劉 幸，吳愛輝，劉云霞，史旭芹，黃美艷

(1.昆明市第三人民醫(yī)院藥劑科，昆明 650041；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥物分析教研室，南京210023；3.普洱市人民醫(yī)院藥劑科，云南普洱 665000)

隨著我國經(jīng)濟的發(fā)展和人民生活水平的改善，居民的膳食結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變。高熱量或高脂肪膳食比例逐步增加，導(dǎo)致了非酒精性脂肪肝的發(fā)病率逐年上升。墨旱蓮(Ecliptae Herba)是菊科植物鱧腸(EcliptaprostrataL.)的干燥地上部分。2015年版《中華人民共和國藥典》中記載，墨旱蓮的化學(xué)成分主要包括三萜皂苷類、黃酮類、噻吩類、蟛蜞菊內(nèi)酯類、揮發(fā)油和甾體生物堿等，具有滋補肝腎、涼血止血的功效。有研究顯示，墨旱蓮具有調(diào)節(jié)大鼠血脂的作用[1]，但并未闡述其影響肝臟脂代謝的作用機制，目前也未見墨旱蓮在小鼠模型中對脂代謝影響的研究報道。本研究通過觀察墨旱蓮對高脂喂養(yǎng)C57BL/6J小鼠肝臟脂代謝相關(guān)指標的影響，以及肝臟蘇木精-伊紅染色(HE)切片的變化，研究墨旱蓮對肝臟脂代謝的影響，以期為今后研究墨旱蓮的降脂機制提供參考。

1 材 料

1.1 實驗動物 SPF級C57BL/6J 雌性小鼠70只，3～4周齡，體質(zhì)量(20±2) g，由昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物合格證號：SCXK(滇)K2018-0013。

1.2 儀器和試藥 CL8000全自動生化分析儀(日本島津公司)；病理組織漂片烘片處理系統(tǒng)(德國Leica公司)；JEMl011透射電子顯微鏡(日本電子公司)；UV320紫外可見分光光度計(英國Pye-Unicam公司)。天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)測定試劑盒(批號20180411)、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)測定試劑盒(批號20180411)、三酰甘油(TG)測定試劑盒(批號20180221)、總膽固醇(TC)測定試劑盒(批號20180204)、葡萄糖(Glu)測定試劑盒(批號20180617)、游離脂肪酸(FFA)測定試劑盒(批號20180316，南京建成生物技術(shù)有限公司)；墨旱蓮顆粒(批號YP20161101，云南白藥集團中藥資源有限公司)；膽固醇(批號20180111)、膽鹽(批號20180124)、羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，批號20180321)均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

2 方 法

2.1 動物模型的建立和分組 70只C57BL/6J雌性小鼠適應(yīng)環(huán)境3 d后進行實驗，按隨機數(shù)字表法隨機分為5組，每組14只。對照組喂飼基礎(chǔ)飼料，其余4組小鼠喂飼高脂飼料(含70%基礎(chǔ)飼料，10%蔗糖，10%蛋黃粉，10%豬油)。每周記錄一次體質(zhì)量，喂養(yǎng)10周后，體質(zhì)量>對照組小鼠體質(zhì)量120%作為造模成功。選取48只成功造模的小鼠按體重分層隨機分為4組，分別為高脂模型組，低、中、高劑量墨旱蓮給藥組，每組均為12只。為保證每組小鼠數(shù)量一致，對照組從中隨機選取12只。對照組和高脂模型組小鼠灌胃給予1% CMC-Na膠體溶液；低、中、高劑量墨旱蓮給藥組小鼠分別灌胃給予40、120、360 mg/kg墨旱蓮膠體溶液(按墨旱蓮顆粒質(zhì)量計，用1% CMC-Na溶液配制而成)，灌胃容積為10 ml/kg，每日一次，連續(xù)6周。給藥期間對照組喂飼基礎(chǔ)飼料，高脂模型組和墨旱蓮給藥組喂飼高脂飼料。實驗期間各組小鼠均可自由進食與飲水，保持室溫20～24 ℃，相對濕度40%～70%，光照周期為12 h晝/12 h夜，每周稱量體質(zhì)量1次。飼養(yǎng)周期為6周。

2.2 指標測定和樣本采集 最后一天給藥結(jié)束后禁食12 h，于小鼠內(nèi)眥取血，1×103×g離心10 min分離血清，用全自動生化儀測定各組小鼠血清中TG、TC、Glu、AST、ALT水平。打開小鼠腹腔，取肝臟、腹部及腎周脂肪，稱重并計算肝臟重量與體質(zhì)量比值、脂肪重量與體質(zhì)量比值。取肝臟組織，制作HE切片，于透射電子顯微鏡下觀察小鼠肝細胞的空泡數(shù)量、損失的彈性纖維、脂肪沉積和肝細胞的水樣變性水平等肝組織形態(tài)學(xué)變化并拍照。另取100 mg肝臟組織，用生理鹽水制成20%組織勻漿，3×103×g離心15 min，取上清液，按試劑盒說明書用UV320紫外可見分光光度計測定FFA含量。

3 結(jié) 果

3.1 墨旱蓮對小鼠體質(zhì)量、體長、Lee’s指數(shù)和BMI的影響 給藥2周后，與對照組比較，高脂模型組小鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)和BMI均顯著升高(P<0.05)；與高脂模型組比較，低、中、高劑量墨旱蓮給藥組小鼠體質(zhì)量、體長、Lee’s指數(shù)、BMI無顯著性差異(P>0.05)，墨旱蓮各給藥組組間比較亦無顯著性差異(P>0.05)。給藥6周后，與對照組比較，高脂模型組小鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)和BMI均顯著升高(P<0.05)；與高脂模型組比較，中、高劑量墨旱蓮給藥組小鼠體質(zhì)量、Lee’s指數(shù)和BMI均顯著降低(P<0.05)，墨旱蓮各給藥組組間比較無顯著性差異(P>0.05)，見表1。表明墨旱蓮能夠緩慢、有效地減輕高脂喂養(yǎng)小鼠的體質(zhì)量。

表1 各組小鼠體質(zhì)量、體長、Lee’s指數(shù)和BMI的比較Table 1 Comparison of the body weight,body length,Lee’s index and BMI of the mice in each group

3.2 墨旱蓮對小鼠肝臟、腹部及腎周脂肪重量的影響 給藥6周后，與對照組比較，高脂模型組小鼠肝臟重量、肝臟重量與體質(zhì)量比值、腹部及腎周脂肪重量、脂肪重量與體質(zhì)量比值均有顯著改變(P<0.05)；與高脂模型組比較，中、高劑量墨旱蓮給藥組小鼠腹部及腎周脂肪重量、脂肪重量與體質(zhì)量比值顯著降低(P<0.05)，見表2。由表2可見，墨旱蓮降低腹部及腎周脂肪重量具有明顯優(yōu)勢。

表2 給藥6周后各組小鼠的肝臟重量、肝臟重量與體質(zhì)量比值、腹部及腎周脂肪重量、脂肪重量與體質(zhì)量比值Table 2 Liver weight,liver weight/body weight ratio,fat weight,abdominal and perirenal fat weight/body weight ratio of the mice in each group after 6 weeks of medication

3.3 墨旱蓮對小鼠肝臟組織形態(tài)學(xué)的影響 給藥6周后，觀察小鼠肝組織形態(tài)學(xué)變化(見圖1)。由圖1可見，對照組小鼠肝細胞形態(tài)規(guī)整，胞質(zhì)均勻，胞核清晰，細胞大小一致，細胞間分界清楚，無病變、脂肪滴和炎性浸潤。高脂模型組小鼠肝細胞排列不規(guī)則，有大量的脂肪空泡，細胞質(zhì)、細胞核多消失，肝細胞呈片狀死亡。與高脂模型組比較，高劑量墨旱蓮給藥組小鼠肝組織細胞質(zhì)、細胞核清晰可見，肝臟組織中脂肪滴明顯減少，空泡樣變性和細胞壞死較少，肝細胞受損情況顯著好轉(zhuǎn)，表明高劑量墨旱蓮預(yù)防和改善高脂喂養(yǎng)小鼠肝臟脂肪變性的效果更佳。墨旱蓮低、中劑量給藥組與高脂模型組比較無明顯差異。

3.4 墨旱蓮對小鼠血清各項生化指標的影響 給藥6周后，與對照組比較，高脂模型組小鼠血清TC、TG水平顯著升高(P<0.05)。與高脂模型組比較，高劑量墨旱蓮給藥組小鼠血清TC、TG水平顯著降低(P<0.05)，而低、中劑量墨旱蓮給藥組小鼠血清各項生化指標均無明顯變化(P>0.05)。小鼠肝臟FFA含量在對照組中最低，在高脂模型組中最高，高、中、低劑量墨旱蓮給藥組次之，但各組間比較均無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，見表3。由表3可見，墨旱蓮早期對肝功能和糖原影響較小，但可啟動降脂機制，墨旱蓮對肝臟脂肪變性的預(yù)防和保護作用主要是通過降低TC、TG來實現(xiàn)的。

表3 給藥6周后各組小鼠血清生化指標的變化Table 3 Changes in serum biochemical indexes of the mice in each group after 6 weeks of medication

4 討 論

高脂血癥是由于脂質(zhì)代謝紊亂引起的，可引起脂肪肝、動脈粥樣硬化等疾病。血脂升高主要有以下幾方面的原因：(1)肝細胞轉(zhuǎn)載TG的能力降低[3]；(2)低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDLR)的活性降低，引起膽固醇的蓄積[3]；(3)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)增加[4]；(4)FFA對肝細胞的損傷[5]等。

墨旱蓮的降脂作用機制是抑制膽固醇的合成還是促進肝臟的脂質(zhì)代謝，目前仍無定論。本研究結(jié)果顯示，高劑量墨旱蓮給藥組小鼠的TC和TG水平均顯著降低(P<0.05)，說明墨旱蓮對肝臟脂肪變性的保護作用可能是通過降低TC和TG水平來實現(xiàn)的，這與墨旱蓮可調(diào)節(jié)大鼠血脂的研究結(jié)果一致[1]。另一方面，墨旱蓮乙醇提取物可提高血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的活性，降低高脂血癥小鼠肝組織中的丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量[6]，降低3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutary CoA reductase，HMGR)的表達。HMGR是膽固醇生物合成中的關(guān)鍵酶，通過下調(diào)HMGR的表達可抑制膽固醇的生成，還能增加肝臟過氧化物酶增殖體激活受體α(PPARα)和LDLR mRNA的表達水平。PPARα可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和脂肪酸代謝相關(guān)蛋白基因的表達，從而改善動脈粥樣硬化。LDLR可清除肝臟循環(huán)中的低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)；增加卵磷脂膽固醇脂酰轉(zhuǎn)移酶(lecithin-cholesterol transferase，LCAT)和B類Ⅰ型清道夫受體(scavenger receptor class B type Ⅰ receptor，SR-B1) 的表達，LCAT可將膽固醇轉(zhuǎn)化成膽固醇酯，并在膽固醇逆向轉(zhuǎn)運的過程中發(fā)揮作用[7]，SR-B1是高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)的受體，能夠介導(dǎo)HDL膽固醇酯的選擇性吸收，可參與膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運[8]。這些說明墨旱蓮加速脂質(zhì)代謝的作用可能與膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運有關(guān)，以及與肝臟脂質(zhì)代謝和脂肪酸氧化相關(guān)受體的上調(diào)有一定的關(guān)系，如PPARα、LDLR、LCAT和SR-BI等受體。

墨旱蓮的保肝作用可能與其黃酮類成分有關(guān)，墨旱蓮中的黃酮類成分含有豐富的酚羥基，具有較強的抗氧化作用，推測其具有保肝作用[9]，可對抗FFA對肝細胞的損傷。高脂血癥可導(dǎo)致肝臟中活性氧自由基和脂質(zhì)過氧化水平增加。墨旱蓮中的蟛蜞菊內(nèi)酯成分可以通過清除氧自由基，減少脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)，從而降低氧自由基對肝細胞的損害[10]。倪鴻昌等[11]的研究顯示，繼續(xù)給予高脂血癥模型大鼠高脂喂養(yǎng)后，肝臟可出現(xiàn)明顯的炎性病變，肝功能有不同程度的損害，肝組織勻漿中MDA顯著升高，目前認為MDA在肝組織脂肪變和肝損傷方面起重要作用。石變?nèi)A等[6]的研究也指出，墨旱蓮水煎劑可以提高肝臟組織中SOD的活性，降低MDA含量，并呈劑量依賴性，從而延緩肝臟的衰老。在ZHAO等[7]的研究中，利用倉鼠建立高脂模型，倉鼠的肝細胞受損后，喂養(yǎng)70%乙醇提取的墨旱蓮，結(jié)果顯示墨旱蓮可顯著降低LDL水平，減少脂質(zhì)的合成和釋放，促進血漿中脂質(zhì)的清除。但本研究中的小鼠并未出現(xiàn)明顯的肝功能異常，而且與高脂模型組比較，低、中、高劑量墨旱蓮給藥組均未發(fā)現(xiàn)肝臟組織中FFA的含量有顯著性降低，這可能與本研究中小鼠的肝功能未發(fā)生顯著異常有關(guān)，也可能與小鼠喂養(yǎng)周期的長短有關(guān)。

本研究結(jié)果表明，墨旱蓮具有顯著的降脂作用，但由于本研究未測定小鼠肝臟組織中MDA和SOD的含量，故不能有效評價墨旱蓮的保肝作用。在后期的研究中，將增加更多的生化指標，為墨旱蓮在肝臟脂代謝方面的研究提供更多的參考數(shù)據(jù)。