嚴(yán)專強(qiáng) 尹麗娟 劉琳琳 楊德鴻 梁曉穎 魏曉娜 黃建飛 周慶豐

摘? 要：本研究通過病毒分離、RT-PCR和測(cè)序分析等方法，從廣東某肉雞場發(fā)生法氏囊和胸腺嚴(yán)重萎縮的雞群中分離了1株傳染性法氏囊病毒，命名為GD2020株。氨基酸序列分析結(jié)果顯示，分離株VP2基因高變區(qū)與近期國內(nèi)分離的法氏囊病毒新型變異株SHG115株同源性為99.1%，與早期變異株Variant E株同源性為97.5%，與經(jīng)典毒株、超強(qiáng)毒株和弱毒株同源性在89.3%～94.1%之間。進(jìn)化分析結(jié)果表明，GD2020株與SHG115株屬于同一分支，與早期變異株和經(jīng)典毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。GD2020株感染不引起雞只死亡和出現(xiàn)腿肌出血等典型臨床癥狀，但能引起法氏囊嚴(yán)重萎縮。本研究為廣東地區(qū)傳染性法氏囊病的防控提供了數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：傳染性法氏囊病毒;新型變異株;分離鑒定;VP2基因

中圖分類號(hào)：S858.31? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B? ? ?文章編號(hào)：1673-1085（2020）7-0050-03

雞傳染性法氏囊?。↖nfectious bursal disease，IBD）是由IBD病毒（Infectious bursal disease，IBDV）引起的一種雞的急性、高度接觸傳染性、溶淋巴細(xì)胞性的免疫抑制性傳染病[1]。IBDV主要感染3～6周齡的青年雞，感染后法氏囊先出現(xiàn)充血水腫，再嚴(yán)重萎縮，導(dǎo)致法氏囊中淋巴濾泡被大量破壞，引起雞只急性發(fā)病甚至死亡[2]。IBDV屬于雙RNA病毒科禽雙RNA病毒屬， 有血清I型和血清II型， 僅血清I型對(duì)雞有致病性。根據(jù)致病性和病毒中和試驗(yàn)可將血清I型IBDV分為經(jīng)典株、變異株、超強(qiáng)毒株和弱毒株[1]。

免疫接種是控制IBD的主要方法。IBD疫苗種類繁多，包括全病毒滅活疫苗、亞單位疫苗、HVT載體疫苗、弱毒疫苗及抗原抗體復(fù)合物疫苗等。近年來，由于疫苗的合理使用，IBDV超強(qiáng)毒株在田間爆發(fā)頻率逐漸降低。然而，哈爾濱獸醫(yī)研究所近期的一項(xiàng)調(diào)查結(jié)果顯示IBDV新型變異株開始在我國廣泛流行，研究人員于2017～2019年間，從黑龍江、吉林、遼寧、河北、北京、山東、山西、福建、江蘇、安徽、湖北、浙江和云南等13個(gè)省份的免疫雞群中分離了82株新型變異毒株，這表明在用的IBDV疫苗可能不能保護(hù)新毒株的感染[3-4]。本研究對(duì)近期廣東省分離的IBDV毒株進(jìn)行了基因序列分析，以期為該病的有效防控提供參考數(shù)據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 臨床樣品采集與病毒分離? 發(fā)病雞群弱小雞偏多，均勻度在80%以下，剖檢可見法氏囊和胸腺嚴(yán)重萎縮。采集發(fā)病雞的法氏囊和脾臟組織，剪碎，加入5倍量2000IU/mL的青霉素、鏈霉素研磨成糜狀，移入滅菌離心管中，在4℃的冰箱中放置3h后，反復(fù)凍融3次，8000rpm離心5min，取上清經(jīng)絨毛尿囊膜途徑接種10～12日齡SPF雞胚。孵化6d后，從人工氣室端剝?nèi)ヂ褮?，觀察膜上有無增厚或痘斑病變，并收集活胚和48h后死胚的絨毛尿囊膜，研磨后-80℃?zhèn)溆谩?/p>

IBDV超強(qiáng)毒株DH2017株由本實(shí)驗(yàn)室保存。使用10～12日齡SPF雞胚測(cè)定新分離毒株和經(jīng)典毒株效價(jià)。

1.2? RT-PCR檢測(cè)? 取1.1中收集的絨毛尿囊膜研磨液，離心后取上清，按照RNAiso Plus試劑盒說明書提取總RNA。

使用TaKaRa公司PrimeScript One-Step RT-PCR試劑盒進(jìn)行VP2基因擴(kuò)增（上游引物：5′-GCCGATGATTACCAATTCTCATC-3′;下游引物：5′-CCGGATTATGTCTTTGAAGC-3′），反應(yīng)條件為： 50℃ 30min;94℃ 3min;94°C 40s，53°C 40s，72°C 40s，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán); 72℃ 10min。用1%瓊脂糖電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，陽性樣品送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.3? VP2基因測(cè)序與分析? 用DNAStar軟件對(duì)分離株與參考毒株VP2基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析。使用MEGA-X軟件鄰位相接法構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.4? 致病性試驗(yàn)? 新分離毒株和實(shí)驗(yàn)室保存的超強(qiáng)毒株分別經(jīng)口服途徑接種10只28日齡SPF雞，攻毒劑量為106EID50/0.2mL。攻毒后每天觀察雞只臨床癥狀，攻毒后2d和14d剖殺5只/組雞觀察法氏囊和腿肌病變。

2? 結(jié)果

2.1? 病毒分離鑒定與測(cè)序結(jié)果分析? 臨床病料接種SPF雞胚后，培養(yǎng)6d未出現(xiàn)死胚。雞胚絨毛尿囊膜研磨液RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示IBDV陽性，分離毒株命名為GD2020株。

基因測(cè)序獲得位于VP2基因631～1347nt的717bp長度的序列。對(duì)獲得的序列進(jìn)行同源性分析顯示，分離株和新型變異株SHG115株同源性最高，核苷酸和氨基酸同源性分別為98.3%和99.1%;與早期變異株同源性偏低，核苷酸同源性僅為94.3%，見表1。

2.2? 氨基酸序列變異分析? GD2020株具有變異株的特征性氨基酸222T、249K和286I，但不具有變異株特征性氨基酸254S。和早期變異株相比，GD2020株和SHG115株發(fā)生了5個(gè)氨基酸突變，分別為221K、252I、254N、263Y和299S，其中263Y和299S是經(jīng)典毒株和超強(qiáng)毒株的特征性氨基酸，見圖1。

核苷酸和氨基酸比對(duì)結(jié)果表明GD2020株屬于變異株，但和早期的變異株相比，GD2020株又具有部分經(jīng)典毒株和超強(qiáng)毒株的特點(diǎn)，屬于新型變異株。

2.3? 遺傳進(jìn)化分析? 遺傳進(jìn)化分析結(jié)果表明，GD2020株與IBDV新型變異株SHG115株屬于同一分支，與早期變異株和經(jīng)典毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，見圖2。

2.4? 致病力分析? 口服接種SPF雞后2d，超強(qiáng)毒株組死亡2只，新型變異株組無死亡。剖檢可見超強(qiáng)毒株組和新型變異株組雞只均出現(xiàn)法氏囊水腫，超強(qiáng)毒株組雞只的法氏囊和腿肌嚴(yán)重出血，而新型變異株組雞只的法氏囊僅有輕微出血，腿肌正常。攻毒后14d，超強(qiáng)毒株組和新型變異株組雞只法氏囊均出現(xiàn)嚴(yán)重萎縮，見圖3。

3? 討論

血清Ⅰ型的IBDV遍布全世界，基本所有的家禽主產(chǎn)區(qū)都有IBD發(fā)生，嚴(yán)重威脅著世界養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展[4-5]。盡管各種疫苗在防控傳染性法氏囊病中起到了重要作用，但隨著美國變異株、歐洲超強(qiáng)毒株和中國新型變異株的出現(xiàn)，常造成雞群的免疫失敗，導(dǎo)致一定的經(jīng)濟(jì)損失，現(xiàn)今IBD仍是養(yǎng)禽業(yè)防控的重要對(duì)象[4]。本研究從廣東某肉雞場發(fā)生法氏囊和胸腺嚴(yán)重萎縮的雞群中分離到1株法氏囊新型變異株病毒，該病毒感染不引起雞只死亡和出現(xiàn)腿肌出血等典型臨床癥狀，但攻毒后最早4d就可見法氏囊嚴(yán)重萎縮，推測(cè)該雞場出現(xiàn)的高比例的弱小雞問題可能與IBDV引起的免疫抑制有關(guān)。

早期研究發(fā)現(xiàn)，通過部分特征性氨基酸可以區(qū)分不同類型的IBDV毒株，這些氨基酸分別為超強(qiáng)毒株的222A、256I、294I和299S，變異株的249K和254S以及弱毒株的253H、279N、284T和330R[6]。本研究分離毒株和早期變異株相比，發(fā)生了多個(gè)氨基酸突變，其中212D和263Y與經(jīng)典毒株氨基酸序列相同，299S是超強(qiáng)毒株的特征性氨基酸，提示IBDV新型變異株可能是早期變異株和經(jīng)典毒株的重組病毒。為了有效控制IBDV新型變異株感染，病毒流行動(dòng)態(tài)監(jiān)控、現(xiàn)有疫苗保護(hù)效果評(píng)價(jià)和新疫苗研發(fā)等工作需要繼續(xù)開展。

參考文獻(xiàn)：

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[3]? Fan L， Wu T， Hussain A， et al. Novel variant strains of infectious bursal disease virus isolated in China [J].Vet Microbiol， 2019：230： 212-220.

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[6]? Ren X， Xue C， Zhang Y， et al. Genomic analysis of one Chinese strain YS07 of infectious bursal disease virus reveals unique genetic diversity [J]. Virus Genes. 2009：39（2）：246-8.