馮淑月 黃玥明 張偉 王士杰
[摘 要] 本文對桔梗組織培養(yǎng)技術(shù)研究現(xiàn)狀及存在的關(guān)鍵性技術(shù)問題展開綜述,針對褐化因素、污染、玻璃化等影響組培效果的主要問題給出相應(yīng)解決措施,以期為桔梗組織培養(yǎng)規(guī)?;a(chǎn)提供理論基礎(chǔ)。
[關(guān)鍵詞] 桔梗;組織培養(yǎng);褐變;污染
[中圖分類號] S567.239 [文獻標(biāo)識碼] B [文章編號] 1674-7909(2020)21-94-2
桔梗(Platycodon grandiflorum)又名六角荷、鈴鐺花等,其根可入藥,為桔??贫嗄晟荼局参铮俏覈S玫闹匾兴幉?,主產(chǎn)于我國東北、華北、華東、華中等地區(qū),在世界各個地區(qū)均廣泛種植[1]。植物組織培養(yǎng)技術(shù)指的是基于植物細胞全能性進行植物培育研究的一種技術(shù)[2]。目前,桔梗組織培養(yǎng)中存在諸多因素影響桔梗愈傷組培誘導(dǎo)和培養(yǎng),且存在易褐化、玻璃化等問題,同時污染問題是影響桔梗組培效果的主要因素,亟待優(yōu)化上述問題。
1 桔梗組織培養(yǎng)外植體選擇及過程
1.1 桔梗組織培養(yǎng)外植體的選擇
桔梗的外植體選擇對后續(xù)試驗的有序進行有重要影響。桔梗外植體不同生理部位和生理狀態(tài)的不同,誘導(dǎo)效果和誘導(dǎo)出愈傷組織的誘導(dǎo)率也不同。采用桔梗葉片、莖段和根作為外植體,后續(xù)培養(yǎng)過程中均具有誘導(dǎo)出愈傷組織且發(fā)育成苗的能力。嚴(yán)一字等采用無菌苗的葉片、莖段和根段作為試驗材料,培養(yǎng)時均能誘導(dǎo)出愈傷組織,還發(fā)現(xiàn)不同外植體在誘導(dǎo)培養(yǎng)階段最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基的配比不同[3]。誘導(dǎo)階段選用葉、莖段和上胚軸作為外植體比較發(fā)現(xiàn),上胚軸作為外植體可以縮短誘導(dǎo)時間,且可以簡化培養(yǎng)基。
1.2 桔梗組織培養(yǎng)過程
1.2.1 初代培養(yǎng)。目前,植物組織培養(yǎng)中最常見的培養(yǎng)基有MS、B5、White、N6、WPM和Anderson等種類。研究表明,以葉片作為外植體時選用N6培養(yǎng)基可以直接誘導(dǎo)出苗,效果最好,莖段為外植體時選用MS培養(yǎng)基效果最好。曲生嬌在誘導(dǎo)叢生芽階段以帶葉節(jié)莖段、葉片作為外植體,利用MS基本培養(yǎng)基并添加0.3 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA[4]。王桂梅等以桔梗莖段作為外植體,附加不同濃度的6-BA和NAA,得出最佳誘導(dǎo)桔梗外愈傷組織的配方為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.5mg/L[5]。較高濃度的6-BA有利于愈傷組織的形成,但濃度過高會誘導(dǎo)腋芽形成簇狀分生組織,影響小苗的形成速度。
1.2.2 繼代培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)的基本培養(yǎng)基與初代誘導(dǎo)培養(yǎng)及類型基本一致,但目的不同。秦梅等在增值培養(yǎng)時發(fā)現(xiàn)6-BA濃度過高或過低均會抑制側(cè)芽的萌發(fā),影響繼代材料的擴大[6]。張燕等在桔梗叢芽增值試驗時,使NAA濃度相同,隨著6-BA濃度的增加,小苗的增值倍數(shù)也增加,說明6-BA對桔梗繼代誘導(dǎo)起促進作用[7]。繼代培養(yǎng)時,發(fā)現(xiàn)隨著NAA濃度增加,叢生芽的增值倍數(shù)呈現(xiàn)負相關(guān)。
1.2.3 生根培養(yǎng)。桔梗的組培苗不添加外源激素均能生根,但根和苗的長勢均較弱。在桔梗生根培養(yǎng)時,隨著NAA濃度的升高生根數(shù)和生根率均會升高,但NAA濃度過高時,生根時間會延長,生根數(shù)、生根率均會降低。
2 桔梗組織培養(yǎng)中存在的問題
2.1 褐變現(xiàn)象
褐變又稱“褐化”,是指培養(yǎng)材料向培養(yǎng)基中釋放褐色物質(zhì),致使培養(yǎng)基逐漸褐變,培養(yǎng)材料隨之褐變甚至死亡的現(xiàn)象。桔梗組織培養(yǎng)引起褐化的主要機理是酶促反應(yīng)[8],造成褐變的原因有很多,主要包括植物的種類和基因型、外植體的類型和生理狀態(tài)、外植體的大小和采樣時間、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基成分等。
2.2 污染現(xiàn)象
污染是指在植物組織培養(yǎng)過程中,由于真菌、細菌等微生物的侵染,在培養(yǎng)容器中滋生大量的菌斑,導(dǎo)致培養(yǎng)材料不能正常生長發(fā)育的現(xiàn)象[9]。在桔梗的組織培養(yǎng)過程中,污染常有發(fā)生,造成污染的原因有很多。例如,器具消毒不徹底,外植體滅菌不徹底,接種操作不當(dāng),接種環(huán)境不干凈,超凈工作臺區(qū)域被污染,外植體材料內(nèi)部消毒不徹底等均會引發(fā)污染,以上因素均是組織培養(yǎng)過程中較難控制的問題。
2.3 玻璃化現(xiàn)象
玻璃化是指在培養(yǎng)過程中培養(yǎng)材料呈半透明狀態(tài),結(jié)構(gòu)組織發(fā)育成畸形的現(xiàn)象。玻璃化現(xiàn)象一般出現(xiàn)在繼代培養(yǎng)過程中。細胞分裂素濃度過高,細胞分裂素與生產(chǎn)素相對含量高,培養(yǎng)基中離子種類比例不適、瓊脂和蔗糖濃度過低,培養(yǎng)條件不適宜,如不良培養(yǎng)環(huán)境、溫度過高、光照時間不足和通氣不良等因素均會引起玻璃化現(xiàn)象。
3 解決桔梗組織培養(yǎng)問題的有效措施
3.1 褐變防治措施
首先,桔梗組織培養(yǎng)過程中,選擇外植體時,生長季節(jié)植物體內(nèi)的酚類化合物較多,所以盡量選擇在早春或者晚春取材,一般選擇幼齡植株嫩莖作為外植體。外植體切口越大越容易發(fā)生褐化,外植體選材宜大不宜小,外植體切口宜小不宜大。其次,培養(yǎng)材料預(yù)處理時,要采用流水沖洗,在5 ℃左右處理12~24 h,消毒后接種在只含有蔗糖的培養(yǎng)基上5~7 d,使外植體中的酚類物質(zhì)部分滲透到培養(yǎng)基中。取出外植體,用科學(xué)的方法清洗干凈,再接種到適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中,可在一定程度上避免外植體褐化。其次,培養(yǎng)基應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)臒o機鹽成分、蔗糖濃度、激素水平與組合以及添加一些抗褐變劑,可減輕褐變的發(fā)生。添加抑制劑、吸附劑、活性炭、抗壞血酸可有效減輕組織培養(yǎng)過程中的酶促褐化現(xiàn)象。加入抗壞血酸的培養(yǎng)基發(fā)生褐變的概率小于不加的培養(yǎng)基。檸檬酸等也能夠有效避免或減輕褐變現(xiàn)象。培養(yǎng)初期應(yīng)嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件,采用低溫(15~20 ℃)、黑暗、弱光環(huán)境,可有效防止高光和高溫引起褐化。對容易發(fā)生褐變的材料可間隔12~24 h再轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng),這樣連續(xù)處理7~10 d后,褐變現(xiàn)象會得到一定程度的控制。
3.2 污染防治措施
首先,進行組培室的消毒滅菌。保證組培接種室無菌、干凈、整潔,能夠有效防止污染。每周對組培室進行一次大掃除和徹底的消毒滅菌;接種室和培養(yǎng)室要求密閉、干燥、保持與外界環(huán)境相對隔絕的狀態(tài),減少與外界的空氣對流及微生物與塵埃的浸入,嚴(yán)格控制光照、溫度、濕度、空氣等各種生態(tài)因子。其次,加強培養(yǎng)容器和培養(yǎng)基的消毒滅菌處理。培養(yǎng)瓶、試管等容器和封口用的蓋子、耐高溫的塑料膜等物品在用前均要經(jīng)過徹底清洗、晾干。配制好的培養(yǎng)基分裝后應(yīng)立即高壓蒸汽滅菌,放置兩三天,等到培養(yǎng)基表面和內(nèi)部無雜菌污染的情況下可認為滅菌徹底,進行接種工作。再次,注意無菌操作。接種工作人員應(yīng)嚴(yán)格按照無菌操作要求,規(guī)范熟練地進行每一步操作,可減少操作不當(dāng)引起的污染。最后,清除污染傳播源。組織培養(yǎng)過程中污染是不可避免的,一旦發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)污染物,應(yīng)及時處理污染培養(yǎng)瓶,把污染物從培養(yǎng)室轉(zhuǎn)移出去,再對污染物進行高壓滅菌消毒,清洗干凈待用[10]。
3.3 玻璃化防治措施
選擇外植體時,優(yōu)先考慮不易玻璃化的基因型及部位,選擇有助于降低玻璃化的頂芽作為外植體[11]。配制培養(yǎng)基時,添加外源生長調(diào)節(jié)劑如IAA、GA3、ABA,可減小玻璃化苗的出現(xiàn)。降低銨態(tài)氮濃度的同時提高硝態(tài)氮的含量,在大規(guī)模生產(chǎn)中成效顯著。適當(dāng)調(diào)整瓊脂濃度也可防止玻璃化的產(chǎn)生。添加有機物根皮苷、添加植物生長調(diào)節(jié)劑合成前體,如ACC,或添加適宜濃度的活性炭,均可有效抑制組培苗玻璃化的形成。改善培養(yǎng)條件,盡量采取光照培養(yǎng),在適宜的光照時間內(nèi)適當(dāng)提高光照強度;確定桔梗材料的適宜培養(yǎng)溫度范圍;選擇適宜的濕度條件;適當(dāng)?shù)耐L(fēng)降低培養(yǎng)容器中的濕度等,均有利于防止組培苗玻璃化現(xiàn)象發(fā)生。
4 結(jié)語
目前,藥用植物組織培養(yǎng)存在諸多不可調(diào)控因素,如培養(yǎng)條件、生長因子、污染原因、褐化現(xiàn)象和玻璃化因素等。目前,桔梗組織培養(yǎng)也僅限于試驗研究,不利于大規(guī)?;a(chǎn)。在科技迅速發(fā)展的今天,隨著植物生理學(xué)、生物化學(xué)、組織培養(yǎng)學(xué)、植物學(xué)等學(xué)科的不斷滲透及各方研究的不斷合作,將會逐步解決組織培養(yǎng)技術(shù)中的難題,避免不可控因素的出現(xiàn),保證組培效果。
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基金項目:吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新項目“桔梗的組織培養(yǎng)及抗鹽堿性研究”(2019007)。
作者簡介:馮淑月(1995—),女,本科在讀,研究方向:中草藥栽培與鑒定。
通信作者:王士杰(1978—),男,博士,副教授,研究方向:中草藥栽培與加工。