趙婭婭，劉欣欣，趙雪芹，劉雙雙，朱春玲，王 恒，夏小靜，張慧輝，王 青，徐彥召，杭柏林，孫亞偉，陳仕鈞，胡建和，王 磊

（河南科技學(xué)院 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453003）

金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）是人畜共患的重要病原菌之一，可以引起皮膚潰瘍、傷口感染、心內(nèi)膜炎、骨髓炎、肺炎和中毒性休克綜合癥等各種感染性疾病[1]。自1961 年首次發(fā)現(xiàn)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）以來[2]，MRSA 分離率逐年增加，已成為醫(yī)院感染重要的革蘭陽性細(xì)菌，多重耐藥現(xiàn)象日益嚴(yán)重[3-4]。周順等對分離自雞、豬、家兔及小鼠的75 株金黃色葡萄球菌進(jìn)行檢測，檢出MRSA 株占57.3%[5]，2017 年1 月～2018 年12 月某醫(yī)院接收的453 例金黃色葡萄球菌陽性住院患者中檢測出95 例多重耐藥菌，其中有62 例耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[6]。萬古霉素是治療MRSA 感染最有效的藥物，但是有些MRSA 菌株已經(jīng)表現(xiàn)出了對萬古霉素的抗性（Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus， VRSA），這引起了醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注[7-8]。因此，開發(fā)不易產(chǎn)生耐藥性、活性高、安全可靠的新型抗菌類藥物十分必要。

抗菌肽（Antimicrobial Peptides，AMPs）是機(jī)體先天性免疫系統(tǒng)的重要組成部分，構(gòu)成機(jī)體的第一道防線，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等活性[9]。與抗生素相比，抗菌肽的抗菌機(jī)制獨(dú)特、不易誘發(fā)耐藥性、安全性較高，因此，抗菌肽是抗生素的理想替代品之一[10]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)牛紅細(xì)胞源抗菌肽P3 細(xì)胞毒性較小，殺菌活性強(qiáng)，具有很好的臨床開發(fā)前景[11]，通過對其氨基酸序列進(jìn)行改造獲得JH-3，其氨基酸序列更短（20aa），殺菌和抑菌活性更強(qiáng)[12-13]，其類似物JH-1 能夠顯著抑制豬胸膜肺炎放線桿菌生物被膜的形成[14]。本研究以MRSA（ATCC 25923）為研究對象，體外評價(jià)了JH-3對MRSA 的抑菌和抗炎作用，并且發(fā)現(xiàn)JH-3 對多種MRSA（W3275、R89、R5886、YB57、B6994、R196、R238、R6040）均具有迅速有效的殺菌作用，本研究可為后期新型抗MRSA 菌藥物的研發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料抗菌肽JH-3（RRFKLLSHSLLVTLASHL，分子量2091.51 ku，脂溶性指數(shù)151.67，電荷數(shù)12），由上海吉爾生化有限公司合成，經(jīng)反相高效液相色譜純化和質(zhì)譜鑒定純度＞98%。MRSA ATCC25923 購 自American type culture collection， 其 它MRSA（W3275、R89、R5886、YB57、B6994、R196、R238、R6040）為本實(shí)驗(yàn)分離保存菌株，采用LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

BCA 蛋白試劑盒為碧云天科技公司產(chǎn)品；LDH 細(xì)胞毒性試劑購自Roche公司；PBS、TaKaRa gDNA熒光定量用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號：DRR047A）、75%酒精、胎牛血清FBS、0.25%不含EDTA 胰蛋白酶均購自新鄉(xiāng)智寶生物科技有限公司。

A549 細(xì)胞購自美國標(biāo)準(zhǔn)生物品收藏中心（ATCC）。

1.2 抗菌肽JH-3 對金黃色葡萄球菌ATCC25923抑菌效果的檢測取過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌100 μL（1×108cfu）與高壓滅菌后的100 mL LB 瓊脂培養(yǎng)基（50 ℃左右）混勻，制備凝固培養(yǎng)基，之后在凝固培養(yǎng)基上打孔，加入100 μg/mL 的JH-3（10 μL/孔）。以ddH2O、DMSO 為陰性對照，以慶大霉素（Gentamicin，100 μg/mL，10 μL/孔）、氨芐青霉素（Ampicillin，100 μg/mL，10 μL/孔）為陽性對照。37 ℃培養(yǎng)12 h～16 h，采用瓊脂擴(kuò)散法檢測JH-3 對ATCC25923的抑菌活性。同時(shí)，在96 孔聚丙乙烯微孔板中加入JH-3 并以LB 液體培養(yǎng)基稀釋，使其濃度分別為100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL、6.3 μg/mL、3.1 μg/mL，總體積為50 μL，以ddH2O為陰性對照，每孔接種1×106cfu/mL 的金黃色葡萄球菌ATCC25923 50 μL，37 ℃培養(yǎng)12 h～16 h，觀察抑菌效果，參照文獻(xiàn)[15]進(jìn)行最小抑菌濃度測定（Minimum inhibitory concentration ，MIC）。

1.3 抗菌肽JH-3 對金黃色葡萄球菌ATCC25923體外抑菌作用的檢測將金黃色葡萄球菌培養(yǎng)至對數(shù)生長期（OD600nm約1.0），分別加入JH-3至終濃度為1 MIC和4 MIC，ddH2O 為陰性對照，37 ℃180 r/min 繼續(xù)培養(yǎng)，觀察菌液的生長情況，1 h 之內(nèi)每隔10 min 吸取100 μL 菌液，測定其OD600nm值，參照文獻(xiàn)[16]繪制JH-3 對ATCC25923 的抑菌曲線。同時(shí)，采用BCA 蛋白濃度測定試劑盒每隔1 h 測定細(xì)菌上清液中總蛋白含量，分析JH-3 對細(xì)菌破壞作用。

另外，為檢測不同pH 條件下的JH-3 抑菌效果，配制pH 值分別為3、4、5、6、8、9、10 的LB固體培養(yǎng)基，高壓滅菌后于42 ℃下分別加入ATCC25923菌懸液（終濃度為106cfu/mL）混勻，倒入無菌培養(yǎng)皿中待其冷卻凝固后，進(jìn)行打孔（直徑3 mm），然后每孔加入相同體積的JH-3（終濃度為1 MIC）于不同pH 培養(yǎng)基中，無菌水孔作為陰性對照。37 ℃培養(yǎng)3 h后倒入覆蓋瓊脂，倒置，37 ℃培養(yǎng)24 h。觀察抑菌圈大小，測量抑菌圈直徑，根據(jù)公式繪制pH-抑菌直徑。抑菌圈直徑=處理抑菌圈直徑-對照抑菌圈直徑。

1.4 檢測抗菌肽JH-3對金黃色葡萄球菌ATCC25923生物被膜的影響

1.4.1 生物被膜形成能力檢測 在96 孔聚苯乙烯微孔板上，將過夜培養(yǎng)的金黃色葡萄球菌ATCC25923接入到LB 液體培養(yǎng)基中，每孔按照1%的比例接種，定容至100 μL；分別加入終濃度為1.0 MIC、0.5 MIC 、0.25 MIC 的JH-3，以ddH2O 為陰性對照，37 ℃培養(yǎng)12 h；吸出培養(yǎng)物上清，用200 μL 無菌PBS 清洗微孔板3 次，用70%甲醇固定30 min，吸出固定液，37 ℃干燥30 min；用1%的Hucker 結(jié)晶紫染色液室溫染色5 min，吸出染色液，用水沖洗至無顏色殘留，37 ℃干燥后拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，然后每孔加入100 μL 的70%乙醇溶液溶解，使用酶標(biāo)儀測定OD570nm的吸光值[17]。

1.4.2 掃描電子顯微鏡觀察細(xì)菌生物膜 在6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板上放置無菌蓋玻片并使其與底面充分貼合，按1∶100體積比加入培養(yǎng)過夜的菌液與新鮮培養(yǎng)液，加入終濃度為0.5 MIC 的JH-3，37 ℃培養(yǎng)24 h，用無菌NaCl 溶液2 mL沖洗蓋玻片3次，利用2.5%戊二醛溶液室溫固定30 min，以pH 7.2 的磷酸緩沖液沖洗3 次，每次10 min，再分別以30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%的乙醇梯度脫水，CO2臨界點(diǎn)干燥，離子噴金鍍膜，通過掃描電鏡（SEM）進(jìn)行細(xì)菌生物被膜觀察。

1.5 抗菌肽JH-3 對金黃色葡萄球菌ATCC25923 介導(dǎo)的A549 細(xì)胞LDH 和細(xì)胞因子影響的檢測

1.5.1 乳酸脫氫酶（LDH）細(xì)胞毒性試驗(yàn) 將A549細(xì)胞（1×105個(gè)/mL）接種于96孔板，孵育12 h，然后再加入不同濃度的JH-3（10 μmol/L、20 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L），使JH-3 最終濃度分別為1 MIC、2 MIC、4 MIC、8 MIC、16 MIC，分別于37 ℃，5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)6 h 后利用細(xì)胞毒性檢測試劑盒檢測LDH 的釋放，評價(jià)JH-3 單獨(dú)作用對A549 細(xì)胞的影響；同時(shí)，將A549 細(xì)胞（1×105個(gè)/mL）接種于96 孔板，孵育12 h 后，采用ATCC25923（MOI 10 或MOI 100）感染1 h 后加入終濃度為2 MIC的JH-3，繼續(xù)培養(yǎng)6 h 后利用細(xì)胞毒性檢測試劑盒檢測JH-3 對ATCC25923 介導(dǎo)的LDH 釋放的影響。其中PBS 作為陰性對照，用1%Triton X-100 裂解后細(xì)胞液作為100%細(xì)胞毒性陽性對照，測定OD490nm值。

1.5.2 RT-PCR 檢測細(xì)胞因子mRNA 的轉(zhuǎn)錄 將A549 細(xì)胞（1×106個(gè)/mL）接種于6 孔板，孵育12 h 后感染ATCC25923（MOI 10），37 ℃，5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)1 h 后，分別加入終濃度為1 MIC、2 MIC、4 MIC 的JH-3，采用TaKaRa gDNA 熒光定量用反轉(zhuǎn)錄試劑盒提取處理組和對照組A549 細(xì)胞總RNA 并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，利用熒光定量RT-PCR方法檢測IL-1β、IL-2、IL-6等細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄情況（引物見表1），熒光定量RT-PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃5 min；95 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃20 s，共40 個(gè)循環(huán)，循環(huán)結(jié)束后從60 ℃，每10 s 升高0.5 ℃，至95 ℃停止。

表1 引物表Table 1 primers

1.6 抗菌肽JH-3 對MRSA 廣譜性的檢測為測定JH-3 的抑菌廣譜性，分別將W3275、R89、R5886、YB57、B6994、R196、R238、R6040 菌 株 接 種LB 液體培養(yǎng)基，每株接種兩管，37 ℃過夜培養(yǎng)，使細(xì)菌生長至濃度約為1×108cfu/mL，一管加入終濃度為1 MIC 的JH-3，另一管加入同體積ddH2O 為陰性對照，37 ℃培養(yǎng)20 min，取少量菌液10 倍倍比稀釋涂板計(jì)數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用GraphPad Prism 5 數(shù)據(jù)處理軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及差異性分析（One-Way ANOVA 或Two-Way ANOVA），p≤0.05 為差異顯著（文中標(biāo)注*：p＜0.05；**：p＜0.01；***：p＜0.001）。

2 結(jié) 果

2.1 抗菌肽JH-3 對金黃色葡萄球菌ATCC25923抑菌效果的檢測結(jié)果通過瓊脂擴(kuò)散法測定JH-3 對金黃色葡萄球菌ATCC25923 的抑菌活性，結(jié)果顯示100 μg/mL JH-3 的孔抑菌環(huán)直徑為8.1±0.2 mm，抑制作用強(qiáng)于100 μg/mL 的慶大霉素（抑菌環(huán)直徑為7.0±0.1 mm），弱于100 μg/mL 的氨芐青霉素（抑菌環(huán)直徑為12.2±0.3 mm）。而陰性對照組的DMSO 與ddH2O不能抑制金黃色葡萄球菌的生長。MIC 測定結(jié)果顯示，JH-3 對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為25 μg/mL。表明抗菌肽JH-3 對ATCC25923 具有較好的抑菌作用。

2.2 抗菌肽JH-3 對金黃色葡萄球菌ATCC25923體外抑菌作用的檢測結(jié)果對JH-3 作用6 h 內(nèi)MRSA ATCC25923 菌液中活菌數(shù)量和菌液OD600nm進(jìn)行測定，結(jié)果顯示，1 MIC JH-3 即可在360 min 內(nèi)消除細(xì)菌，可對MRSA ATCC25923 起到明顯抑制和殺菌 作 用（圖1A，p＜0.01；圖1B，p＜0.001）；4 MIC JH-3 可在30 min 內(nèi)快速殺滅細(xì)菌，使細(xì)菌濃度降低至104cfu/mL，120 min 內(nèi)清除活菌，殺菌效果更為顯著（圖1B，p＜0.001）。

細(xì)菌總蛋白的釋放檢測結(jié)果顯示，1 MIC 和4 MIC 的JH-3 作用ATCC25923 5 h 和2 h 后，細(xì)菌培養(yǎng)液上清中總蛋白量顯著增加（OD595nm1.75±0.02、1.37±0.01 vs 0.65±0.03，圖1C，p＜0.05），表明JH-3能夠顯著破壞細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)容物的釋放，從而介導(dǎo)菌體死亡。通過對不同pH 條件下的殺菌作用進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，不同pH 值沒有對JH-3 的殺菌作用產(chǎn)生影響，抑菌半徑在均8 mm 左右（圖1D，p＞0.05），表明JH-3 在酸堿環(huán)境下的抑菌效果穩(wěn)定性較好。

圖1 JH-3 對MRSA ATCC25923 的體外殺菌結(jié)果Fig.1 In vitro killing curve of JH-3 for MRSA ATCC25923

2.3 抗菌肽JH-3 對金黃色葡萄球菌ATCC25923生物被膜影響的檢測結(jié)果通過不同濃度JH-3 的添加，靜態(tài)培養(yǎng)MRSA ATCC25923 24 h 后結(jié)晶紫染色，觀察可見0.5 MIC、0.25 MIC 的JH-3 均對MRSA ATCC25923 的生物被膜形成能力有抑制作用，1MIC的JH-3 即可完全消除MRSA ATCC25923 的生物被膜（圖2A）。70%乙醇溶解結(jié)晶紫后，OD570nm測定結(jié)果顯示， 0.5 MIC 的JH-3 能夠顯著降低ATCC25923生物被形成（圖2B，p＜0.05），1 MIC的JH-3能夠極顯著降低ATCC25923 生 物 被 膜 形 成（圖2B，p＜0.01），表 明JH-3 對生物被膜形成的影響具有明顯的劑量依賴性。掃描電子顯微鏡觀察細(xì)菌發(fā)現(xiàn)未處理組細(xì)菌大量聚集成團(tuán)，呈多層結(jié)構(gòu)，生物被膜牢固；0.5 MIC JH-3 處理組粘附到蓋玻片上的細(xì)菌數(shù)明顯降低，呈單層結(jié)構(gòu)，生物被膜形成降低（圖2C）。綜上，表明抗菌肽JH-3 能夠降低ATCC25923 生物被膜形成。

圖2 抗菌肽JH-3 對ATCC25923 生物被膜的影響Fig.2 Inhibition of biofilm formation in MRSA ATCC25923 by JH-3

2.4 抗菌肽JH-3 對金黃色葡萄球菌ATCC25923介導(dǎo)的A549 細(xì)胞LDH 和細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的影響檢測結(jié)果在A549 細(xì)胞上評價(jià)JH-3 對LDH 的釋放，結(jié)果顯示，不同濃度JH-3 對LDH 的釋放均較小，LDH 釋放率為15%，組間包括與陰性對照相比差異不顯著（圖3A，p＞0.05），表明JH-3 對A549 細(xì)胞毒性較小，不影響正常細(xì)胞LDH 的釋放；然而當(dāng)A549 細(xì)胞加入ATCC25923 時(shí)，能夠顯著增加A549 LDH 的釋放，LDH 的陽性率升至46±2%和73±2%（圖3B，p＜0.05），2 MIC JH-3（50 μg/mL）能夠顯著抑制不同濃度ATCC25923 誘導(dǎo)的LDH 釋放（LDH陽性率46±2%vs 20±1%，73±2%vs 37±2%，圖3B，p＜0.05）。ATCC25923 感染A549 細(xì)胞能夠顯著增加炎性相關(guān)細(xì)胞因子IL-1β、IL-2、IL-6 的轉(zhuǎn)錄，JH-3 能夠不同濃度抑制ATCC25923 誘導(dǎo)的炎性因子轉(zhuǎn)錄，且呈劑量依賴性：2 MIC JH-3 能夠顯著降低IL-1β 和IL-6 的 轉(zhuǎn) 錄（IL-1β：2.1±0.1 vs 7.8±0.2；IL-6：2.0±0.4 vs 7.2±0.2；圖3C 和3E，p＜0.05），1MIC JH-3 能夠顯著降低IL-2 的轉(zhuǎn)錄（IL-2：7.5±0.2 vs 14.6±0.1，圖3D，p＜0.05）。綜上，表明抗菌肽JH-3 在200 μmol/L 內(nèi)對A549 細(xì)胞無毒性作用，且可降低ATCC25923 介導(dǎo)的細(xì)胞LDH 釋放和炎癥相關(guān)因子（IL-1β、IL-2 和IL-6）的轉(zhuǎn)錄水平。

圖3 JH-3 作用后，ATCC25923 誘導(dǎo)A549 細(xì)胞LDH 和細(xì)胞因子釋放的檢測結(jié)果Fig.3 Release of LDH and cytokine in A549 cells after JH-3 treatment

2.5 抗菌肽JH-3 對MRSA 廣譜性的檢測結(jié)果對不同MRSA 菌株進(jìn)行JH-3 殺菌廣譜性評價(jià)，結(jié)果顯示JH-3 對W3275、R89、R5886、YB57、B6994、R196、R238、R6040 菌株20 min 內(nèi)均可使活菌數(shù)極顯著降低至103cfu/mL～107cfu/mL（圖4，p＜0.001）。表明JH-3 具有較強(qiáng)的抑菌和殺菌活性，且能對多種MRSA 具有良好的殺菌作用。

圖4 JH-3 對多種MRSA 的殺菌作用測定結(jié)果Fig.4 Bactericidal activity of JH-3 against MRSA

3 討 論

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是目前臨床感染控制的重大挑戰(zhàn)，在侵襲性感染中MRSA 患者的死亡率顯著高于MSSA 患者[18]。糖肽類仍是目前MRSA 感染治療的主流藥物之一[19]，在治療MRSA 感染中萬古霉素常作為系統(tǒng)性MRSA 感染的經(jīng)驗(yàn)性和目標(biāo)治療藥物[20]，但是萬古霉素治療失敗的病例已經(jīng)不斷出現(xiàn)[21-22]。因此，尋找一種能夠替代現(xiàn)有抗生素的抗菌藥物十分必要。賴崇發(fā)等研究發(fā)現(xiàn)ZTW-41 對革蘭氏陽性菌具有較強(qiáng)的抗菌作用，其中包括對MRSA，抗菌活性比萬古霉素強(qiáng)2～64 倍[23]。邱敏等研究發(fā)現(xiàn)丁香油對MRSA 具有一定的抗菌活性，同β-內(nèi)酰胺類抗生素聯(lián)用能協(xié)同增加β-內(nèi)酰胺類抗生素抗MRSA 活性[24]。本研究首次發(fā)現(xiàn)JH-3 對多種MRSA 均具有較強(qiáng)殺菌作用，1 MIC的JH-3 可在20 min 內(nèi)使耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ATCC25923 活 菌 數(shù) 降 低1 000 倍，360 min 內(nèi) 消 除 細(xì)菌，4 MIC 殺菌效果更為顯著。此外，本研究發(fā)現(xiàn)JH-3 能夠降低MRSA 感染造成的細(xì)胞炎癥和LDH 的釋放，對MRSA 的生物被膜形成也能起到良好的抑制作用，本實(shí)驗(yàn)可為新型抗MRSA 藥物的開發(fā)提供參考。

目前，針對抗菌肽的殺菌機(jī)制尚未定論，但多數(shù)學(xué)者一致認(rèn)為抗菌肽的殺菌機(jī)制主要是在細(xì)菌表面打孔，形成孔道，致使細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞，造成胞內(nèi)水溶性物質(zhì)大量滲出，而最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡[25]。Cathelicidin PMAP-36 衍生物G124 能夠破壞E.coli 細(xì)胞膜，增強(qiáng)其通透性，內(nèi)容物外泄，從而導(dǎo)致菌體死亡[26]?？咕腍JH-3 能夠使細(xì)菌細(xì)胞膜迅速去極化，破壞膜的完整性，導(dǎo)致細(xì)菌變形、破裂、黏連，從而起到殺菌作用[27]。HBV 核心蛋白（HBc）富含精氨酸結(jié)構(gòu)域（ARD），能夠結(jié)合到銅綠假單胞菌和大腸桿菌表面，結(jié)合位點(diǎn)為細(xì)菌脂多糖，改變細(xì)菌膜通透性，進(jìn)而起到殺菌作用[28]?？咕膒apiliocin C 端疏水性芳香族氨基酸殘基能夠起到快速破壞大腸桿菌內(nèi)膜和外膜通透性的作用，為抗菌肽選擇性抗菌機(jī)制的研究提供參考[29]。本研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽JH-3 能夠在1 h 內(nèi)快速破壞金黃色葡萄球菌ATCC25923 膜結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致內(nèi)容物（菌體蛋白）外泄，從而起到殺菌的作用。

抗菌肽抗炎功能成為近年來研究熱點(diǎn)。HanR等發(fā)現(xiàn)添加不同濃度抗菌肽CEN1HC-Br，能夠顯著降低痤瘡丙酸桿菌刺激HaCaT 細(xì)胞和人單核細(xì)胞IL-6、IL-1β、TNF-α和TLR2 的高表達(dá)，減輕大鼠耳腫脹，并降低促炎性細(xì)胞因子IL-8 的高表達(dá)，且抗菌肽CEN1HC-Br 的抗炎效果優(yōu)于克林霉素，該結(jié)果與本研究中JH-3 能夠顯著降低金葡菌感染后IL-6的轉(zhuǎn)錄相一致[30]。KR-12-a5 是12-聚體α-螺旋抗菌肽，其功能與LL-37 類似，研究發(fā)現(xiàn)KR-12-a5 及其類似物能夠顯著抑制LPS 刺激RAW264.7 后TNF-α、NO、IL-6 和MCP-1 分泌，從而降低細(xì)胞炎癥反應(yīng)[31]。Fusco A 等發(fā)現(xiàn)抗菌肽hBD-2 和hBD-3 能夠降低沙門氏菌感染Caco-2 細(xì)胞后TNF-α、IL-6、IL-8和IL-1β 的表達(dá)，增加抗炎細(xì)胞因子TGF-β 的表達(dá)，表明抗菌肽能夠顯著降低鼠傷寒沙門氏菌感染Caco-2 細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)，從而調(diào)控免疫應(yīng)答，該結(jié)果與本研究中JH-3 能夠顯著降低金葡菌感染后IL-6 和IL-1β的轉(zhuǎn)錄相一致[32]。血管活性腸肽VIP類似物rVIPa 能夠顯著降低TNBS 誘導(dǎo)的兔結(jié)腸中TNF-α 表達(dá)水平，并顯著增加結(jié)腸中抑炎因子IL-10 含量，從而緩解兔結(jié)腸炎癥反應(yīng)[33]。本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽JH-3 通過抑制p38 MAPK 信號通路活化降低炎性細(xì)胞因子IL-2、IL-6 和TNF-α分泌，通過抑制caspase-8 和caspase-9 活化，進(jìn)而抑制caspase-3 活化，從而起到降低RAW264.7 細(xì)胞凋亡的作用[34]。A549 細(xì)胞是研究金黃色葡萄球菌與宿主細(xì)胞相互作用的模式細(xì)胞[35]，因此，選擇在A549細(xì)胞上進(jìn)行抗菌肽JH-3 對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑菌和抗炎作用研究，發(fā)現(xiàn)JH-3 能夠抑制ATCC25923 誘導(dǎo)的炎性因子釋放，且呈劑量依賴性，表明抗菌肽JH-3 具有良好的抗炎效果，在抗炎作用方面具有良好的應(yīng)用前景。

本研究系統(tǒng)評價(jià)了抗菌肽JH-3 對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的的殺菌作用，初步闡明了JH-3的殺菌機(jī)制，主要通過改變ATCC25923 細(xì)胞通透性，導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)容物釋放，從而介導(dǎo)菌體死亡，并能夠顯著抑制本菌生物背膜的產(chǎn)生，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)JH-3 能夠降低MRSA 感染造成的細(xì)胞炎癥和LDH 的釋放。本研究還發(fā)現(xiàn)抗菌肽JH-3 對多種MRSA 均具有較強(qiáng)殺菌作用，可為新型抗MRSA 藥物的研發(fā)提供參考。