]?李寶福，劉文余，邱桐禮.山羊焦蟲病的診治[J].遼寧畜牧獸醫(yī)，1996（2）：27.

[8]?YINH，LUW，LUOJX.Babesiosis?in?China[J].TropAnimHea?1th?Prod，1997，29（4）：11-15.

[9]?GUAN?G?Q，MA?ML，LIU?AH，et?al.A?recently?identified?ovine?Babesia?in?China：Serology?and?seroepidemiology[J].?Parasitol?Int，2012，61（4）：532-537.

[10]?GUAN?G?Q，CHAUVIN?A?H，LUO?J?X，et?al.Merozoite?proteins?from?Bzbesia?sp.BQ1（Lintan）?as?potential?antigens?for?serodiagnosis?by?ELISA[J].Parasitology，2010，137（6）：927-938.

[11]?GUAN?G?Q，ALAIN?C，LUO?J?X，et?al.The?decelopment?and?evaluation?of?a?loopmediated?isothermal?amplification（LAMP）?method?for?detection?of?Babesia?sp.infective?to?sheep?and?goats?in?China[J].Exp?Parasitol，2008，120（1）：39-44.

[12]?楊強(qiáng)，劉愛紅，劉軍龍，等.我國十省份羊巴貝斯蟲的分子流行病學(xué)調(diào)查[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2016，46（5）：597-601.

責(zé)任編輯：黃艷飛