劉俊 陳舒 應(yīng)璇 葉曉霞 董揚 王文標(biāo)

心房顫動(簡稱房顫)是最常見的心律失常,其中呈現(xiàn)明顯家族性者稱為家族性房顫(familial atrial fibrillation,FAF)。房顫電生理機制和病理生理機制復(fù)雜,發(fā)病機制尚未完全清楚。目前,越來越多的學(xué)者將研究的目光投放在遺傳因素上[1－2]。據(jù)流行病學(xué)研究報道,30%的房顫患者具有房顫家族史[3],5%的典型房顫患者以及15%的孤立性房顫患者呈現(xiàn)明顯家族遺傳性[4],說明FAF患者數(shù)目可能比預(yù)想中的要多。與此同時,學(xué)者們從龐大的基因組中探尋到數(shù)種可能與房顫相關(guān)的基因變異[5],然而尚少見關(guān)于FAF相關(guān)致病基因的研究。這些遺傳變異影響了離子通道、電傳導(dǎo)、信號傳導(dǎo)通路等生理機制,最終破壞正常電興奮[6－7]。因此,對FAF致病基因的研究不僅是為明確突變位點,還能探索遺傳因素導(dǎo)致房顫發(fā)生的分子學(xué)機制,為挖掘其他類型房顫發(fā)生機制提供新的思路與理論依據(jù)。本研究基于此,筆者對比已知房顫 相 關(guān) 基 因KCNQ1、KCNE2、SCN5A、KCND3、CJA5、ACC9在FAF、非FAF患者以及正常無房顫者間的檢出率,研究上述致病基因與FAF相關(guān)性及其對后者的預(yù)測價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象及分組

應(yīng)用隨機數(shù)字表法選取2017年1月至2018年10月間于金華市人民醫(yī)院就診的40例FAF 患者作為FAF組,并選取20例同期非家族性房顫患者納入非FAF組,以及納入20例正常無房顫者作對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)[8]:①FAF 組具有明顯家族史,遺傳模式符合孟德爾遺傳模式,三代親屬中≥3例發(fā)病,患者心電圖、動態(tài)心電圖或植入式起搏器等監(jiān)測到房顫心電圖；②年齡:20～50歲；③已簽署知情同意書；④非FAF組和對照組患者三代親屬中均無遺傳性心律失常及遺傳性心臟離子通道病,非FAF組有明確房顫病因(如甲亢、高血壓性心臟病、擴張型心肌病等)。排除標(biāo)準(zhǔn):①半年內(nèi)存在心肌梗死病史；②近1月內(nèi)接受心臟手術(shù)者；③紐約心臟病協(xié)會(NYHA)分級3、4級心力衰竭者；④存在嚴(yán)重心臟瓣膜病變、甲狀腺功能減退、水電解質(zhì)紊亂、嚴(yán)重肺功能障礙者；本實驗設(shè)計已由醫(yī)院倫理學(xué)委員會審核。

1.2 方法

所有入組研究對象于門診或入院后24 h內(nèi)被收集病史、既往史、年齡、身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)、心電圖結(jié)果等基本信息。

1.2.1 基因組DNA 的提取 采集所有入組人員外周抗凝血6 ml,應(yīng)用QIAamp DNA Blood Mini Kit(NO.51106)試 劑 盒(購 自 德 國QIAGEN 公司)對樣本進行基因組DNA 提取。DNA 質(zhì)量濃度≥50 ng/μL,吸光度(A)260/A280為1.8～2.0,DNA 總量≥6μg。

1.2.2 目標(biāo)基因測序 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫獲取致病基因(KCNQ1、KCNE2、SCN5A、KCND3、CJA5、ACC9)所對應(yīng)的序列(具體交由杭州本因生物科技有限公司完成),使用安捷倫SureSelect靶向序列捕獲系統(tǒng)設(shè)計特異性寡核苷酸鏈探針,其中包含目標(biāo)基因所有外顯子區(qū)域、外顯子和內(nèi)含子交界區(qū)域以及全部基因的5′和3′末端。將1μg基因組DNA樣本打斷成長為200～500 bp的片段,末端補平、加“A”,與寡核苷酸混合物接頭銜接,將所得產(chǎn)物進行PCR 反應(yīng)擴增、純化,構(gòu)建DNA 文庫并對其行質(zhì)量檢測。預(yù)先設(shè)計的特異性捕獲探針與合格的DNA文庫雜交、富集后,將富集的外顯子區(qū)域的DNA 片段洗脫下來,并檢測富集效率。然后,應(yīng)用第二代高通量測序技術(shù)將捕獲的DNA 文庫在Illumina HiSeq TM2000平臺(美國Illumina公司提供)上對目標(biāo)序列進行測序,測序深度200X,得到原始數(shù)據(jù)并確保所有檢測樣品均達到預(yù)期測序標(biāo)準(zhǔn),Q30平均比例在80%,平均錯誤率在0.1%以下。探針設(shè)計標(biāo)準(zhǔn)、捕獲條件、基因組DNA 與捕獲探針比例參考文獻[9]。

1.2.3 生物學(xué)信息分析 應(yīng)用Illumina basecalling Software 1.7 軟件對原始測序數(shù)據(jù)進行處理和控制,并將其與NCBI人類基因組DNA(GRCh37/hg19)參照序列對比。應(yīng)用GATK、AtlasSNP、Atlaslndel2軟件分析并獲得單核苷酸多態(tài)性、小插入與小缺失變異相關(guān)信息,了解樣本中的DNA 序列變異。將檢測獲得的DNA 變異序列信息與1000 Genome、dbSNPI 35、NHLBIexome sequencing database、NIEHS exome sequencing database數(shù)據(jù)庫進行對比,去除高于0.5%的隱形突變、高于0.1%的顯性突變、對蛋白功能無影響的突變,最終得到FAF相關(guān)突變位點。本研究所納入的KCNQ1、KCNE2、SCN5A 等致病基因中,若檢測出錯義突變或有意義的堿基突變則計作陽性(＋),由此計算致病基因突變檢出率。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 25.0 版統(tǒng)計學(xué)軟件分析,年齡、體重、BMI等采用(±s)表示,組間比較采用兩獨立樣本t檢驗,三組間比較采用方差分析,兩兩比較采用bonferroni校正。計數(shù)資料用例數(shù)和百分?jǐn)?shù)表示,采用χ2檢驗,應(yīng)用多因素Logistic回歸分析探究致病因子與FAF 相關(guān)性,以P＜0.05 為差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 三組一般臨床資料比較

三組年齡、性別、體重、BMI等資料比較均無明顯差異(P＞0.05),見表1。

2.2 三組致病基因突變檢測結(jié)果比較

三組致病基因KCNQ1、KCNE2、SCN5A 突變檢出率存在統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05),而KCND3、CJA5、ACC9基因突變檢出率無明顯差異(P ＞0.05),見表2。

表2 三組致病基因突變檢測結(jié)果比較[(n)%]

2.3 致病基因突變與FAF相關(guān)性比較

根據(jù)三組患者致病基因檢出率結(jié)果,選擇其中P＜0.05的3個可能與FAF 相關(guān)的致病基因進行Logistic回歸分析。分析顯示,致病基因KCNQ1、SCN5A、KCNE2突變均為FAF 的獨立危險因素,見表3。

表3 FAF致病基因Logistic回歸結(jié)果

2.4 致病基因KCNQ1(＋)、KCNE2(＋)、SCN5A(＋)單獨診斷FAF的診斷效能比較

不同致病基因單獨檢測的診斷效能比較均無明顯差異(P＞0.05),見表4。

2.5 不同致病基因突變聯(lián)合檢測方式對FAF的診斷效能比較

KCNQ1(＋)、KCNE2(＋)、SCN5A(＋)三者兩兩聯(lián)合檢測與三者聯(lián)合檢測的診斷效能比較無明顯差異(P＞0.05),見表5。

表4 不同致病基因單獨診斷FAF的診斷結(jié)果比較

表5不同致病基因聯(lián)合檢測的診斷結(jié)果比較

3 討論

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展,越來越多的疾病被證實與基因突變相關(guān),自1997年Brugada首次發(fā)現(xiàn)房顫相關(guān)染色體位點以來,目前至少17個房顫致病基因已被人們發(fā)現(xiàn)[10]。但有關(guān)FAF的相關(guān)研究局限在白種人群,在亞洲人群中的研究甚少。為豐富這一領(lǐng)域的研究,筆者收集了40例FAF 患者的基因組DNA,將之于非FAF患者、正常群體進行對比,發(fā)現(xiàn):三組致病基因KCNQ1、KCNE2、SCN5A突變檢出率存在統(tǒng)計學(xué)意義；致病基因KCNQ1、SCN5A、KCNE2突變均為FAF 的獨立危險因素,說明KCNQ1、KCNE2、SCN5A 與FAF的發(fā)生密切相關(guān)。姜永日等[4]報道:KCNQ1 基因編碼的KCNQ1亞基可與KCNE1亞基結(jié)合形成通道復(fù)合體,構(gòu)建成的緩慢激活延遲整流鉀通道IKS在動作電位時發(fā)生失活,導(dǎo)致房顫發(fā)生；KCNE2可影響KCNQ1-KCNE2通道功能,縮短心肌細胞動作電位間期,從而啟動房顫。Ilkhanoff等[11]研究中發(fā)現(xiàn),SCN5A 基因H558R 位點多態(tài)性與房顫的發(fā)生、發(fā)展有著緊密的聯(lián)系,SCN5A 基因變異rs7629265可使非洲裔美國人房顫風(fēng)險提升74%,并與PR 間期的縮短有關(guān)。本實驗中,筆者采用新一代高通量測序技術(shù)對研究對象DNA 文庫進行測序,相比傳統(tǒng)第一代Sanger測序技術(shù),前者具有檢測速度快、準(zhǔn)確性高、覆蓋度廣等特點[12]。通過實驗,筆者認(rèn)為致病基因KCNQ1、KCNE2、SCN5A 可能與FAF發(fā)生具有一定相關(guān)性,這一結(jié)論可能給往后FAF相關(guān)基因多態(tài)性的研究提供理論依據(jù)。而本實驗樣本量較少,地域局限,未對比漢族與其他民族的實驗結(jié)果差異,有待今后進一步的擴展研究。

挖掘FAF相關(guān)基因突變,可為從遺傳學(xué)和分子生物學(xué)上揭示房顫致病機制帶來一定的線索,同時也是為實現(xiàn)FAF基因診斷、研發(fā)特異性治療方法帶來新的希望。越來越的研究表明房顫發(fā)病與多個基因的多態(tài)性有關(guān),在本實驗中,致病基因KCNQ1、KCNE2、SCN5A 突變情況單獨診斷FAF的診斷效能較低,不同致病基因突變情況單獨檢測的診斷效能比較均無明顯差異,因此單獨致病基因檢測的診斷效能可能并不理想。本文中KCNQ1(＋)與KCNE2(＋)和SCN5A(＋)聯(lián)合檢測時靈敏度和特異度分別為95.0%、67.5%,相對單獨檢測和兩兩聯(lián)合檢測,三者聯(lián)合檢測可取得較高的靈敏度,但兩兩聯(lián)合檢測與三者聯(lián)合檢測的診斷效能比較并無明顯差異。Olesen等[13]報道單基因突變在孤立性房顫和FAF中雖然存在,但是較為罕見。單個基因突變所致的房顫只占全部房顫患者中的極少部分,更多的FAF及普通房顫患者的發(fā)病原因可能是由多個基因突變或基因-環(huán)境相互作用引起的。因此,為提高基因檢測對FAF的診斷效能,我們建議將KCNQ1(＋)、KCNE2(＋)、SCN5A(＋)三者兩兩聯(lián)合檢測或三者聯(lián)合檢測以獲得更理想的診斷靈敏度,這不僅有助于提升基因檢測對FAF的預(yù)測價值,提早對患者進行健康干預(yù),同時也有助于發(fā)現(xiàn)更多的FAF患者。然而本實驗樣本較少,至于診斷效能最理想的致病基因聯(lián)合檢測方式還有待進一步的研究。