張義智，邵成雷，單玉剛，王海蘋，侯曉群通訊作者）

（1.金訶藏藥（山東）健康產(chǎn)業(yè)有限公司，山東 濟(jì)南 250101；2.青島市市立醫(yī)院，山東 青島 266011）

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

觀察評(píng)價(jià)金訶含片對(duì)活性炭處理的斑馬魚(yú)模型巨噬細(xì)胞免疫功能的促進(jìn)作用，為金訶含片在抗PM2.5領(lǐng)域開(kāi)發(fā)提供參考。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚(yú)240尾，自然成對(duì)交配繁殖方式進(jìn)行，受精后2天，用于金訶含片對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的促進(jìn)作用實(shí)驗(yàn)。

上述Albino品系斑馬魚(yú)均飼養(yǎng)于28℃的斑馬魚(yú)專用養(yǎng)殖水中（pH為6.9-7.2；速溶海鹽含量200 mg/L；電導(dǎo)率為485-505μS/cm的反滲透水；硬度為53.5-71.5 mg/LCaCO3），實(shí)驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)使用許可證號(hào)為：SYXK（浙）2012-0171。斑馬魚(yú)飼養(yǎng)管理完全符合國(guó)際AAALAC認(rèn)證相關(guān)要求[1-5]。

3 實(shí)驗(yàn)藥物

金訶含片，棕色粉末，于2017年09月11日收樣，由金訶藏藥（山東）健康產(chǎn)業(yè)有限公司提供，常溫陰涼避光保存。使用前用超純水配制成濃度為50mg/ mL的溶液，-20℃保存。臨用時(shí)用養(yǎng)魚(yú)水按需稀釋。

金嗓子喉片，市售成品，棕褐色片劑，批號(hào)17031301，于2017年09月11日收樣，由金訶藏藥（山東）健康產(chǎn)業(yè)有限公司提供，常溫陰涼避光保存。臨用前用超純水配制成濃度為200 mg/ mL的母液，-20℃保存。臨用時(shí)用養(yǎng)魚(yú)水按需稀釋。

4 儀器與試劑

解剖顯微鏡（SZX7，OLYMPUS，Japan）；6孔板（Fisher Scientific，China）；精密電子天平（CP214，奧豪斯）；顯微注射儀（IM-300，Narishige）；拉針儀（PC-10，Narishige，Japan）；中性紅（Sigma，China）；甲基纖維素（Sigma，China）。

5 濃度組別

實(shí)驗(yàn)1組 正常對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)2組 模型對(duì)照組；實(shí)驗(yàn)3組 金訶含片56 μg/ mL；實(shí)驗(yàn)4組 金訶含片167 μg/mL；實(shí)驗(yàn)5組 金訶含片500 μg/ mL；實(shí)驗(yàn)6組 金嗓子喉片 222 μg/ mL；實(shí)驗(yàn)7組 金嗓子喉片 667 μg/ mL；實(shí)驗(yàn)8組 金嗓子喉片 2000 μg/ mL。

6 濃度確定依據(jù)

根據(jù)金訶含片（對(duì)斑馬魚(yú)的最大耐受濃度（MTC）為500 μg/ mL）和金嗓子喉片（對(duì)斑馬魚(yú)的最大耐受濃度（MTC）大于2000 μg/ mL）對(duì)斑馬魚(yú)的最大耐受濃度（MTC），確定對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的促進(jìn)作用評(píng)價(jià)濃度為：金訶含片分別為56 μg/ mL（1/9 MTC）、167μg/ mL（1/3 MTC）和500 μg/ mL（MTC）濃度；金嗓子喉片分別為222 μg/ mL（1/9 MTC）、667 μg/ mL（1/3 MTC）和2000 μg/ mL（MTC）濃度。

7 模型制作

將2.3 mg/ mL納米活性炭作為PM2.5納米顆粒，注射到2 dpf斑馬魚(yú)的靜脈中（相當(dāng)于人靜脈注射），每尾斑馬魚(yú)注射10 nL，即以23 ng/尾的劑量建立斑馬魚(yú)PM2.5吞噬模型。

8 實(shí)驗(yàn)方法

隨機(jī)選取240尾受精后2天（2 dpf）黑色素等位基因突變型Albino品系斑馬魚(yú)，靜脈注射給予納米活性炭（PM2.5）建立斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞吞噬功能評(píng)價(jià)模型。模型斑馬魚(yú)分別水溶給予金訶含片56、167、500 μg/ mL濃度和金嗓子喉片222、667、2000 μg/ mL濃度，同時(shí)設(shè)置正常對(duì)照組和模型對(duì)照組，每孔（實(shí)驗(yàn)組）均處理30尾斑馬魚(yú)，每孔容量為3 mL，并且每天更換藥液。金訶含片和金嗓子喉片處理2天后，加入中性紅溶液對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行活體染色，染色結(jié)束后統(tǒng)計(jì)吞噬了納米活性炭的巨噬細(xì)胞數(shù)量（N），以巨噬細(xì)胞吞噬促進(jìn)率評(píng)價(jià)金訶含片對(duì)斑馬魚(yú)體內(nèi)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。金訶含片對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞吞噬功能的促進(jìn)作用計(jì)算公式如下：

用方差分析和Dunnett’s T-檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05表明具有顯著性差異，提供具有代表性的實(shí)驗(yàn)圖譜。

9 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

金訶含片濃度為56和167 μg/ mL時(shí)，斑馬魚(yú)吞噬的納米活性炭的巨噬細(xì)胞數(shù)量分別為44和38個(gè)，與模型對(duì)照組（28個(gè)）比較P＜0.001，其對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞吞噬促進(jìn)率分別為53.5%和32.7%；在500 μg/mL濃度時(shí)，斑馬魚(yú)吞噬的納米活性炭的巨噬細(xì)胞數(shù)量為34個(gè)，與模型對(duì)照組比較P＜0.01，其對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞吞噬促進(jìn)率為19.0%。提示金訶含片在56、167和500 μg/mL濃度時(shí)對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞吞噬功能都有明顯的促進(jìn)作用[6-9]。金嗓子喉片濃度為222、667和2000 μg/ mL時(shí)，斑馬魚(yú)吞噬的納米活性炭的巨噬細(xì)胞數(shù)量分別為41、45和40個(gè)，與模型對(duì)照組（28個(gè)）比較P＜0.001，其對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞吞噬促進(jìn)率為44.7%、56.7%和41.9%，提示金嗓子喉片在222、667和2000 μg/mL濃度時(shí)對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞吞噬功能有明顯的促進(jìn)作用，見(jiàn)表1-2。

表1 金訶含片對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞吞噬功能促進(jìn)作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果

10 實(shí)驗(yàn)結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金訶含片對(duì)斑馬魚(yú)巨噬細(xì)胞吞噬功能有明顯的促進(jìn)作用。國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，斑馬魚(yú)模型在現(xiàn)代藥學(xué)研究中關(guān)于疾病動(dòng)物模型、藥物活性篩選及代謝研究方向的研究取得了很大進(jìn)展[10-11]。本實(shí)驗(yàn)首次將斑馬魚(yú)模型用于評(píng)價(jià)抗霧霾作用，為其拓展應(yīng)用提供了參考。