官玲亮 查英 白琳 于福來(lái) 陳振夏 陳曉鷺 謝小麗 王凱 黃梅

摘 ?要：MYB轉(zhuǎn)錄因子是植物中龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，在植物體內(nèi)有著廣泛的生物學(xué)功能?；诎{香全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)，利用DNAMAN 6.0、MEGA 5.05軟件以及ProtParam、WebLogo和SOPMA在線網(wǎng)站分析艾納香MYB轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白的分類、理化性質(zhì)、氨基酸序列高級(jí)結(jié)構(gòu)、保守結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化等。結(jié)果表明，挖掘到127個(gè)BbMYB基因，預(yù)測(cè)47條具有MYB轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列;根據(jù)結(jié)構(gòu)域可分為1R-BbMYB和R2R3-MYB 2個(gè)亞類，其中R2-BbMYB與R3-BbMYB基序中都含有3個(gè)保守的色氨酸，而R1-BbMYB基序只有2個(gè)保守的色氨酸;艾納香MYB家族蛋白均為親水性蛋白，熱穩(wěn)定性較高且富含堿性氨基酸，大部分蛋白以無(wú)規(guī)則卷曲為主，其中R2R3-BbMYB3、R2R3-BbMYB4與1R-BbMYB15蛋白是以α-螺旋為主;與擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子家族共同構(gòu)建的進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，艾納香MYB家族在進(jìn)化上包括2個(gè)大類，6個(gè)亞類，通過(guò)艾納香與擬南芥MYB蛋白序列相鄰或是進(jìn)化關(guān)系近可以預(yù)測(cè)艾納香MYB基因功能，為進(jìn)一步對(duì)艾納香MYB家族基因研究及其功能鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：艾納香;MYB轉(zhuǎn)錄因子;生物信息學(xué)中圖分類號(hào)：S31??????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Bioinformatics Analysis of MYB?Transcription Factor Family inBlumea balsamifera

GUAN Lingliang¹， ZHA?Ying^1，2， BAI?Lin^1，2， YU?Fulai^1*，?CHEN?Zhenxia¹， CHEN?Xiaolu¹， XIE?Xiaoli¹， WANG?Kai¹，?HUANG?Mei¹

1. Tropical Crops Genetic Resources Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences?/ Hainan Provincial Engineering Research Center forBlumea balsamifera，?Haikou， Hainan?571101， China; 2. College of Agricultural， Heilongjiang Bayi Agricultural University， Daqing， Heilongjiang?163319， China

Abstract： MYB is one of the largest transcription factors family and has a wide range of biological functions in plants.?Based on the full-length transcriptome database ofBlumea balsamifera，?DNAMAN?6.0， MEGA?5.05 software and ProtParam， WebLogo and SOPMA online sites were used to analyze?and predict the types， physicochemical properties，?advanced structure of amino acid sequence，?conserved domain and phylogenetic evolution of MYB transcription factor inB.?balsamifera，?The results showed that 127BbMYBgenes were extracted， and 47 protein sequences with MYB conserved domains were predicted. According to the domain， they could?be divided into 1R-BbMYB and R2R3-MYB.?Meanwhile， the R2-BbMYB and R3-BbMYB motifs contained?three conserved tryptophans， while R1-BbMYB contained?only two. Morever， all proteins?of MYB family?inB.?balsamiferawere?hydrophilic with high thermal stability and rich in basic amino acids. And most of the proteins were?irregular curls?except the R2R3-BbMYB3， R2R3-BbMYB4 and 1R-BbMYB15. The MYB family ofB.?balsamiferaevolved into two?major categories?and six subcategories?by comparing with the evolutionary tree?ofArabidopsis thaliana.?It would provide a method for further research on the functional identification of the MYB family?inB.?balsamiferaby the adjacent or evolutionary relationship with the same function.

Keywords： Blumea balsamifera;?MYB transcription factor;?bioinformatics

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2020.07.004

自1987年轉(zhuǎn)錄因子基因首次被報(bào)道以來(lái)，參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、次生代謝以及抗逆等相關(guān)的數(shù)百種轉(zhuǎn)錄因子不斷被分離^[1]。其中，MYB轉(zhuǎn)錄因子是參與植物代謝和調(diào)控的一類重要的轉(zhuǎn)錄因子^[2]。MYB蛋白N端具有由R基序（R1， R2和R3）組成的保守的MYB結(jié)構(gòu)域，且每個(gè)R基序含約52個(gè)氨基酸，折疊形成螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（HTH）結(jié)構(gòu)^[3]。根據(jù)結(jié)構(gòu)域特征將MYB家族分為1R-MYB/MYB-related、R2R3-MYB、R1R2R3- MYB和4R-MYB 4個(gè)亞類^[4]。其中，1R-MYB/ MYB-related在維持染色體結(jié)構(gòu)的完整性和調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄上起重要作用^[5];而R2R3-MYB蛋白參與調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育^[6]以及次級(jí)代謝^[7-8]等。

艾納香[Blumea balsamifera（L.） DC.]為菊科艾納香屬植物，是我國(guó)一種重要的民族藥材，主要分布在我國(guó)華南、西南地區(qū)，在黎族、苗族、壯族等少數(shù)民族中有著悠久的藥用歷史^[9]。艾納香以根、嫩枝、葉入藥，用于治療傷風(fēng)感冒以及病毒性感染等^[10]。研究表明艾納香還具有抗腫瘤、保肝護(hù)肝、抗氧化、抗酪氨酸激酶等藥理作用，其中起生物活性的化學(xué)成分是黃酮、萜類、噻吩、苯丙素、揮發(fā)油等^[11]。艾納香素是艾納香中一種重要的黃酮類化合物^[12]，能修復(fù)肝細(xì)胞藥源性損傷而具有保肝作用^[13]。夏奇峰等^[14]預(yù)測(cè)了艾納香中黃酮類物質(zhì)的代謝途徑，表明查耳酮合成酶（CHS）與查耳酮異構(gòu)酶（HCT）是該路徑中的關(guān)鍵酶，可通過(guò)調(diào)節(jié)這些關(guān)鍵酶基因的表達(dá)量來(lái)提高艾納香黃酮類成分的含量，從而提高艾納香的品質(zhì)。大量研究表明，MYB轉(zhuǎn)錄因子參與黃酮類次生代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)控，如黃芩^[15]（Scutellaria baicalensisGeorgi）、擬南芥^[16]（Ar a b i dopsis thaliana）、苦蕎^[17] [Fagopyrum tataricum（L.） Gaertn.]，但在艾納香中未見相關(guān)報(bào)道。

本研究在前期艾納香全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的基礎(chǔ)上，利用生物信息學(xué)挖掘艾納香MYB家族轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，并對(duì)其結(jié)構(gòu)域、系統(tǒng)進(jìn)化、蛋白質(zhì)理化性質(zhì)及氨基酸高級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為進(jìn)一步對(duì)艾納香MYB家族基因的研究及其功能鑒定提供科學(xué)依據(jù)。

1??材料與方法

1.1序列來(lái)源

從艾納香全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘到127條BbMYB序列，通過(guò)SMART（http：//smart.embl.de/）和NCBI BLAST（https：//blast.ncbi.?nlm.nih.gov/?Blast.?cgi）預(yù)測(cè)得到47條具有MYB轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域的蛋白序列，并通過(guò)NCBI的CCD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrp sb.cgi）數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)蛋白保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行鑒定。根據(jù)牛義嶺等^[2]對(duì)MYB基因家族的結(jié)構(gòu)分類，將47條艾納香MYB蛋白序列歸類到1R-MYB、R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子中。擬南芥（Arabidopsis thaliana，At）的MYB蛋白序列從TAIR（https：// www.arabidopsis.org/）中下載。

1.2 ?序列分析

利用ExPASy提供的在線ProtParam軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）對(duì)艾納香MYB轉(zhuǎn)錄因子編碼蛋白的氨基酸數(shù)目、分子量、等電點(diǎn)、脂肪族氨基酸數(shù)和蛋白質(zhì)疏水性等理化性質(zhì)進(jìn)行分析。

通過(guò)WebLogo網(wǎng)站（http：//weblogo.berkeley. edu/）對(duì)艾納香MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白進(jìn)行保守氨基酸基序分析。

利用DNAMAN 6.0軟件對(duì)47條艾納香MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白和與其結(jié)構(gòu)相似的26條擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。然后利用MEGA 5.05軟件繪制候選艾納香MYB基因與26個(gè)擬南芥MYB基因的進(jìn)化樹，采用鄰接法（neighbor-joining method），參數(shù)選擇P-distance、pairwise deletion和Bootstrap method=1000，其他參數(shù)選擇默認(rèn)值。

利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/NPSA/ npsa_sopma.html）在線軟件進(jìn)行艾納香MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，并利用Swiss-Model（https：//swissmodel.expasy.org/interactive/）程序?qū)Π{香MYB轉(zhuǎn)錄因子編碼蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 艾納香MYB轉(zhuǎn)錄因子家族基因的挖掘以及蛋白序列的分類

本研究從艾納香全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘到127條BbMYB堿基序列，通過(guò)SMART和NCBI BLAST預(yù)測(cè)，去除重復(fù)序列及冗余轉(zhuǎn)錄本后，最終得到47條具有完整MYB保守結(jié)構(gòu)域的序列，命名為BbMYB1～BbMYB47，其中屬于1R-MYB轉(zhuǎn)錄因子的堿基序列有32條，長(zhǎng)度分布在916～ 3185?bp，屬于R2R3-MYB類的堿基序列有15條，長(zhǎng)度分布在1615～5173 bp。

2.2 艾納香MYB轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白理化性質(zhì)分析

通過(guò)ProtParam在線軟件對(duì)艾納香MYB轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白的理化性質(zhì)（表1）進(jìn)行分析可知，艾納香R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸殘基數(shù)為158～1307，1R-MYB轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸殘基數(shù)為140～799;蛋白等電點(diǎn)在堿性范圍內(nèi)的數(shù)量多于酸性范圍的數(shù)量，表明該家族蛋白富含堿性氨基酸;整個(gè)家族蛋白的總平均親水性GRAVY均為負(fù)值，表明艾納香MYB轉(zhuǎn)錄因子家族均為親水性蛋白，且熱穩(wěn)定性較高。

2.3 ?艾納香MYB轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白保守基序分析

利用DNAMAN 6.0和WebLogo網(wǎng)站對(duì)47個(gè)艾納香R2R3-MYB以及1R-MYB類轉(zhuǎn)錄因子分別進(jìn)行多序列比對(duì)，保守區(qū)域以及2個(gè)亞類的基序特征進(jìn)行分析（圖1）。結(jié)果表明，R1結(jié)構(gòu)在第5位和第24位有一個(gè)保守的色氨酸（W），而

第3個(gè)色氨酸被組氨酸（H）、賴氨酸（K）以及精氨酸（R）取代。通過(guò)分析R2R3-MYB類蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)R2、R3結(jié)構(gòu)都包括3個(gè)極度保守的色氨酸，且色氨酸之間間隔19～20個(gè)氨基酸，符合MYB結(jié)構(gòu)域特征;其次R3基序除第2個(gè)色氨酸高度保守外，第1個(gè)和第3個(gè)色氨酸處還包括苯丙氨酸（F）;此外R2、R3結(jié)構(gòu)域中

還包括其他保守的氨基酸殘基，如R2結(jié)構(gòu)中的谷氨酸（E）、天冬氨酸（D）、天冬酰胺（N）、半胱氨酸（C）、精氨酸（R）和亮氨酸（L）;R3結(jié)構(gòu)中的谷氨酸（E）、脯氨酸（P）、甘氨酸（G）、天冬酰胺（N）、精氨酸（R）和賴氨酸（K），這些氨基酸殘基對(duì)維持MYB轉(zhuǎn)錄因子功能域的HTH結(jié)構(gòu)有關(guān)。

2.4 ?艾納香MYB轉(zhuǎn)錄因子家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用MEGA 5.05軟件構(gòu)建艾納香和擬南芥MYB蛋白家族系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2），結(jié)果顯示艾納香和擬南芥MYB基因被聚為2個(gè)大類（Ⅰ、Ⅱ），其中1R-MYB主要是分布在Ⅰ類，占艾納香總1R-MYB類轉(zhuǎn)錄因子的76.9%，R2R3-MYB主要被聚在第Ⅱ類中，占艾納香總R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子的58.3%。第Ⅰ大類又被分為5個(gè)亞類，1R-BbMYB24與1R-BbMYB15是最先被分化的，其中1R-BbMYB24與1RMYB-At2G470210相鄰，而在1R-BbMYB15基礎(chǔ)上進(jìn)化出相鄰的1R-Bb MYB40與1R-BbMYB19，在第5個(gè)亞類基礎(chǔ)上衍生出R2R3-MYB類。由此可以看出，第Ⅱ類是在第Ⅰ類基礎(chǔ)上進(jìn)化來(lái)的，其中1R-BbMYB2與R2R3-BbMYB13相鄰且與R2R3MYB-At1 G1 4350、R2R3MYB-At2G02820位于同一進(jìn)化亞類不同分支;R2R3-BbMYB14與R2R3-BbMYB16相鄰且是在R2R3-BbMYB17基礎(chǔ)上進(jìn)化來(lái)的;R2R3-BbMYB3、R2R3MYB-At1G09770與R2R3- Bb MYB8、R2R3-AtMYB44分別相鄰，表明其進(jìn)化關(guān)系更近。在該進(jìn)化樹中存在著不同結(jié)構(gòu)域但同源性較高的情況，如R2R3-BbMYB1與1R-BbMYB41相鄰;同時(shí)存在著相同結(jié)構(gòu)域同源性高的情況，如1R-BbMYB42與1R-BbMYB35，1R-BbMYB26與1RMYB-At3G09600分別相鄰。總體表明，艾納香MYB家族蛋白與擬南芥MYB家族蛋白同源性高，在相鄰或較近進(jìn)化關(guān)系上的

2.5艾納香MYB轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)分析

2.5.1 ?蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析??利用SOPMA對(duì)艾納香MYB蛋白質(zhì)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（圖3），結(jié)果顯示大部分蛋白都以無(wú)規(guī)則卷曲為主，α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊散布于整個(gè)蛋白序列;其中R2R3- BbMYB3、R2R3-BbMYB4與1R-BbMYB15蛋白是以α-螺旋為主，β-轉(zhuǎn)角、β-折疊以及無(wú)規(guī)則卷曲分布在蛋白序列中。值得注意的是，α-螺旋恰

藍(lán)色：α-螺旋;紅色：β-折疊;綠色：β-轉(zhuǎn)角;紫色：無(wú)規(guī)則卷曲。

Blue： α-helix; Red： β-sheet; Green： β-turn;Purple： Random?coil.

好是MYB基因保守結(jié)構(gòu)域的位置。因此，推測(cè)α-螺旋參與維持MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的HTH結(jié)構(gòu)。

2.5.2 ?蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)分析??分別選取R2R3- BbMYB9、R2R3-BbMYB4、1R-BbMYB2、1R- BbMYB15序列進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模（圖4），結(jié)果表明，艾納香MYB家族所有蛋白均具有α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲、β-折疊和β-轉(zhuǎn)角，這與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)相符合。R2R3-BbMYB亞族蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)相似性較高，R2、R3結(jié)構(gòu)分別有3個(gè)α-螺旋，能明顯看到HTH結(jié)構(gòu)，主要是在無(wú)規(guī)則卷曲長(zhǎng)度有所不同。對(duì)于1R-BbMYB亞族蛋白，主要在α-螺旋數(shù)量上存在差異。

3 討論

本研究鑒定出32個(gè)1R-BbMYB和15個(gè)R2R3- BbMYB基因，相對(duì)于擬南芥基因組中的118個(gè)2R-MYB基因^[18]偏少。通過(guò)對(duì)其翻譯的氨基酸序列中保守結(jié)構(gòu)域基序分析，表明R2R3-BbMYB結(jié)構(gòu)域比1R-BbMYB結(jié)構(gòu)域保守。其中，R2-BbMYB與R3-BbMYB基序中都含有3個(gè)保守的色氨酸，色氨酸之間的間隔氨基酸數(shù)目分別為20、20與20、19。R3-BbMYB基序第1個(gè)和第3個(gè)色氨酸處還包括疏水氨基酸苯丙氨酸，這與黑果枸杞R3-MYB基序一致^[19]，表明MYB基因家族N端在不同植物間高度保守，對(duì)于維持HTH的構(gòu)型有著重要的作用^[20];其中R2-BbMYB基序中2個(gè)色氨酸之間的間隔與杜海^[21]描述大豆植物R2R3- MYB一致，說(shuō)明艾納香R2-BbMYB基序的色氨酸非常保守;而R3-BbMYB基序中色氨酸比大豆中少1個(gè)氨基酸殘基，表明艾納香R2R3-BbMYB類轉(zhuǎn)錄因子中的R3-Bb MYB基序發(fā)生氨基酸缺失，該區(qū)域可能是其植物進(jìn)化和功能分化的熱點(diǎn)區(qū);而R1-BbMYB基序只有2個(gè)保守的色氨酸且間隔19個(gè)氨基酸，第3個(gè)色氨酸被組氨酸（H）、賴氨酸（K）以及精氨酸（R）取代。蛋白理化性質(zhì)表明艾納香蛋白富含堿性氨基酸，均屬于親水性蛋白以及熱穩(wěn)定性好。分別對(duì)1R-BbMYB和R2R3-BbMYB蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，分析表明所有蛋白都具α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角、β-折疊及無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，且大部分為無(wú)規(guī)則卷曲為主，只R2R3- BbMYB3、R2R3-BbMYB4與1R-?BbMYB15蛋白是以α-螺旋為主;從2個(gè)亞族中選取具有代表性的序列R2R3-BbMYB9、R2R3-BbMYB4、1R- BbMYB2、1R-BbMYB15進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模，發(fā)現(xiàn)R2R3-BbMYB亞族中的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)相似性較高，在無(wú)規(guī)則卷曲長(zhǎng)度上略有不同;而1R-BbMYB亞族蛋白，主要是在α-螺旋數(shù)量上差異較大。通過(guò)對(duì)艾納香MYB轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域基序分析以及氨基酸高級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，為研究艾納香屬及菊科其他植物的MYB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)化奠定基礎(chǔ)。

擬南芥作為一種模式植物，其MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能研究已經(jīng)比較清楚，如AtMYB123/ TT2、AtMYB4、AtMYB7和AtMYB24參與調(diào)控?cái)M南芥花青素的合成^[22-23];研究者認(rèn)為可以根據(jù)進(jìn)化樹中位于同一分枝中擬南芥蛋白功能來(lái)預(yù)測(cè)研究物種蛋白的功能，如在構(gòu)建的進(jìn)化樹中，與擬南芥R2R3-MYB處于相鄰位置上的葡萄、水稻的R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子被認(rèn)為具有相同或相似功能^[19];本研究用所得47條艾納香MYB類轉(zhuǎn)錄因子蛋白與22條擬南芥MYB蛋白作系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示艾納香和擬南芥MYB基因被聚為2個(gè)大類，其中1R-MYB分布廣泛，在Ⅰ類中占艾納香總1R-MYB類轉(zhuǎn)錄因子的76.9%，R2R3-MYB主要被聚在第Ⅱ類中，占艾納香總R2R3-MYB類轉(zhuǎn)錄因子的58.3%;在該進(jìn)化樹中存在著不同結(jié)構(gòu)域但與相同結(jié)構(gòu)域相鄰的情況。總體表明，艾納香MYB家族蛋白與擬南芥MYB家族蛋白同源性高。其中，R2R3-BbMYB8與R2R3-AtMYB44相鄰;R2R3-AtMYB11與R2R3- AtMYB12相鄰且在R2R3-BbMYB9基礎(chǔ)上進(jìn)化來(lái)的。研究表明擬南芥中黃酮類物質(zhì)主要受AtMYB11、AtMYB12和AtMYB111以及AtMYB75/?PAP1、AtMYB90、AtMYB114調(diào)控^[24-25]。因此可以推測(cè)R2R3-BbMYB9可能具有相似的功能，可能與艾納香中黃酮類次生代謝產(chǎn)物的生物合成有關(guān)，這將為艾納香MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能研究提供參考。

本研究參考擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子家族，通過(guò)多種生物信息學(xué)軟件分析艾納香MYB基因家族的結(jié)構(gòu)特征，為進(jìn)一步研究艾納香MYB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)和功能奠定基礎(chǔ)。

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