黃若干 周淑瑤 藍曉東 江紫薇 吳祿祥
1.廣西白云山盈康藥業(yè)有限公司,廣西 南寧 530002;2.廣東漢潮中藥科技有限公司,廣東 廣州 510145
馥芳艾納香(Blumea aromaticaDC.)為菊科艾納香屬的粗壯草本或亞灌木狀的植物,全草可入藥,味辛、微苦,性溫,具有祛風消腫、活血止癢的功效,主治風濕關節(jié)痛、濕疹、皮膚瘙癢及外傷出血等[1]。馥芳艾納香主要分布于我國云南省、四川省、貴州省、廣西壯族自治區(qū)(以下簡稱廣西)等地,多生長于低山林緣、荒坡或山谷路旁[2]。馥芳艾納香在廣西有著悠久的用藥歷史,民間常用于風濕骨痛、皮膚瘙癢等癥的治療,廣西白云山盈康藥業(yè)有限公司以馥芳艾納香為主藥開發(fā)了風濕骨痛純壯藥制劑——華佗風痛寶片(膠囊)、祛風濕藥酒等品種。近年來,隨著市場和產業(yè)的發(fā)展,馥芳艾納香市場需求量逐年增加,加劇了人們對馥芳艾納香野生資源的過度開采。在自然條件下馥芳艾納香種子發(fā)芽率極低,種子壽命較短,不利于馥芳艾納香的推廣種植。因此,資源緊缺現(xiàn)已成為制約馥芳艾納香藥材及制劑產業(yè)發(fā)展的關鍵問題之一[3]。
目前,國內尚未大面積開展馥芳艾納香人工栽培,關于馥芳艾納香人工栽培的研究報道也較少。因此,筆者以馥芳艾納香種子為外植體,探索外植體消毒最佳時間,繼代增殖、生根培養(yǎng)適宜的培養(yǎng)基,初步建立馥芳艾納香組培快繁技術體系,為實現(xiàn)馥芳艾納香大面積人工栽培生產、提高藥材產量和品質奠定基礎。
2023年1月,于廣西河池市采集馥芳艾納香種子,要求采種母株生長健壯、無病蟲害。種子采收后,晾曬干燥,篩除雜質,于陰涼處貯藏備用。
試驗試劑有無水乙醇(分析純),由天津市大茂化學試劑廠生產;氯化汞溶液(分析純),由天津市富宇精細化工有限公司生產;α-萘乙酸(α-Naphthaleneacetic acid,NAA),由阿拉丁化學試劑公司生產;6-芐氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine,6-BA),由阿拉丁化學試劑公司生產;蔗糖,由天津市大茂化學試劑廠生產;瓊脂,由天津市大茂化學試劑廠生產。
1.2.1 培養(yǎng)基配制
以MS 為基本培養(yǎng)基,添加瓊脂7.5 g/L、蔗糖30.0 g/L、pH 值調為6.0~6.2,配制分裝后,于116 ℃、0.1 MPa的條件下滅菌30 min。
1.2.2 初代培養(yǎng)
將馥芳艾納香種子用自來水沖洗5 min,濾紙吸干水分。于超凈工作臺中,將種子用75%乙醇浸泡30 s,再用0.1%氯化汞溶液浸泡消毒8 min,消毒時不斷搖動燒杯。消毒后,用無菌水清洗3 次,每次清洗1 min,期間不斷搖晃燒杯。將消毒后的種子接種于添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA 的1/2 MS 培養(yǎng)基中進行初代培養(yǎng)[4]。
1.2.3 繼代培養(yǎng)
挑選健壯、長勢較好的叢生芽,以MS 為基本培養(yǎng)基,探索6-BA(1.0、1.5、2.0、3.0 mg/L)和NAA(0.1、0.2 mg/L)不同植物生長調節(jié)劑組合(共8個處理)對馥芳艾納香繼代培養(yǎng)的影響。每瓶接種1 個叢生芽,每個處理接種20瓶,重復3次。
1.2.4 生根培養(yǎng)
挑選生長至1.5 cm 的健壯不定芽,將其接種于不同的生根培養(yǎng)基中進行生根誘導。以1/2 MS 為基本培養(yǎng)基,研究不同質量濃度的NAA(0.1、0.3、0.8、1.5、2.0 mg/L)對馥芳艾納香生根培養(yǎng)的影響。每瓶接種1個不定芽,每個處理接種20瓶,重復3次。
1.3.1 繼代培養(yǎng)階段
接種20 d后,統(tǒng)計馥芳艾納香的增殖系數、玻璃化率,觀察不定芽的生長狀況,篩選出馥芳艾納香適宜的繼代增殖培養(yǎng)基。
1.3.2 生根培養(yǎng)階段
接種20 d后,統(tǒng)計馥芳艾納香的生根率、平均主根數、平均主根長、平均株高,觀察組培苗的生長情況,篩選出馥芳艾納香適宜的生根誘導培養(yǎng)基。
試驗數據采用SPSS 28.0軟件進行統(tǒng)計分析。
由表1 可知,不同植物生長調節(jié)劑組合下,馥芳艾納香的繼代增殖效果存在較大差異。各處理不定芽生長情況如圖1 所示。以增殖系數為主要指標,發(fā)現(xiàn)H2處理馥芳艾納香的增殖系數最高(9.4),且不定芽生長健壯,呈嫩綠色。其次為H3處理,增值系數為2.3。綜合考慮馥芳艾納香的增值系數及生長情況,最終選擇添加1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA 的MS 培養(yǎng)基為馥芳艾納香適宜的繼代增殖培養(yǎng)基。
表1 馥芳艾納香的繼代培養(yǎng)效果
圖1 不同植物生長調節(jié)劑組合下馥芳艾納香生長情況
由表2 可知,隨著NAA 質量濃度的升高,馥芳艾納香的生根率呈先下降后升高的趨勢。F1、F2組培苗生長狀況如圖2 所示。其中,NAA 質量濃度為0.1、1.5、2.0 mg/L時,馥芳艾納香的生根率均為100%,生根效果較好。以生根率為主要指標,綜合考慮馥芳艾納香組培苗的平均主根長和根的生長情況,最終選擇添加0.1 mg/L NAA 的1/2 MS 培養(yǎng)基為馥芳艾納香適宜的生根誘導培養(yǎng)基。
表2 馥芳艾納香的生根培養(yǎng)效果
圖2 不同質量濃度NAA處理下馥芳艾納香生根情況
近年來,馥芳艾納香市場需求量不斷增加,但馥芳艾納香種子在自然條件下自我繁殖困難,且新優(yōu)品種難以采用扦插、嫁接、播種等方式進行繁殖。一般通過組培繁殖技術實現(xiàn)具有優(yōu)良特性的馥芳艾納香種苗的培育。應用組培快繁技術可以短時間內生產出無菌、無毒、健康、性狀一致的優(yōu)質種苗,是解決馥芳艾納香種苗短缺、實現(xiàn)規(guī)模化生產的有效方法之一[5]。
植物生長調節(jié)劑是促進植物組織分化的重要調節(jié)物質,不同組合及質量濃度的植物生長調節(jié)劑可能會刺激植物不同控制基因的酶類,從而影響植物內源激素的水平,進而影響植物不定芽的增殖效果和植株的生長狀態(tài)[6-7]。因此,篩選適宜的植物生長調節(jié)劑組合及質量濃度是建立植物組培快繁技術的關鍵。此次研究發(fā)現(xiàn),在馥芳艾納香外植體誘導培養(yǎng)過程中,6-BA的質量濃度對外植體的增殖系數起著關鍵作用。外植體在誘導培養(yǎng)30 d 后,其增殖系數隨著6-BA 質量濃度的增加而下降,說明高質量濃度的6-BA 不利于馥芳艾納香的繼代增殖。此次試驗中,以增殖系數為主要指標,結合不定芽的生長情況,篩選出添加1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA 的MS 培養(yǎng)基為馥芳艾納香適宜的繼代增殖培養(yǎng)基。
植物生長調節(jié)劑的質量濃度也是影響植物組培苗生根的關鍵因素。此次研究發(fā)現(xiàn),隨著NAA質量濃度的升高,馥芳艾納香的生根率和平均主根長均呈先下降后升高的趨勢,最終篩選出添加0.1 mg/L NAA 的1/2 MS 培養(yǎng)基為馥芳艾納香不定芽適宜的生根誘導培養(yǎng)基,組培苗的平均主根長達5.9 cm,且主根粗壯,有利于組培苗后期順利經過煉苗階段。
綜上所述,馥芳艾納香種子以75%乙醇和0.1%氯化汞溶液消毒后,于無菌條件下接種在添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA 的1/2 MS 培養(yǎng)基中進行初代培養(yǎng)可得到叢生芽。切下誘導出的叢生芽,將其接種于添加1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA 的MS 培養(yǎng)基進行繼代培養(yǎng),誘導形成不定芽。將不定芽接種于添加0.1 mg/L NAA 的1/2 MS 培養(yǎng)基中可誘導其生根。此次試驗可為構建馥芳艾納香組培快繁體系奠定基礎。