羅在柒 陸 俊 李榮京 李 治 珍李蘭

（貴州省林業(yè)科學(xué)研究院，貴州貴陽550005）

貴州金花茶的模式標(biāo)本于1958年由中國(guó)科學(xué)院植物研究所的曹子余先生采自貴州省冊(cè)亨縣山區(qū)，被鑒定為中越山茶（Camellia indochinensisMerr），1993年昆明植物所的閣天綠等將其定名為貴州金花茶［1］，但張宏達(dá)等進(jìn)一步將分布在冊(cè)亨的論證為離蕊金花茶（Camellia liberofilamentaH.T.Chang et C.H.Yan）［2］，分布于貴州省南部羅甸縣大亭鄉(xiāng)的金花茶為貴州金花茶。貴州金花茶自然分布地域狹窄、種群數(shù)量少，加之遭受人為采挖、生境破壞等影響，如今野生植株數(shù)量甚微，野生種群處于瀕危滅絕的狀態(tài)。

貴州金花茶除了歸屬金花茶組共享“植物界的大熊貓”“茶族皇后”等聲譽(yù)外，其皆具觀賞價(jià)值、開發(fā)應(yīng)用價(jià)值和科學(xué)研究?jī)r(jià)值。其花具有極高的觀賞價(jià)值，富含微量元素、氨基酸，以及黃酮、多糖等400多種人體必需的活性成分物質(zhì)［3-5］。前期研究表明，貴州金花茶除具備茶飲保健功能外，還具有藥用功效，尤其在眼疾、皮膚病、心腦血管類后遺癥、糖尿病、高血壓、高膽固醇、高血脂和腸胃消化系統(tǒng)等疾病康復(fù)方面均有不俗表現(xiàn)［6-9］，具備食用和藥用開發(fā)價(jià)值。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列間區(qū)（Inter-simple Sequence Repeat，ISSR）［10］分子標(biāo)記技術(shù)的引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，多態(tài)性豐富，重復(fù)性好，成本低，同時(shí)兼有擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）、簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記（Simple Sequence Repeats，SSR）和隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo) 記（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，已被應(yīng)用于植物品種鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位和輔助育種等研究［11，12］。

近年來，貴州省羅甸縣把金花茶產(chǎn)業(yè)作為發(fā)展地方經(jīng)濟(jì)、助力脫貧攻堅(jiān)的主抓產(chǎn)業(yè)，但是產(chǎn)業(yè)發(fā)展面臨種苗繁育、種植問題，尤其是急需摸清種質(zhì)資源特征，因此要把好種苗源頭關(guān)。因此，本研究采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)，開展對(duì)現(xiàn)存資源遺傳多樣性和DNA指紋圖譜特性的研究，對(duì)進(jìn)一步深度開發(fā)和利用貴州金花茶奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

貴州金花茶（Camellia guizhouensisS.Y.Liang et T.L.Ming）新鮮葉片分別采集于羅甸縣冒井鎮(zhèn)大亭社區(qū)原生地周邊村寨、羅甸境內(nèi)企業(yè)以及貴州省林業(yè)科學(xué)研究院樹木園引種植株（見表1）。試驗(yàn)采用3個(gè)原生植株和8個(gè)引種植株，將普通油茶（Camellia oleiferaAbel.）作為對(duì)照。

表1供試樣品采集信息

由加拿大哥倫比亞大學(xué)設(shè)計(jì)100條ISSR引物序列UBC，編號(hào)依次為UBC 001～100。DNA提取試劑盒、瓊脂糖、Good View核酸染料、100 bp DNA ladder、2×Tap Master Mix和50×loading Buffer等均為BIOMIGA公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取及檢測(cè)。稱取0.5 g新鮮葉片，液氮磨碎，使用BIOMIGA公司試劑盒提取DNA樣品，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為110 V、30 min。將成功提取的DNA樣品放入-40℃冰箱保存。

1.2.2 PCR擴(kuò)增及檢測(cè)。使用上海生物技術(shù)有限公司合成的100對(duì)ISSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選出其中多態(tài)性條帶較好的20對(duì)引物進(jìn)行多態(tài)性擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為總量20μL，其中2×Tap Master Mix 10μL、引物2μL、DNA模板1μL、ddH2O 7μL。

PCR擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，52℃退火30 min，72℃延伸30 min，35個(gè)循環(huán)，72℃退火5 min。

PCR檢測(cè)采用2%瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行電泳，電泳條件為電壓110 V、80 min。之后在Tanon-2500數(shù)碼凝膠圖像分析儀上拍照保存，進(jìn)行條帶分析。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析。使用NTSYS2.1軟件對(duì)各樣品的PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行聚類分析，做出相應(yīng)聚類圖，分析各品種間的遺傳距離。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增與遺傳多樣性分析

獲得高質(zhì)量的DNA為模板，對(duì)100對(duì)通用引物進(jìn)行篩選，共選出22對(duì)擴(kuò)增效果較好、條帶清晰的引物序列。擴(kuò)增出的條帶大小在100～1 300 bp，共擴(kuò)增出440條帶，其中多態(tài)性條帶為385條，多態(tài)性占比為87.5%，結(jié)果表明供試材料的ISSR多態(tài)性較豐富。

利用5條引物擴(kuò)增出來的440譜帶建立11個(gè)金花茶品種的遺傳相似系數(shù)矩陣，見表2。各樣品之間的相似系數(shù)在0.39～0.84，平均相似系數(shù)為0.66，說明貴州金花茶樣品具有較高的遺傳多樣性。其中，田壩組1號(hào)和縣城益豐緣苗圃基地相似系數(shù)最大，為0.84，表明2個(gè)樣品之間的親緣關(guān)系相對(duì)較近；五湖公司基地9號(hào)與普通油茶相似系數(shù)最小，僅為0.39，表明9號(hào)與其他樣品的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，該植株為廣西引種，是否為貴州金花茶需進(jìn)一步鑒定。

2.2 貴州金花茶親緣關(guān)系聚類分析

對(duì)這22對(duì)引物做進(jìn)一步篩選，共篩選出擴(kuò)增效果較好、特異性強(qiáng)的UBC817、UBC825、UBC827、UBC844和UBC845這5對(duì)引物，共擴(kuò)增出76個(gè)不同位點(diǎn)，其中多態(tài)性位點(diǎn)為63處，多態(tài)性為82.89%。Ntsys2.10軟件對(duì)11種金花茶的ISSR結(jié)果進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖1，系數(shù)為0.693時(shí)，10個(gè)貴州金花茶供試樣品分為2個(gè)組，即1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)、4號(hào)、7號(hào)為一組，5號(hào)、6號(hào)、9號(hào)、10號(hào)為另一組，8號(hào)普通油茶作為對(duì)照組。

2.3 特異條帶分析與指紋圖譜構(gòu)建

使用選定的5個(gè)擴(kuò)增條數(shù)多、條帶清晰、特異性強(qiáng)的引物用作11供試樣品的指紋圖譜構(gòu)建。擴(kuò)增結(jié)果如圖2至圖6所示，U817號(hào)引物擴(kuò)增的條帶大小在130～700 bp，共擴(kuò)增出18位點(diǎn)，多態(tài)性位點(diǎn)為14處，多態(tài)性占比77.7%，可區(qū)分1號(hào)、2號(hào)、5號(hào)、7號(hào)、11號(hào)；U825號(hào)引物擴(kuò)增的條帶大小在190～1 100 bp，共擴(kuò)增出19條帶，多態(tài)性條帶為17條，多態(tài)性占比89.5%，可區(qū)分6號(hào)、9號(hào)、11號(hào)；U827號(hào)引物擴(kuò)增的條帶大小在200～1 250 bp，共擴(kuò)增出16條帶，多態(tài)性條帶為12條，多態(tài)性占比75%，可區(qū)分4號(hào)；U844號(hào)引物擴(kuò)增的條帶大小在100～600 bp，共擴(kuò)增出12條帶，多態(tài)性條帶為8條，多態(tài)性占比66.6%，可區(qū)分3號(hào)。U845號(hào)引物擴(kuò)增的條帶大小在120～830 bp，共擴(kuò)增出12條帶，多態(tài)性條帶為8條，多態(tài)性占比66.6%，可區(qū)分3號(hào)。根據(jù)10個(gè)ISSR引物的擴(kuò)增結(jié)果，篩選出引物UBC017、UBC025、UBC027和UBC045擴(kuò)增的51個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)構(gòu)建的DNA指紋圖譜，可用于鑒定供試10個(gè)貴州金花茶樣本。

表2遺傳相似系數(shù)矩陣

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)采用ISSR分子標(biāo)記對(duì)10份貴州金花茶材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果表明貴州金花茶材料之間遺傳變異較豐富，同時(shí)呈現(xiàn)地域差異小的特點(diǎn)。樣品遺傳聚類分為2組，與調(diào)查過程中發(fā)現(xiàn)花瓣小花和大花2個(gè)類型相吻合，小花類型相對(duì)原生性相對(duì)較強(qiáng)，大花類型形態(tài)與離蕊金花茶較為相似，兩者之間的親緣關(guān)系仍值得深入研究。

本研究結(jié)果表明ISSR分子標(biāo)記對(duì)貴州金花茶的親緣關(guān)系具有很好的分類效果，可為貴州金花茶育種的親本、雜種優(yōu)勢(shì)選擇以及苗木品質(zhì)鑒別提供理論基礎(chǔ)，對(duì)物種保護(hù)和產(chǎn)業(yè)化育苗種苗鑒別提供技術(shù)支持。