羅勝　宋彥錕

【摘要】 目的：探究乳腺癌標(biāo)本于不同條件下保存對(duì)石蠟切片免疫組化指標(biāo)PR、ER和HER-2表達(dá)的影響。方法：擇取2018年1月-2019年1月筆者所在醫(yī)院病理科42份乳腺癌標(biāo)本為研究對(duì)象，取新鮮樣本石蠟包埋連續(xù)切片，免疫組化測(cè)定PR、ER和HER-2。另獲取乳腺癌標(biāo)本浸潤(rùn)部分組織，分別于超低溫、低溫和室溫條件下密封保存，并于12個(gè)月后復(fù)行免疫組化測(cè)定PR、ER和HER-2。觀察三種保存條件下組織樣本與新鮮樣本的免疫組化測(cè)定結(jié)果及指標(biāo)信號(hào)強(qiáng)度變化。結(jié)果：-80 ℃超低溫保存樣本中，PR、ER和HER-2陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度與新鮮樣本一致，1例ER 3+樣本信號(hào)降至2+，余同金標(biāo)準(zhǔn)一致。4 ℃低溫保存樣本中，PR信號(hào)減弱和消失14份，ER信號(hào)減弱和消失12份，HER-2信號(hào)減弱和消失13份。20 ℃室溫保存樣本中，僅4例PR，5例ER，7例HER-2表達(dá)信號(hào)與金標(biāo)準(zhǔn)相符，余不同程度減弱或消失。結(jié)論：乳腺癌石蠟切片超低溫蠟封保存可以有效隔絕氧化，維持良好的組織表面抗原性，對(duì)PR、ER和HER-2狀態(tài)影響較小，免疫組化檢測(cè)可行性高，效果優(yōu)于低溫和常溫保存。

【關(guān)鍵詞】 乳腺癌 石蠟切片 保存條件 免疫組化

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.21.059 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805（2020）21-0-02

Changes of PR， ER and HER-2 Status in Paraffin Section Breast Cancer under Different Storage Conditions/LUO Sheng， SONG Yankun. //Chinese and Foreign Medical Research， 2020， 18（21）： -144

[Abstract] Objective： To investigate the effect of breast cancer specimens stored under different conditions on the expression of immunohistochemical indexes PR， ER and HER-2 in paraffin sections. Method： From January 2018 to January 2019， 42 breast cancer specimens from the pathology department of our hospital were selected as research subjects. Fresh samples were embedded in paraffin-embedded serial sections， and PR， ER and HER-2 were determined by immunohistochemistry. Partially infiltrated tissues were obtained from breast cancer specimens， which were sealed and stored at ultra-low temperature， low temperature and room temperature， respectively， and PR， ER and HER-2 were determined by immunohistochemistry after 12 months. The immunohistochemical results of tissue samples and fresh samples under the three storage conditions were observed， and the changes in the signal intensity of the indicators were observed. Result： The positive expression intensity of PR， ER and HER-2 in cryopreserved samples at -80 ℃ was the same as that in fresh samples， the signal of ER3+ in one sample decreased to 2+， and the rest was the same as that in gold standard. In the samples stored at 4 ℃ at low temperature， the PR signal decreased and disappeared in 14， ER signal decreased and disappeared in 12， and HER-2 signal decreased and disappeared in 13. Only 4 PR， 5 ER and 7 HER-2 signals in 20 ℃ room temperature preserved samples were consistent with the gold standard. Conclusion： Preservation of ultra-low temperature wax seals for breast cancer paraffin sections can effectively isolate oxidation and maintain good tissue surface antigenicity. It has little effect on the status of PR， ER and HER-2. Immunohistochemical detection is highly feasible and the effect is better than low temperature and normal temperature preservation.

[Key words] Breast cancer Paraffin section Storage conditions Immunohistochemical

First-authors address： The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University， Fuzhou 350005， China

乳腺癌是女性常見(jiàn)惡性腫瘤。流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，乳腺癌發(fā)病率居我國(guó)女性惡性腫瘤第一位，死亡居第六位，年發(fā)病和死亡人數(shù)分別占世界的12%和10%，且受多種因素影響，我國(guó)乳腺癌發(fā)病率增長(zhǎng)速度超全球平均水平2倍以上，疾病形勢(shì)嚴(yán)峻，是嚴(yán)重威脅女性生命健康的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。因此，為提高檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性，避免不必要的組織浪費(fèi)，臨床常在組織切片時(shí)保留未染色切片[2-3]。為探究理想的組織切片長(zhǎng)期保存條件，保證免疫組化檢測(cè)質(zhì)量，本文擇取筆者所在醫(yī)院病理科乳腺癌標(biāo)本，觀察石蠟切片在不同保存條件下的免疫組化指標(biāo)改變情況，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

擇取2018年1月-2019年1月筆者所在醫(yī)院病理科42份乳腺癌標(biāo)本為研究對(duì)象。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理組織學(xué)檢查證實(shí)為浸潤(rùn)性乳腺癌的根治手術(shù)切除樣本;新鮮病理樣本免疫組化檢查研究指標(biāo)均呈陽(yáng)性且無(wú)明顯異質(zhì)性?；颊邔?duì)本研究均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 DAKO公司Envision檢測(cè)系統(tǒng)、兔抗人PR單克隆抗體（克隆號(hào)1E2）、兔抗人ER單克隆抗體（克隆號(hào)SP1）、兔抗人HER-2單克隆抗體（克隆號(hào)4B5）、免疫組化EliVison試劑盒、Leica RM2254石蠟切片機(jī)、Olympus BX53熒光顯微鏡等。

1.2.2 操作方法 取新鮮浸潤(rùn)乳腺癌手術(shù)標(biāo)本，制成5 mm×

3 mm×3 mm組織塊，酒精梯度脫水，石蠟包埋，上切片機(jī)以

3 μm厚度連續(xù)切片，選擇腫瘤組織豐富區(qū)域的切片樣本，免疫組化測(cè)定PR、ER和HER-2。通過(guò)HE染色鏡下觀察，確定乳腺癌浸潤(rùn)組織并標(biāo)記位點(diǎn)，以組織芯片儀打孔鉆取組織柱，將獲取的樣本移至受體蠟塊上，送入電熱恒溫烤箱，55 ℃烘烤至半融化狀態(tài)（60～90 min），取出后室溫冷卻，組織芯片蠟塊制備完成。將制作好的蠟塊上切片機(jī)以3 μm厚度連續(xù)切片9張，分成3組，3張/組，貼附于黏附載玻片（表面帶正電荷），電熱恒溫烤箱55 ℃烤片3 h后，分別于超低溫（-80 ℃蠟封）、低溫（4 ℃）和室溫（20 ℃）條件下密封保存。12個(gè)月后取樣，復(fù)行免疫組化測(cè)定PR、ER和HER-2。將組織切片脫蠟至水，采用預(yù)處理液80 ℃浸泡10 min，去離子水漂洗5 min，自然晾干，胃酶37 ℃消化30 min，同法漂洗晾干，酒精梯度脫水后變性雜交，室溫下暗處，以0.3%乙基苯基聚乙二醇（NP-40）刷洗組織切片，再以70 ℃浸泡5 min，復(fù)染熒光染料DAPI送于顯微鏡下觀察。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

由病理科兩名資深醫(yī)師共同完成結(jié)果判讀，乳腺癌研究樣本與新鮮樣本PR、ER免疫組化結(jié)果判讀參照ACSO/CAP《乳腺癌患者雌激素受體及孕酮受體免疫組織化學(xué)檢測(cè)指南》（2010版）[5];乳腺癌研究樣本與新鮮樣本HER-2免疫組化熒光原位雜交檢測(cè)結(jié)果判讀參照《乳腺癌HER-2檢測(cè)指南》（2014版）[5]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

以SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，采用字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

以手術(shù)切除新鮮樣本免疫組化檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，-80 ℃超低溫保存樣本中，PR與HER-2陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度及范圍均同金標(biāo)準(zhǔn)，1份ER 3+樣本信號(hào)降至2+，余同金標(biāo)準(zhǔn)。4 ℃低溫保存樣本中，PR信號(hào)一般減弱（3+降至2+，或2+降至1+）7份，明顯減弱（3+降至1+）3份，信號(hào)消失（任意+降至-）4份;ER信號(hào)一般減弱4份，明顯減弱1份，信號(hào)消失7份;HER-2信號(hào)一般減弱3份，明顯減弱6份，信號(hào)消失4份。20 ℃室溫保存樣本中，僅4份PR，5份ER，7份HER-2表達(dá)信號(hào)與金標(biāo)準(zhǔn)相符，余不同程度減弱或消失，見(jiàn)表1。新鮮樣本與研究樣本HER-2免疫組化結(jié)果對(duì)比見(jiàn)圖1。

注：a為新鮮樣本HER-2（2+）;b為研究樣本HER-2（2+）。

3 討論

甲醛固定石蠟包埋是臨床處理病理組織塊的常用方法，不僅可以達(dá)到支持增硬的作用，還可以很好地防止組織自溶與抗原擴(kuò)散，從而長(zhǎng)時(shí)間保存組織核酸及抗原，為病理檢測(cè)提供可靠樣本[6]。但隨著保存時(shí)間的延長(zhǎng)，組織切片仍會(huì)不可避免地受環(huán)境因素影響而逐漸發(fā)生氧化改變，是導(dǎo)致免疫組化和分子檢測(cè)假陰性結(jié)果的重要原因[7-8]。有報(bào)道指出，光作用、熱作用及環(huán)境中的化學(xué)因子作用均會(huì)對(duì)組織抗原活性造成影響[9]。另有研究證實(shí)，連續(xù)紫外線照射、長(zhǎng)時(shí)間或高溫烘烤，會(huì)造成組織切片抗原丟失[10]。

為延長(zhǎng)組織切片有效保存時(shí)間，保證病理檢測(cè)與指標(biāo)判讀準(zhǔn)確，本研究對(duì)理想的樣本切片保存條件進(jìn)行探究。研究統(tǒng)一采用組織芯片進(jìn)行樣本保存，有利于質(zhì)量控制，減少試驗(yàn)誤差，同時(shí)節(jié)約試劑和材料[11-12]。研究結(jié)果顯示，不同條件下保存12個(gè)月的乳腺癌石蠟切片樣本，DNA保存均良好，可以檢測(cè)到組織抗原，但抗原活性均存在不同程度改變。其中，室溫和低溫條件下保存的組織樣本免疫組化指標(biāo)PR、ER和HER-P改變較為明顯，特別是室溫下保存樣本，絕大多數(shù)信號(hào)明顯減弱甚至消失，提示氧化作用的存在。而超低溫蠟封保存PR與HER-2陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度及范圍同金標(biāo)準(zhǔn)一致，ER同金標(biāo)準(zhǔn)基本一致，提示超低溫蠟封保存對(duì)隔離氧化、保持組織表面抗原更具有效性與可行性。另有研究證實(shí)，蠟封聯(lián)合低溫的保存方法可以有效保存穩(wěn)定抗原，獲得與新鮮切片表達(dá)強(qiáng)度一致率超過(guò)90%的保存效果。