李延輝， 方茅， 謝敏如， 夏明汗

1東莞市石碣醫(yī)院病理科(廣東東莞 523290)； 2廣州醫(yī)科大學(xué)病理教研室(廣東廣州 511483)； 3暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科(廣東廣州 510630)

流行病學(xué)調(diào)查研究資料顯示乳腺癌發(fā)病率占所有威脅女性健康的惡性腫瘤的15.0%左右，已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)威脅女性生命最主要的疾病之一[1]。乳腺癌惡性程度高，進展快，大部分患者發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)中晚期甚至晚期，其治療仍是一個難點，患者往往發(fā)生全身轉(zhuǎn)移而導(dǎo)致病死率較高。近年來乳腺癌的分子生物靶向藥物治療新靶點已成為眾多學(xué)者關(guān)注和研究的熱點。因此，探討乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移等惡性進展的分子機制，從中尋找新的分子靶點，將為預(yù)估和干預(yù)乳腺癌的増殖、侵襲和遷移過程提供新的研究方向[2]。真核細(xì)胞起始因子(eIFs)屬于參與真核生物蛋白質(zhì)合成起始調(diào)控過程中的重要蛋白超家族，目前發(fā)現(xiàn)eIFs不僅參與了機體細(xì)胞生長、增殖的調(diào)節(jié)過程，更在腫瘤細(xì)胞惡性增殖和惡性轉(zhuǎn)化的過程中發(fā)揮重要作用。新近的文獻報道結(jié)果顯示eIF3的亞基eIF3b在包括乳腺癌在內(nèi)的各種惡性腫瘤中存在表達異常，并發(fā)現(xiàn)可能參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和遷移等惡性進展過程[3-4]。然而，以eIF3b為切入點，揭示調(diào)控乳腺癌增殖、侵襲和遷移的相關(guān)機制，目前國內(nèi)尚無相關(guān)報道。2019年9—11月，本研究以人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7為研究對象，通過設(shè)計eIF3b基因的小分子干擾RNA(siRNA)片段，沉默eIF3b基因后，觀察細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力的變化；并檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞遷移與侵襲標(biāo)志蛋白和抑遷移蛋白鈣黏蛋白E(E-cadherin)表達的變化，進而探討eIF3b基因在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展過程中的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料 乳腺癌細(xì)胞系MCF-7購自中科院上海細(xì)胞庫；10%胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基以及脂質(zhì)體lipofectamineTM2000均購自Hyclone公司，Total RNA提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司，BCA法蛋白定量測定試劑盒購自海門碧云天生物技術(shù)公司，eIF3b抗體購自Invitrogen公司(美國)，vimentin抗體、MMP-2抗體、MMP-9抗體和E-cadherin均購自Abcam公司，Transwell小室和Matrigel膠分別購自Corning公司和Bio-Rad公司，其余試劑和材料均購自Sigma Aldrich公司。中國上海博尚生物有限公司合成引物。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7放置于RPMI 1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)在培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境條件：37℃，5% CO2飽和濕度。

1.2.2 實驗分組和轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染實驗分3個組：Control組(空白對照組)、Scramble組(轉(zhuǎn)染非特異性對照組)和eIF3b-siRNA組(轉(zhuǎn)染eIF3b-siRNA組)。轉(zhuǎn)染實驗過程嚴(yán)格按Hyclone公司lipofectamineTM2000操作說明書進行轉(zhuǎn)染，其中eIF3b-siRNA組加入20 nmol/L轉(zhuǎn)染eIF3b-siRNA，而Scramble組加入20 nmol/L Scramble RNA，Control組不做任何處理，轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞。

1.2.3 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR法)檢測 嚴(yán)格按照Trizol RNA提取試劑盒說明書里的操作步驟進行提取總RNA實驗，提取各組細(xì)胞的總RNA后，按照RT-PCR逆轉(zhuǎn)試劑盒操作說明進行RT-PCR法反應(yīng)。eIF3b上游引物5′-CGGTGCCTTAGCGTTTGTG-3′，下游引物5′-CGGTCCTTGTTGTTCTTCTGC-3′。

1.2.4 Western blot法 嚴(yán)格按照試劑盒說明書里的操作步驟進行，提取轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞的總蛋白，應(yīng)用Bradford法對蛋白濃度進行測定；配制分離膠，進行蛋白電泳(120 V，90 min)；電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜50 min，加入5%脫脂牛奶室溫下封閉2 h；然后加入相應(yīng)一抗(eIF3b、vimentin、MMP-2、MMP-9和E-cadherin,稀釋比例均為1∶1 000)和小鼠抗人β-actin，孵育過夜；第2天加入二抗(稀釋比例均為1∶10 000)，室溫?fù)u床2 h后加入試劑顯影；運用Quantiy one軟件對蛋白條帶灰度值進行計算分析。

1.2.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率 將各組 MCF-7 細(xì)胞以每孔1×104·mL-1接種于96孔板，每組設(shè)3個復(fù)孔，分別在培養(yǎng)0、24、48、72和96 h后加入10 μL/孔的 CCK-8試劑液繼續(xù)培養(yǎng)2 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀對各孔進行吸光度(A)值檢測，在570 nm波長處檢測，重復(fù)檢測3次。細(xì)胞增殖抑制率的計算公式：(空白組A值-實驗組A值)/空白組A值×100%。

1.2.6 細(xì)胞遷移和侵襲實驗 遷移實驗時，收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，按 2×104個細(xì)胞/孔在Transwell小室的上室接種細(xì)胞，取含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基500 μL加入下室，置于培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)36 h后取出小室，立即用棉簽擦拭上室細(xì)胞，經(jīng)過固定染色后，在顯微鏡下觀察，隨機取5個視野計數(shù)遷移細(xì)胞(×100)，每組重復(fù)3次，取其平均值反映細(xì)胞遷移能力。侵襲實驗時，將含6.7% Matrigel膠(細(xì)胞外基質(zhì)膠)的培養(yǎng)液均勻鋪在Transwell小室的聚碳酸酯膜上，37℃條件下孵育1 h。取各組細(xì)胞懸液，加入Transwell小室(鋪 Matrigel膠)，在Transwell小室的下室中加入RPMI 1640培養(yǎng)液，置入培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，結(jié)束后，取出小室立即用棉簽擦拭上室細(xì)胞和Matrigel膠，其余步驟參照遷移實驗。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件，各組細(xì)胞的檢測指標(biāo)先進行單因素方差分析，兩組之間的檢測指標(biāo)比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 沉默eIF3b對乳腺癌細(xì)胞eIF3b mRNA和蛋白表達水平的影響 RT-PCR結(jié)果顯示eIF3b-siRNA組eIF3b mRNA相對表達水平為0.54±0.08，明顯低于Control組(1.08±0.18)和Scramble組(1.12±0.16)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。Control組和Scramble組eIF3b mRNA表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。Western印跡法結(jié)果顯示：與Control組(1.09±0.19)、Scramble組(1.05±0.17)相比，eIF3b-siRNA組eIF3b蛋白表達水平(0.45±0.06)明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2、3，Control組和Scramble組eIF3b蛋白表達水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 各組MCF-7細(xì)胞eIF3b的mRNA表達

圖2 各組MCF-7細(xì)胞eIF3b的蛋白相對表達量

圖3 各組MCF-7細(xì)胞eIF3b的蛋白表達水平

2.2 沉默eIF3b對乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響 隨著培養(yǎng)時間的延長，eIF3b-siRNA組細(xì)胞增殖抑制率逐漸升高，與Control組和Scramble組在不同培養(yǎng)時間點上比較，eIF3b-siRNA組細(xì)胞增殖抑制率均明顯高于其余兩組(P<0.05)，見表1。而Control組和Scramble組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組不同時間MCF － 7 細(xì)胞增殖抑制率

2.3 沉默eIF3b對乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響 細(xì)胞遷移和侵襲實驗中，eIF3b-siRNA組遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù)均明顯少于Control組和Scramble組(P<0.05)，見表2，而Control組與Scramble組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

表2 沉默eIF3b對乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響 個

圖4 各組MCF-7 細(xì)胞遷移和侵襲能力(×100)

2.4 沉默eIF3b對乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達的影響 Western blot法結(jié)果顯示：與Control組和Scramble組比較，eIF3b-siRNA組細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)蛋白波形蛋白(vimentin)(0.26±0.02)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2(0.23±0.02)和 MMP-9(0.46±0.03)表達水平明顯減弱(P<0.05)，而抑制細(xì)胞遷移蛋白 E-cadherin(1.32±0.19)表達水平明顯增強，而Control組與Scramble組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3及圖5、6。

圖5 各組MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)蛋白相對表達比較

表3 各組MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)蛋白相對表達量比較

圖6 各組MCF-7細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)蛋白表達水平

3 討論

近年來乳腺癌患者的生存率得到一定程度的提高，這歸功于臨床治療方法的不斷革新，尤其是分子生物靶向治療的應(yīng)用，但對于一些復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，發(fā)生全身轉(zhuǎn)移后死亡率仍然很高[5]。因此，通過探討乳腺癌的無限增殖、浸潤和轉(zhuǎn)移的發(fā)生機制，尋找分子生物靶向藥物治療新靶點一直是目前醫(yī)學(xué)界防治乳腺癌的熱點研究問題。

eIF3是eIFs超家族中最重要的亞基之一，它存在多種許多亞基，如eIF3a、eIF3e、eIF3f、eIF3h、eIF3i等，目前已在多種惡性腫瘤組織中檢測到eIF3多種亞基的異常高表達，認(rèn)為它們可能參與了多種人類惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[6-7]。其中對eIF3發(fā)揮功能的核心亞基eIF3b與腫瘤相關(guān)性的研究也不少見。研究設(shè)計沉默eIF3b基因表達，能有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞，骨肉瘤細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞的增殖能力[8-10]。國內(nèi)也有研究[11-13]發(fā)現(xiàn)，下調(diào)eIF3b的表達，能有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞、肝癌 SMMC-7721細(xì)胞及胃癌細(xì)胞的增殖，并能促進細(xì)胞侵襲和遷移過程。因此，eIF3b與多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)是毋庸置疑的。

本研究設(shè)計沉默eIF3b基因表達的干擾RNA(siRNA)片段，轉(zhuǎn)染入乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后乳腺癌細(xì)胞eIF3b基因mRNA和蛋白表達水平明顯下調(diào) (P<0.05)。表明轉(zhuǎn)染siRNA后，乳腺癌細(xì)胞株MCF-7中eIF3b基因被有效沉默，明顯地抑制了其mRNA和蛋白表達。

無限增殖是腫瘤細(xì)胞的特性之一，也是腫瘤形成和惡性進展的重要機制，尋找干預(yù)參與細(xì)胞增殖和凋亡的靶基因，可能成為治療腫瘤的有效分子靶點[14]。本研究采用CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率，結(jié)果顯示沉默eIF3b基因的表達后，乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的細(xì)胞增殖抑制率明顯提高，表明乳腺癌細(xì)胞株MCF-7轉(zhuǎn)染siRNA后，隨著eIF3b基因表達被沉默，癌細(xì)胞的增殖受到有效地抑制，也提示eIF3b可能成為治療乳腺癌的潛在靶點。

研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移的發(fā)生不僅與腫瘤細(xì)胞在原發(fā)灶的增殖生長能力有關(guān)，同時與腫瘤細(xì)胞突破周邊組織和血管基底膜的潛能密切相關(guān)，具有較強的遷移和侵襲能力的腫瘤細(xì)胞，其體外生存能力更強，體內(nèi)發(fā)展惡性進展的能力也隨之提高，更容易發(fā)生復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，因此如何有效預(yù)防和抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲過程是一項重要的研究課題。本研究采用Transwell小室模型實驗分析沉默eIF3b對乳腺癌細(xì)胞遷移的影響，結(jié)果顯示沉默eIF3b表達后乳腺癌細(xì)胞的遷移穿膜細(xì)胞數(shù)和侵襲穿膜細(xì)胞數(shù)均明顯減少，說明抑制eIF3b的表達對乳腺癌細(xì)胞MCF-7的遷移和侵襲產(chǎn)生了較強的抑制作用，也進一步證明了eIF3b對乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲的惡性行為具有重要的調(diào)控作用，這將為乳腺癌靶向治療提供一個新的切入點。

腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲過程涉及眾多信號通路和功能蛋白的異常表達，其中跨膜蛋白 E-cadherin的表達下調(diào)或缺失、vimentin和基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo proteinases，MMPs)表達異常增高，均已經(jīng)被證實是參與細(xì)胞遷移和侵襲過程的關(guān)鍵調(diào)控蛋白[15-16]。本研究通過Western blot檢測了乳腺癌細(xì)胞中遷移和侵襲相關(guān)蛋白的表達水平，結(jié)果顯示，沉默eIF3b基因后，乳腺癌細(xì)胞中遷移和侵襲相關(guān)蛋白vimentin、MMP-2和 MMP-9的表達下調(diào)，同時抑制細(xì)胞遷移蛋白 E-cadherin的表達明顯提高，這表明沉默eIF3b基因可有效地抑制乳腺癌細(xì)胞的黏附性，阻止癌細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞基底膜之間的作用和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時抑制了癌細(xì)胞的游離，阻礙癌細(xì)胞形成轉(zhuǎn)移灶。

綜上所述，本研究證實下調(diào)eIF3b表達可有效地減弱乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖、侵襲和遷移能力。該作用可能與阻礙乳腺癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程和促進MMP-2和MMP-9的分泌有關(guān)。但本研究僅是eIF3b在乳腺癌發(fā)病過程中作用機制的體外實驗初步探討，且機制分析的深度不夠，eIF3b能否作為治療乳腺癌復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的新靶點仍需要動物體內(nèi)實驗及更深入的分子機制分析進一步證實。