黃珊，孟輝*，曾昆，2，黃哲

（1.江蘇大學環(huán)境與安全工程學院，江蘇 鎮(zhèn)江212013；2.江蘇大學環(huán)境生態(tài)研究所，江蘇 鎮(zhèn)江212013）

工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類日常活動產(chǎn)生的大量富含氮、磷的廢水進入環(huán)境，造成水體富營養(yǎng)化，導致藻類大量繁殖，形成水華。我國近年來多次發(fā)生嚴重的水華，對我國的工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人民健康構(gòu)成了極大的危害，造成了巨大的經(jīng)濟損失[1]。研究發(fā)現(xiàn)，受到藻類污染的天然水體中對人類健康構(gòu)成嚴重危害的主要是微囊藻毒素（Microcystin）[2]，其是一類具有多種異構(gòu)體的環(huán)狀七肽化合物，具有很強的肝毒性及潛在的“三致”作用[3-6]，其中微囊藻毒素-LR（MC-LR）因分布最廣、毒性最強而備受關注[7-8]。因此，國內(nèi)外對飲用水及水產(chǎn)品中的MC-LR 制定了殘留限量標準，我國規(guī)定MC-LR 的限量標準為1.0 μg·L-1[9]。MC-LR理化性質(zhì)穩(wěn)定，常規(guī)處理方法不能將其有效去除[10-11]。MC-LR 不僅能夠直接污染水體，對水生生物造成危害，還能通過灌溉、施肥等方式進入農(nóng)田土壤，被農(nóng)作物吸收富集，造成農(nóng)產(chǎn)品安全問題，對人類健康產(chǎn)生危害[12-14]。因此亟需建立可靠、便捷的方法對農(nóng)田水樣中的MC-LR進行檢測。

目前對MC-LR 的檢測技術是儀器分析方法和免疫分析方法。儀器分析方法能夠精確定性定量，有賴于昂貴、精密的大型儀器，如高效液相色譜（HPLC）、液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS/MS）等[15-18]，且對樣品前處理、檢測人員及環(huán)境要求較高，檢測效率較低，不適用于樣本的現(xiàn)場快速篩選檢測，無法滿足環(huán)境中MC-LR 的實際監(jiān)測需求?；谔禺愋陨镒R別材料（抗體、核酸適配體等）的免疫檢測分析方法如酶聯(lián)免疫吸附分析方法（ELISA）、免疫傳感器分析方法被廣泛應用于食品中MC-LR 現(xiàn)場快速篩選檢測[19-22]，但是特異性生物識別材料直接決定了分析技術的檢測性能，而特異性生物識別材料制備成本高昂，周期較長，成為制約該項技術的主要瓶頸。表面增強拉曼散射技術作為一種新型分析技術，基本無需前處理，樣品需求量少，適用范圍寬，激發(fā)波長范圍寬，SERS 信號峰窄，特異性強，已被廣泛應用于食品及環(huán)境分析檢測等領域[23-24]。本研究擬以表面增強拉曼散射技術為檢測手段，建立能夠?qū)r(nóng)田水樣中MC-LR 進行檢測的現(xiàn)場、快速、靈敏的檢測方法，為農(nóng)田水樣中MC-LR 的現(xiàn)場監(jiān)測提供技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O）：分析純，購自天津市邁斯科化工有限公司，配制成1.0%的氯金酸溶液，4 ℃冰箱內(nèi)放置備用；檸檬酸三鈉（C6H5Na3O7·2H2O）：分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；硝酸銀（AgNO3）：分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司，配制成1.0×10-3mol·L-1的溶液，4 ℃冰箱內(nèi)放置備用；鹽酸羥胺（NH2OH·HCl）：分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司，配制成0.04 mol·L-1溶液，4 ℃冰箱內(nèi)放置備用；對巰基苯甲酸（4-mercaptobenzoic acid，4-MBA）：分析純，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；MC-LR：分析純，購自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設備

AR224CN 電子天平，美國OHAUS 公司；QT-1 漩渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司；C-MAG HS4磁力攪拌器，德國IKA 公司；BIOMATE 3S 紫外-可見分光光度計，美國Thermo 公司；Tecnai12 透射電子顯微鏡，荷蘭Philips 公司；i-Raman Plus 高靈敏度便攜式拉曼光譜儀，必達泰克光電科技（上海）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 拉曼光譜儀的參數(shù)設置

激發(fā)波長780 nm，拉曼光譜波長范圍：800～2 000 cm-1，功率300 MW，掃描時間20 s。

1.3.2 金種的制備

將50 mL（1 mmol·L-1）氯金酸溶液置于250 mL的圓底燒瓶中，加熱并劇烈攪拌，溶液沸騰后加入5 mL（38.8 mmol·L-1）檸檬酸三鈉溶液，溶液顏色由淺黃色變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)攪拌15 min，制備金種。

1.3.3 刺狀金納米顆粒的制備

采用金種媒介增長法合成。在100 mL 的燒杯中加入40 mL超純水，依次加入1.6 mL 1%氯金酸溶液、2 mL 4×10-2mol·L-1NH2OH·HCl 溶液，室溫下劇烈攪拌，分別加入0、20、100、200、500μL 和1 000μL 的1×10-3mol·L-1AgNO3溶液，最后加入0.2 mL 金種，攪拌至反應液呈棕色[25]。

1.3.4 刺狀金納米顆粒表征

使用紫外分光光度計和Tecnai12 透射電子顯微鏡對制備的金納米顆粒進行表征。刺狀金納米顆粒的SERS 增強效果的鑒定：以4-MBA 作為探針分子，取1.0μL SGNPs 與1μmol·L-14-MBA 溶液依次滴在硅片上，晾干后使用便攜拉曼光譜儀進行檢測，檢測條件為：激發(fā)波長為785 nm，掃描時間20 s。

1.3.5 SERS檢測方法的建立

標準曲線的建立：取1.0 mg MC-LR 標準品，溶解于1.0 mL 甲醇中，即為1.0 mg·mL-1標準儲備液，避光4 ℃保存。使用超純水制備0.001、0.01、0.1、1、10μg·mL-1和100 μg·mL-1，以三角狀金納米顆粒為基底，使用錫箔紙代替硅片，采用1.3.4 中的方法建立標準曲線。

1.3.6 農(nóng)田水樣中MC-LR的檢測

水樣的采集：以鎮(zhèn)江市內(nèi)運糧河及古運河灌溉水渠作為取樣點。采集深度為0.5 m，放入棕色玻璃瓶-20 ℃保存，一周內(nèi)檢測。

水樣的前處理：將水樣用0.22 μm 的濾膜過濾待用。

天然水體樣品添加回收試驗：陰性天然水樣（取自鎮(zhèn)江市內(nèi)金山湖，參照使用LC-MS/MS 方法測定[26]）添加MC-LR 標準儲備液，使其終濃度分別為0.1、1、10 μg·mL-1和40 μg·mL-1。使用1.3.5 的方法進行測定，每個水樣平行測定3次，計算添加回收率。

農(nóng)田水樣的檢測：分別在古運河和運糧河中游及下游取水口附近隨機采集2次水樣，使用1.3.5的方法對樣品進行測定，每個樣品平行測定3次。

圖1 紫外-可見吸收光譜和透射電鏡圖Figure 1 UV-vis spectrum and TEM

2 結(jié)果與分析

2.1 不同形貌的金納米顆粒對SERS活性的影響

2.1.1 不同形貌的金納米顆粒的紫外表征和透射電鏡圖

所制金種粒徑約20 nm，最大吸收波長為518 nm，加入氯金酸、鹽酸羥胺和一定體積的硝酸銀溶液后，其最大紫外吸收峰紅移，生成了新的納米粒子，透射電鏡顯示為刺狀的納米粒子。圖1 分別為本研究制備的金納米顆粒的紫外-可見吸收光譜和透射電鏡圖，球狀金納米顆粒、三角狀金納米顆粒、短刺狀金納米顆粒、長刺狀金納米顆粒、星形金納米顆粒及海膽狀金納米顆粒的最大吸收波長分別為600、612、724、762、798 nm和794 nm。

2.1.2 不同形貌的金納米顆粒的SERS表征

圖2 基于不同形貌的刺狀金納米顆粒的4-MBA SERS譜圖Figure 2 4-MBA SERS spectra of SGNPs with different morphologies

以4-MBA作為拉曼探針分子，研究金納米顆粒的SERS活性。如圖2所示，表征結(jié)果顯示除海膽狀金納米顆粒的SERS 活性較弱，其余刺狀金納米顆粒都表現(xiàn)出比球狀金納米顆粒更強的SERS 活性，其中又以三角狀金納米顆粒的SERS 活性最強，短刺狀金納米顆粒、長刺狀金納米顆粒、星形金納米顆粒的SERS活性逐漸減弱。刺狀金納米顆粒因其表面的尖刺和粗糙的表面具有比球狀金納米顆粒更強的拉曼散射效應，按照拉曼散射機理，長刺狀金納米顆粒應產(chǎn)生最強的SERS活性，但這又與三角狀金納米顆粒的SERS活性最強的試驗結(jié)果相矛盾，可能是由于三角狀金納米顆粒與短、長刺狀金納米顆粒相比相互之間更能緊密地貼合在一起，能產(chǎn)生很強的拉曼散射縫隙增強效應。星形金納米顆粒和海膽狀金納米顆粒因表面刺狀物長度和數(shù)量減少，尖端增強減弱，同時也沒有很強的縫隙增強，從而SERS 活性減弱。因此本研究選擇三角狀金納米顆粒作為拉曼增強基底建立檢測方法。

2.2 MC-LR的SERS檢測方法標準曲線的建立

MC-LR 的拉曼光譜峰的振動歸屬如表1 所示。圖3 為使用100 μg·mL-1MC-LR 溶液以SERS 活性最強的三角狀金納米顆粒為增強基底得到SERS譜圖。圖中5 條光譜，均出現(xiàn)了位于830、885、1 007、1 031、1 309、1 380、1 457 cm-1和1 640 cm-1處的SERS峰，它們均屬于MC-LR 的拉曼信號。在這些峰中，1 007 cm-1和1 309 cm-1處的峰最明顯，且其峰強與濃度有明顯的線性關系（圖4），因此選擇此特征峰作為本檢測方法的定量峰。

表1 4-MBA SERS光譜的譜峰歸屬Table 1 SERS shifts of 4-MBA

圖3 100μg·mL-1 MC-LR溶液以三角狀金納米顆粒為增強基底得到的SERS譜圖Figure 3 100μg·mL-1 MC-LR SERS spectra of Au TNs

以三角狀金納米顆粒為增強基底分別測定了0.001、0.01、0.1、1 μg·mL-1和10 μg·mL-1的MC-LR標準品溶液的SERS 譜圖（圖5），1 007 cm-1和1 309 cm-1處MC-LR 濃度與峰強的線性方程分別為y=16.798x+47.959 和y=11.510x+114.825。方法檢測限為1.0μg·L-1。

圖4 MC-LR溶液的濃度與其分別在1 007 cm-1和1 309 cm-1處的SERS峰強度之間的線性關系Figure 4 The linear correlation diagram of SERS peak intensity at 1 007 cm-1 and 1 309 cm-1 with the concentrations ranging from 1μg·L-1 to 100μg·mL-1

2.3 農(nóng)田水樣中MC-LR的檢測

測試結(jié)果如圖6 和表2 所示，本研究建立的檢測方法的回收率為80%～102%，符合檢測要求。MC-LR在農(nóng)田水樣中的最低檢測限為1.0μg·L-1。結(jié)果顯示該方法能夠應用于農(nóng)田水樣中MC-LR的檢測。

應用本研究建立的方法以及LC-MS/MS 方法對鎮(zhèn)江市內(nèi)運糧河及古運河水樣中的MC-LR 進行檢測。結(jié)果顯示（表3），本研究建立的方法與LC-MS/MS檢測結(jié)果基本一致，具有較好的相關性，相關系數(shù)為0.84。5 個樣本中，有兩個樣本中檢出MC-LR，檢出率為40%，含量最高為1.81μg·L-1。

3 討論

圖5 0.001、0.01、0.1、1μg·mL-1和10μg·mL-1的MC-LR溶液以三角狀金納米顆粒為增強基底得到的SERS譜圖Figure 5 0.001、0.01、0.1、1μg·mL-1and 10μg·mL-1 MC-LR SERS spectra of Au TNs

高效液相色譜法等大型儀器分析法需要對樣品進行前處理，檢測方式依賴大型儀器及專業(yè)分析人員，檢測成本較高，無法滿足現(xiàn)場檢測需求。基于特異性生物識別材料（抗體、核酸適配體等）的免疫檢測分析方法被廣泛應用于食品中MC-LR 現(xiàn)場快速篩選檢測，但是特異性生物識別材料制備成本高昂，周期較長，成為制約該項技術的主要瓶頸。本研究建立的基于三角狀金納米顆粒的SERS檢測技術對農(nóng)田水樣中的MC-LR 進行檢測，采用現(xiàn)場無標記檢測技術，無需使用價格昂貴且難以制備的抗體或核酸適配體，僅依據(jù)MC-LR 可以產(chǎn)生強拉曼指紋峰的特性進行檢測。表面增強拉曼光譜激發(fā)波長范圍寬，SERS 信號峰窄，特異性強，其對于樣品制備沒有特殊要求，基本無需前處理，樣品需求量少，適合微量和痕量樣品檢測，同時，適用范圍寬，對環(huán)境要求低，極易測量含水樣品。本研究使用的便攜拉曼儀器不同于大型儀器，成本低，輕巧便攜，操作簡便，對實驗人員技術要求低，現(xiàn)場適用性優(yōu)異。

圖6 農(nóng)田水樣中添加0.1、1、10μg·mL-1和40μg·mL-1的MCLR溶液，以三角狀金納米顆粒為增強基底得到的SERS譜圖Figure 6 0.1、1、10μg·mL-1and 40μg·mL-1MC-LR SERS spectra of Au TNs added to irrigation water samples

表2 農(nóng)田水樣測量MC-LR的結(jié)果和回收率Table 2 Determination and recoveries of MC-LR in irrigation water samples

表3 環(huán)境樣品分析Table 3 Analysis of environmental samples

文獻中已報道過一些基于表面增強拉曼相關技術的毒素或農(nóng)藥殘留的檢測，但目前檢測領域的SERS 相關技術還屬于新興的研究領域，關于微囊藻毒素的相關檢測研究僅有一篇[27]，檢測限僅為1.0 mg·L-1，遠高于本研究1.0μg·L-1的檢測限。此外，目前研究中使用的SERS增強基底多為金、銀納米粒子，銀的拉曼增強效應強于金，但易于氧化[28-29]。球狀金納米粒子穩(wěn)定易制備但增強效果差，金納米星、金納米棒等由于尖端效應，其拉曼增強效應遠強于金，但這些結(jié)構(gòu)不易制備，在實際環(huán)境中不穩(wěn)定，易熟化[30]。本研究制備的SGNPs穩(wěn)定易制備，縫隙增強效應較尖端效應更顯著，具有很強的SERS活性。

本研究首次建立基于三角狀金納米顆粒的SERS檢測技術并對農(nóng)田水樣中MC-LR 進行檢測，操作簡便，現(xiàn)場適用性優(yōu)異，檢測限（LOD）為1.0 μg·L-1，回收率為80%～102%。該方法可適用于對水體中MCLR 的現(xiàn)場殘留檢測，國家標準中MC-LR 的殘留限量為1.0μg·L-1。鎮(zhèn)江市內(nèi)運糧河和古運河灌溉水樣的檢測結(jié)果顯示，MC-LR 的檢出率為40%，含量最高達1.81μg·L-1，檢測結(jié)果與LC-MS/MS比對，相關系數(shù)為0.84，可以進行實際樣本檢測。

4 結(jié)論

（1）以4-MBA 作為標識物比較不同形貌的SGNPs 的SERS 增強效果，其中三角狀的金納米顆粒SERS 增強效果最為明顯，作為本研究的SERS 增強基底。

（2）利用MC-LR 會產(chǎn)生拉曼特征峰的特性，使用基于表面增強拉曼光譜的檢測方法檢測農(nóng)田水樣中的MC-LR，用三角狀的金納米顆粒作為基底，檢測限（LOD）為1.0μg·L-1，回收率為80%～102%，滿足殘留檢測要求。

（3）基于GSNPs的表面增強拉曼光譜技術于農(nóng)田水樣中MC-LR 的檢測方法簡便可靠，為現(xiàn)場快速檢測MC-LR提供了新的技術手段。