林阿隨 蔣萍 沈耀川 謝曉梅 陳昕

【摘要】 目的：探究集落刺激因子2（colony stimulating factor 2，CSF2）對舌鱗狀細(xì)胞癌TCa8113細(xì)胞系化療敏感性的影響。方法：全轉(zhuǎn)錄組測序分析順鉑耐藥TCa8113細(xì)胞（TCa8113/CDDP）與野生型TCa8113（WT-TCa8113）表達(dá)譜，并做差異基因分析。以TCa8113/CDDP細(xì)胞株上調(diào)程度最高的CSF2基因?yàn)楹蜻x耐藥基因，通過構(gòu)建該基因敲低、過表達(dá)TCa8113細(xì)胞株，探究CSF2對TCa8113細(xì)胞對順鉑敏感性的影響。結(jié)果：全轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果共篩選出2 077個差異基因，包括1 488個上調(diào)基因，589個下調(diào)基因。其中，CSF2是TCa8113/CDDP細(xì)胞株上調(diào)程度最高的基因。細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果提示，WT-TCa8113細(xì)胞毒染48 h的半數(shù)抑制濃度（IC50）為（0.502±0.030）μg/ml，顯著低于TCa8113/CDDP的（6.956±0.370）μg/ml

（P<0.01）。TCa8113/CDDP細(xì)胞的耐藥指數(shù)（RI）為（13.8±1.34）。CSF2敲低TCa8113/CDDP和CSF2過表達(dá)TCa8113/CDDP細(xì)胞IC50分別為（0.774±0.120）μg/ml和（9.548±0.550）μg/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論：CSF2是舌鱗狀細(xì)胞癌順鉑耐藥相關(guān)基因，抑制CSF2表達(dá)能顯著提高TCa8113順鉑敏感性。

【關(guān)鍵詞】 集落刺激因子2 舌鱗狀細(xì)胞癌 順鉑 耐藥 化療敏感性

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.17.072 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 B 文章編號 1674-6805（2020）17-0-04

Effect of CSF2 Gene on Chemosensitivity of Tongue Squamous Cell Carcinoma TCa8113 Cell Line/LIN Asui， JIANG Ping， SHEN Yaochuan， XIE Xiaomei， CHEN Xin. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（17）： -174

[Abstract] Objective： To investigate the effect of colony stimulating factor 2 （CSF2） gene on chemosensitivity of tongue squamous cell carcinoma TCa8113 cell line. Method： Cisplatin-resistant TCa8113 cells （TCa8113/CDDP） and wild-type TCa8113 （WT-TCa8113） expression profiles were analyzed by whole transcriptome sequencing， and the differential gene were analyzed. The CSF2 gene with the highest degree of up-regulation of TCa8113/CDDP cell line was used as a candidate drug resistance gene. By constructing this gene knockdown and overexpressing TCa8113 cell line， the effect of CSF2 on the sensitivity of TCa8113 cells to Cisplatin was explored. Result： The whole transcriptome sequencing results screened out 2 077 differential genes， including 1 488 up-regulated genes and 589 down-regulated genes. Among them， CSF2 was the most up-regulated gene of TCa8113/CDDP cell line. The results of cytotoxicity test indicated that the half inhibitory concentration （IC50） of WT-TCa8113 after 48 hours of infection was （0.502±0.030） μg/ml， which was lower than （6.956±0.370） μg/ml of TCa8113/CDDP cells （P<0.01）. The drug resistance index （RI） of TCa8113/CDDP cells was （13.8±1.34）. IC50 of CSF2 knockdown TCa8113/CDDP and CSF2 overexpression TCa8113/CDDP cells were （0.774±0.120） μg/ml and （9.548±0.550） μg/ml， and the difference was statistically significant （P<0.01）. Conclusion： CSF2 is a Cisplatin resistance-related gene of tongue squamous cell carcinoma. Inhibiting CSF2 expression can significantly increase the sensitivity of TCa8113 to Cisplatin.

[Key words] Colony stimulating factor 2 Tongue squamous cell carcinoma Cisplatin Drug resistance Chemosensitivity

First-authors address： The 73rd Military Hospital of the PLA， Xiamen 361000， China

口腔鱗狀細(xì)胞癌是口腔癌中最常見的腫瘤類型，占所有口腔惡性腫瘤的90%以上[1-2]。其中，以舌鱗狀細(xì)胞癌（tongue squamous cell carcinoma，TSCC）最為常見[3-4]。近年來多采用術(shù)前聯(lián)合化療方案以提高手術(shù)成功率，減少術(shù)后復(fù)發(fā)。但是，不同個體對相同化療方案表現(xiàn)出的療效差異較大[5-6]。化療耐藥是TSCC治療失敗的最主要原因[7-8]。目前，順鉑耐藥分子機(jī)制仍未完全闡明[9]。本研究通過比較順鉑耐藥人舌鱗癌TCa8113細(xì)胞株（TCa8113/CDDP）和野生型TCa8113（WT-TCa8113）細(xì)胞株的差異表達(dá)基因，篩選出CSF2為TCa8113/CDDP與WT-TCa8113細(xì)胞表達(dá)差異最大的基因。但目前仍未有CSF2基因?qū)Ca8113細(xì)胞化療敏感性的相關(guān)報道，故本研究通過構(gòu)建CSF2敲低、過表達(dá)TCa8113細(xì)胞株進(jìn)一步探究CSF2對TCa8113對順鉑敏感性的影響，為逆轉(zhuǎn)舌鱗狀細(xì)胞癌順鉑耐藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基（Thermo Fisher Scientific）;胎牛血清（FBS）;全自動細(xì)胞計數(shù)儀（Thermo Fisher Scientific）;全蛋白提取試劑盒（杭州弗德生物科技有限公司）;鼠源性CSF2抗體（上海雅酶生物科技有限公司）;HRP標(biāo)記二羊抗鼠抗體（上海雅酶生物科技有限公司）;高速離心機(jī)（beckman coulter，Allegra X-30）;恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific）。

1.2 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)

野生型人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系TCa8113（WT-TCa8113）、順鉑耐藥TCa8113（TCa8113/CDDP）購買于上海語純生物科技有限公司。CSF2敲低WT-TCa8113（KD-WT-TCa8113）、CSF2過表達(dá)WT-TCa8113（OE-WT-TCa8113）、CSF2敲低TCa8113/CDDP（KD-TCa8113/CDDP）和CSF2過表達(dá)TCa8113/CDDP（OE--TCa8113/CDDP）由廈門閩博生物技術(shù)有限公司構(gòu)建。上述細(xì)胞株均使用10% FBS和1%鏈霉素和青霉素的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 順鉑耐藥細(xì)胞株的鑒定

取對數(shù)生長期的WT-TCa8113和TCa8113/CDDP，胰蛋白酶消化后用新鮮培養(yǎng)基稀釋至1×105/ml，接種于24孔板中培養(yǎng)6 h。待細(xì)胞完全貼壁后，更換含有梯度濃度的順鉑的新鮮DMEN培養(yǎng)基，濃度梯度設(shè)置為0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、10 μg/ml。培養(yǎng)48 h后采用全自動細(xì)胞計數(shù)儀計數(shù)各處理組的活細(xì)胞數(shù)量，以未加藥組（0 μg/ml）為對照組，根據(jù)公式[細(xì)胞存活率=各梯度濃度處理組活細(xì)胞數(shù)量/對照組（0 μg/ml）活細(xì)胞數(shù)量×100%]計算各處理的細(xì)胞存活率。根據(jù)細(xì)胞抑制曲線計算WT-TCa8113和TCa8113/CDDP的半數(shù)抑制濃度（IC50）。耐藥指數(shù)（RI）計算公式為：耐藥細(xì)胞系的IC50/野生型細(xì)胞系的IC50。

1.4 野生型TCa8113和順鉑耐藥TCa8113全轉(zhuǎn)錄組測序及表達(dá)譜分析

將上述經(jīng)過鑒定的WT-TCa8113和TCa8113/CDDP送于上海天昊生物科技有限公司進(jìn)行高通量轉(zhuǎn)錄組測序。mRNA表達(dá)量計算經(jīng)比對、比較、標(biāo)準(zhǔn)化三個過程。利用HTSeq計算Read Count值。mRNA表達(dá)量以RPKM（reads per kilobase per million mapped reads）表示。分析WT-TCa8113和TCa8113/CDDP的差異表達(dá)mRNA，以|log2FoldChange|≥1，調(diào)整后P值<0.05為差異表達(dá)基因。最后，對差異表達(dá)的基因進(jìn)行KEGG Pathway富集分析及人類基因功能（Gene Ontology，GO）富集分析，分析差異表達(dá)基因參與的生物學(xué)過程和通路，尋找可能的作用機(jī)制。P<0.05為篩選閾值。

1.5 WesternBlot檢測細(xì)胞CSF2蛋白表達(dá)量

取指數(shù)生長期細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，PBS重懸制備細(xì)胞懸液。全蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞全蛋白后Western Blot試驗(yàn)檢測各細(xì)胞CSF2蛋白表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）由Graphpad Prism v8.2軟件計算，統(tǒng)計圖均采用Graphpad Prism v8.2統(tǒng)計學(xué)軟件制作。

2 結(jié)果

2.1 WT-TCa8113和TCa8113/CDDP細(xì)胞株對順鉑敏感性分析

梯度濃度（0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、10 μg/ml）順鉑培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，WT-TCa8113和TCa8113/CDDP細(xì)胞株的細(xì)胞存活率隨著順鉑濃度的增加而逐漸降低，見圖1。WT-TCa8113細(xì)胞株的IC50為（0.502±0.030）μg/ml，顯著低于TCa8113/CDDP細(xì)胞株的（6.956±0.370）μg/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=-30.114，P<0.01）。TCa8113/CDDP細(xì)胞的耐藥指數(shù)（RI）為（13.80±1.34）。

2.2 WT-TCa8113和TCa8113/CDDP細(xì)胞株基因差異表達(dá)分析

通過生物信息學(xué)方法，共篩選出差異表達(dá)基因2 077個，其中TCa8113/CDDP上調(diào)基因1 488個（右上區(qū)域），下調(diào)基因589個（左上區(qū)域），見圖2。根據(jù)差異倍數(shù)進(jìn)行排序。TCa8113/CDDP對比WT-TCa8813，表達(dá)量差異最大的上調(diào)基因分別為CSF2、NMES1、NOG、SERPINB13、TCRP1、DKK1、FGD3、MMP11、PTHL、HSPP1;表達(dá)差異最大的下調(diào)基因分別為KRT4、CRNN、MUC21、MAL、ACTA1、TGM3、KRT13、CRISP3、MYL1、SPRR3。

2.3 CSF2敲低、過表達(dá)細(xì)胞株CSF2蛋白表達(dá)量檢測

WesternBlot試驗(yàn)檢測6株TCa8113細(xì)胞CSF2蛋白表達(dá)水平，順鉑耐藥株TCa8113/CDDP的CSF2蛋白表達(dá)量較野生型WT-TCa8113高，見圖3A。對3次獨(dú)立試驗(yàn)的結(jié)果做半定量灰度分析顯示，在WT-TCa8113組中，OE-WT-TCa8113 CSF2蛋白表達(dá)量較WT-TCa8113高，KD-WT-TCa8113 CSF2蛋白表達(dá)量較WT-TCa8113低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;在TCa8113/CDDP組中，OE-TCa8113/CDDP CSF2蛋白表達(dá)量較TCa8113/CDDP高， KD-TCa8113/CDDP CSF2蛋白表達(dá)量較TCa8113/CDDP低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖3B。

2.4 CSF2表達(dá)對TCa8113細(xì)胞順鉑敏感性的影響

細(xì)胞毒性試驗(yàn)結(jié)果顯示，WT-TCa8113、KD-WT-TCa8113和OE-WT-TCa8113的IC50分別為（0.543±0.040）、（0.327±0.020）、（3.500±0.320）μg/ml，KD-WT-TCa8113的IC50顯著低于WT-TCa8113，OE-WT-TCa8113的IC50顯著高于WT-TCa8113，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖4A。TCa8113/CDDP、KD-TCa8113/CDDP和OE-TCa8113/CDDP的IC50分別為（6.539±0.470）、（0.774±0.120）、（9.548±0.550）μg/ml，

KD-TCa8113/CDDP的IC50顯著低于TCa8113/CDDP，OE-TCa8113/CDDP的IC50顯著高于TCa8113/CDDP，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖4B。

3 討論

本研究，通過分析人舌鱗狀細(xì)胞癌TCa8113及順鉑耐藥TCa8113的全轉(zhuǎn)錄組的表達(dá)差異，篩選出CSF2基因在耐藥TCa8113細(xì)胞中表達(dá)高度上調(diào)，故考慮其為潛在的順鉑耐藥相關(guān)基因。目前，CSF2對舌鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展仍未見報道。本研究首先采用WesternBlot試驗(yàn)檢測野生型TCa8113與順鉑耐藥株的CSF2表達(dá)情況，結(jié)果提示，順鉑耐藥株CSF2表達(dá)量較野生型TCa8113明顯升高。通過構(gòu)建CSF2敲低、過表達(dá)細(xì)胞株，進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出來的候選基因?qū)ι圜[狀細(xì)胞癌TCa8113細(xì)胞系的影響。本研究首次報道敲低CSF2能顯著提高野生型TCa8113順鉑化療敏感性。不僅如此，對于順鉑耐藥TCa8113/CDDP細(xì)胞株，敲低CSF2后，也可顯著提高其順鉑敏感性，即可實(shí)現(xiàn)耐藥逆轉(zhuǎn)。

目前，已有數(shù)篇研究表明，高表達(dá)CSF2與腫瘤的進(jìn)展有關(guān)[10-14]。例如，Lee等[10]報道，CSF2在尿路上皮癌中高表達(dá)，高表達(dá)CSF2的尿路上皮癌患者預(yù)后更差。Jiang等[11]發(fā)現(xiàn)，在胃癌中，高表達(dá)CSF2能促進(jìn)腫瘤增殖、遷移和血管生成，與預(yù)后不良有關(guān)。Lawicki等[14]發(fā)現(xiàn)，三陰性乳腺癌的CSF2表達(dá)較非三陰性乳腺癌高。三陰性乳腺癌組織通過分泌CSF2，促進(jìn)巨噬細(xì)胞在乳腺癌組織中的聚集，從而進(jìn)一步促進(jìn)三陰性乳腺癌的侵襲性。然而，據(jù)筆者所知，目前仍未有CSF2基因在舌鱗狀細(xì)胞癌中的表達(dá)及其表達(dá)對舌鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)性的研究。本研究初步鑒定了CSF2基因與舌鱗狀細(xì)胞癌順鉑耐藥相關(guān)，后續(xù)將進(jìn)一步探究CSF2參與舌鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生、發(fā)展及對順鉑耐藥的分子機(jī)制，為逆轉(zhuǎn)舌鱗狀細(xì)胞癌順鉑耐藥的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

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