張運強，周昭彬，張云露，劉自逵*

（1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410000；2. 湖南加農(nóng)正和生物技術(shù)有限公司，湖南 長沙 410000）

隨著養(yǎng)殖行業(yè)的規(guī)?；图s化發(fā)展，“防大于治”的管理理念被廣大業(yè)內(nèi)人士所認(rèn)可，在動物疾病預(yù)防中，提升免疫功能和抗氧化應(yīng)激又是動物抗病的基礎(chǔ)和關(guān)鍵[1]。中藥是中國的國粹，在養(yǎng)殖應(yīng)用上具有悠久的歷史，黃芪和淫羊藿等中藥被證實對動物和人的免疫系統(tǒng)具有一定的調(diào)節(jié)作用，如史同瑞發(fā)現(xiàn)使用黃芪飼喂仔豬可以顯著提升血液中IgG 和IgA 的含量[2]，而胡月琴發(fā)現(xiàn)，淫羊藿總黃酮對環(huán)磷酰胺致免疫低下的小鼠中樞免疫系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用[3]。但由于國內(nèi)中藥資源有限，使用中藥原料飼喂動物普遍存在著用量大、見效慢、作用時間長的劣勢，中藥添加劑能否充分發(fā)揮效益成為其實際生產(chǎn)使用的限制因素。

因此，本實驗將淫羊藿多糖進(jìn)行硫酸化后又與黃芪復(fù)方混合，旨在探究該復(fù)方對動物的免疫調(diào)節(jié)和抗氧化作用。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料及實驗動物黃芪和箭葉淫羊藿由湖南加農(nóng)正和生物技術(shù)有限公司提供；酯化修飾劑（氯磺酸與吡啶體積比為1∶8）由湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院提供。各免疫因子的雙抗體夾心ELISA試劑盒購自江蘇酶免實業(yè)有限公司；各抗氧化指標(biāo)的比色法測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。周齡為7 周齡、體質(zhì)量為26 g±2 g 的200 只未經(jīng)產(chǎn)的健康成熟雌性昆明小鼠，購自湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司。

1.2 中藥混合物的制備淫羊藿多糖硫酸酯（sEPS）由本實驗室參照文獻(xiàn)[4]制備。將黃芪原料進(jìn)行粉碎并過40 目篩子（孔徑：0.425 mm），與sEPS 按質(zhì)量9∶1 混合，得試驗所用黃芪與sEPS 混合物（以下簡稱：混合物），將混合物真空包裝后室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 動物分組及處理采用單因子隨機區(qū)組試驗方法，將200 只實驗小鼠，預(yù)飼養(yǎng)7 d 后隨機分為4組，每組50 只，分別為對照組C、處理組T1、T2 和T3，每組5 個重復(fù)，每個重復(fù)10 只；其中對照組飼喂不含任何飼料添加劑的日糧，T1、T2、T3 分別在基礎(chǔ)日糧上按日糧重量比例添加混合物0.100%、0.175%和0.250%。試驗期為28 d，分別在試驗開始第0、7 d、14 d、21 d、28 d 于各組每個重復(fù)隨機選取2 只實驗小鼠禁食12 h 后稱重、采血分離血清，-80 ℃保存待測。迫殺后無菌采取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟和胸腺等臟器，用生理鹽水沖洗表面后擦干并稱重。分離十二指腸約2 cm，甲醛固定后室溫保存待測。

1.4 生長指標(biāo)和器官指數(shù)對各組小鼠投喂混合物后0、7 d、14 d、21 d 和28 d 的體質(zhì)量和總采食量進(jìn)行稱重，分析小鼠在各個階段不同處理對其初重、末重、平均日增重、平均日采食量、料重比變化情況；同時，檢測上述各時間點采集的肝臟、心臟、脾臟、肺臟、腎臟和胸腺等器官質(zhì)量，計算器官質(zhì)量與小鼠體質(zhì)量的比值，分析器官指數(shù)變化情況。

1.5 免疫指標(biāo)測定利用雙抗體夾心ELISA 試劑盒檢測各時間點收集血清中溶菌酶、β 防御素2（HBD-2）、十二指腸SIgA、白細(xì)胞介素（分別為IL-1β、 IL-4、 IL-6 和IL-8）、 腫 瘤 壞 死 因 子α（TNF-α）以及γ干擾素（IFN-γ），利用標(biāo)準(zhǔn)品測量建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用四參數(shù)Logistic 曲線擬合，公式為：

1.6 抗氧化指標(biāo)的監(jiān)測利用抗氧化指標(biāo)比色法測定試劑盒檢測總抗氧化能力水平（T-AOC）、總過氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）和過氧化氫酶（CAT）。利用繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各指標(biāo)水平。

1.7 統(tǒng)計分析用Excel 2016 軟件對測試數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，采用SPSS 22.0 軟件ANOVA 方法進(jìn)行方差分析，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”，采用Duncan 法進(jìn)行多重比較，p＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠生長指標(biāo)與器官指數(shù)對投喂混合物后各個階段不同處理組小鼠初重、末重、平均日增重、平均日采食量、料重比進(jìn)行監(jiān)測分析，結(jié)果顯示所述各指標(biāo)數(shù)值均無顯著變化（p＞0.05）。器官指數(shù)檢測結(jié)果顯示，各組小鼠肝臟指數(shù)、心臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、腎臟指數(shù)、肺臟指數(shù)和胸腺指數(shù)也均無顯著變化（p＞0.05）。

2.2 各階段小鼠血清中各免疫指標(biāo)的變化對各組小鼠在各時間點血清中的溶菌酶、HBD-2 和十二指腸SIgA進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，（1）溶菌酶：第14 d，T2組顯著高于T3組，且T3組顯著高于C組；第21 d，T2和T3組顯著高于T1和C組（p＜0.05）；（2）HBD-2：第7 d，T2 組和C 組顯著高于T1 組；第21 d，T1、T2 和T3 組均顯著高于C 組（p＜0.05）；（3）十二指腸SIgA：第14 d，T1 和T3 組顯著高于T2 和C 組，第21 d，T1、T2 和T3 組均顯著高于C 組（p＜0.05）（圖1）。由于溶菌酶、HBD-2和十二指腸SIgA均為重要的非特異性免疫指標(biāo)，且根據(jù)結(jié)果分析，C 組的指標(biāo)變化不明顯，而大部分時間點這3 項指標(biāo)的處理組較C 組有顯著變化，且在21 d變化最明顯，表明混合物能夠影響小鼠的溶菌酶、HBD-2和十二指腸SIgA的水平變化。利用ELISA 方法檢測實驗組各階段的細(xì)胞因子表達(dá)變化情況，結(jié)果顯示，（1）IL-1β：第14 d 和21 d，C 組顯著高于各處理組；第28 d，C 組顯著高于T1 組（p＜0.05）；（2）IL-4：第7 d 和14 d，T2 和T3組顯著高于T1和C組；第21 d，C組、T2組和T3組顯著高于T1 組（p＜0.05）；（3）IL-6：第7 d，C 組顯著高于T1組，且T1組顯著高于T2和T3組；第14 d，C組顯著高于各處理組；第21 d，C 組顯著高于T1 和T2 組，且T1和T2組顯著高于T3組；第28 d，C組顯著高于各處理組，且T1 組顯著高于T2 組（p＜0.05）；（4）IL-8：第7 d，T2 組顯著高于T1、T3 和C 組；第14 d，C 和T1 組顯著高于T2 和T3 組；第21 d，C、T1 和T2 顯著高于T3組（p＜0.05）；（5）TNF-α：第14 d，C組顯著高于T1和T2組；第21 d，C組顯著高于各處理組，且T1組顯著高于T2和T3組；第28 d，C組和T1組顯著高于T2和T3組（p＜0.05）；（6）IFN-γ：第7 d，T3組顯著高于T1、T2和C組；第21 d，C組顯著高于T2和T3組；第28 d，C組、T1和T2組顯著高于T3組（p＜0.05）（圖2）。

圖1 小鼠飼喂中藥混合物后血清中溶菌酶、HBD-2 和十二指腸SIgA 的變化Fig.1 Changes of lysozyme,HBD-2 and SIgA in serum of mice fed with traditional Chinese medicine mixture

圖2 小鼠血清中IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、TNF-α和IFN-γ的變化Fig.2 The changes of IL-1 β,IL-4,IL-6,IL-8,TNF-α and IFN-γ in the serum of mice

對小鼠血清中IFN-γ和十二指腸SIgA 相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，C 組呈不顯著正相關(guān)（p＞0.05）；T1組呈不顯著負(fù)相關(guān)（p＞0.05），T2 和T3 組呈顯著負(fù)相關(guān)（p＜0.05），且T3 組（p=0.011）的顯著性大于T2組（p=0.036）（表1）。血清中IFN-γ和十二指腸SIgA的變化折線圖顯示，C 組變化趨于平穩(wěn)，而T1、T2和T3 組的指標(biāo)變化呈“此消彼長”的態(tài)勢（圖3），證明混合物添加日糧能夠增加小鼠血清中IFN-γ和十二指腸SIgA 的雙向調(diào)節(jié)作用，且呈劑量依賴性。

表1 小鼠飼喂中藥混合物后IFN-γ和十二指腸SIgA相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of IFN-γ and duodenal sIgA in mice fed with traditional Chinese medicine mixture

圖3 飼喂中藥混合物后小鼠血清中IFN-γ和十二指腸SIgA 的關(guān)系變化Fig.3 Relationship between IFN-γ and duodenal SIgA in serum of mice fed with traditional Chinese medicine mixture

2.3 血清中抗氧化水平的變化利用比色法檢測飼喂混合物日糧后小鼠血清中的抗氧化指標(biāo)變化，結(jié)果顯示：（1）T-AOC：第7 d，各處理組均顯著高于C 組；第14 d，T1 和T3 組顯著高于C 組；第21 d，T2 和T3 組顯著高于T1 和C 組（p＜0.05）；（2）GSHPX：第21 d，T1 和T2 組顯著高于T3 組（p＜0.05）；（3）CAT：第7 d，T3 組顯著高于C、T1 和T2 組；第14 d，T3 組顯著高于C、T1 和T2 組，且C 和T1 組顯著高于T2 組（p＜0.05）（圖4）。綜上結(jié)果分析，對于小鼠血清中的總抗氧化水平，除第28 d 因C 組離散度過高導(dǎo)致顯著性不明顯，其余各個時間點各處理組均較C 組有顯著或不顯著提高，小鼠血清中的T-AOC 代表著其總抗氧化水平，因此結(jié)果表明混合物飼喂小鼠能夠改善其抗氧化水平。

圖4 飼喂中藥混合物后小鼠血清中T-AOC、T-SOD、GSH-PX 和CAT 的變化Fig.4 The changes of T-AOC,T-SOD,GSH-PX and CAT in the serum of mice fed with traditional Chinese medicine mixture

3 討 論

溶菌酶是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的抗菌蛋白。它通常以分解細(xì)菌的細(xì)胞壁肽聚糖（Peptidoglycan，PG）來獲得對細(xì)菌的抵抗。溶菌酶作為一種先天性免疫因子，在動物機體的免疫功能中起著至關(guān)重要的作用[5]。根據(jù)圖1 結(jié)果可知，T2 和T3 組小鼠血清的溶菌酶含量在第14 d 和第21 d 顯著高于對照組（p＜0.05）。證明混合物飼喂小鼠可在一定劑量和時間誘導(dǎo)小鼠溶菌酶表達(dá)。其可能的原因是混合物的主要成分黃芪中含有黃芪多糖，湯菊芬等人用黃芪多糖注射液注射羅非魚，發(fā)現(xiàn)黃芪多糖能誘導(dǎo)羅非魚肝、脾等組織溶菌酶的表達(dá)，增強羅非魚的機體免疫力[6]，溶菌酶具有分解僅由細(xì)菌產(chǎn)生的PG 的能力，因此PG 成為了溶菌酶很好的靶向目標(biāo)[7]。當(dāng)細(xì)菌侵入機體時，溶菌酶可誘導(dǎo)產(chǎn)生IL-8 等促炎因子來調(diào)節(jié)機體免疫功能，進(jìn)而實現(xiàn)殺滅細(xì)菌的功能[8]。Wolf 在研究中發(fā)現(xiàn)，機體會通過細(xì)菌源性脂蛋白和DNA 受體增加炎癥因子IL-6 和TNF-α的釋放[9]。但與上述結(jié)果相反，在本實驗中，T2 組和T3組小鼠的溶菌酶在14 d 和21 d 顯著高于對照組，但T2 組和T3 組小鼠的IL-6、IL-8 和TNF-α顯著低于對照組（p＜0.05）或無顯著性差異（p＞0.05）。其可能原因為，由于小鼠試驗不是病原接種試驗，而是讓小鼠在室內(nèi)自然環(huán)境中進(jìn)行的試驗，因此該結(jié)果提示：在自然環(huán)境中黃芪和sEPS 混合物飼喂健康小鼠對其具有免疫調(diào)節(jié)作用，并能夠誘導(dǎo)溶菌酶的表達(dá)，但不增加IL-6、IL-8 以及TNF-α等促炎因子的釋放。

防御素是富含二硫鍵的陽離子多肽，廣泛分布于真菌、植物和動物體內(nèi)，是生物免疫系統(tǒng)中的重要調(diào)節(jié)因子[10]。HBD-2 廣泛分布于具有直接殺菌作用的動物皮膚、黏膜及其他上皮組織中，是一類重要的抗菌肽[11]。雖然HBD-2 是一種重要的非特異性免疫因子，但據(jù)報道稱，HBD-2 具有誘導(dǎo)表達(dá)的特性，其含量主要受局部炎癥和微生物刺激的調(diào)節(jié)，如革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽性菌、真菌、體內(nèi)共生菌、TNF-α和IL-1β等均可上調(diào)HBD-2 的表達(dá)，繼而導(dǎo)致炎癥區(qū)HBD-2 含量增加[12]。因此，推測HBD-2與TNF-α、IL-1β等促炎因子的相互作用可能與含量變化效應(yīng)呈正相關(guān)。根據(jù)本實驗結(jié)果，T1、T2 組小鼠血清HBD-2 含量在7 d 顯著低于對照組，21 d各治療組均顯著高于對照組（p＜0.05），但TNF-α和IL-1β的檢測結(jié)果與上述研究結(jié)果不同，第7 d 和21 d時，兩種細(xì)胞因子水平并不高于對照組，部分細(xì)胞因子水平甚至呈現(xiàn)出顯著低于對照組的狀況（p＜0.05）?？梢娀旌衔锟稍谝欢〞r間和一定程度上增加小鼠血清中HBD-2 的含量，但血清中HBD-2 和TNF-α、IL-1β的表達(dá)特點與局部組織不同。

動物機體的抗氧化能力與抵御疾病、維持健康存在著密切的聯(lián)系，動物血清含多種有益于機體健康的抗氧化因子，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、GSH-PX、維生素C、維生素E 以及β-胡蘿卜素等。它們具有分解自由基、除去起催化作用的金屬離子等作用，當(dāng)機體的抗氧化能力降低時，動物機體容易引起免疫力低下、炎癥等問題，此時機體更容易受到外界病原入侵，動物的病死幾率也隨之升高[13]。如圖4 結(jié)果顯示，飼喂高劑量復(fù)合物添加日糧的T3 小鼠血清中總抗氧化水平在7 d、14 d 和21 d 均顯著高于對照組C 升（p＜0.05），T1、T2 組在某些時間段也較對照組有顯著提升，這個結(jié)果證明，黃芪與sEPS 可在一定程度上提升小鼠血清的抗氧化性。其原因可能是復(fù)合物中含有黃酮類物質(zhì)（如黃芪黃酮）和淫羊藿多糖，黃文靜通過研究發(fā)現(xiàn)，黃芪莖葉提取的總黃酮對DPPH 自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基均有較高的清除能力，從而實現(xiàn)抗氧化的功能[14]。但在本實驗中飼喂中藥混合物的小鼠血清中僅CAT 水平在T3 組7 d 和14 d 較對照組有顯著提升（p＜0.05），而處理組的T-SOD 水平和GSH-PX 活性雖然在大部分時間節(jié)點上高于對照組，但差異不顯著（p＞0.05），其原因可能為，動物機體的抗氧化酶僅起到一定的抗氧化效果，而總體抗氧化水平是各抗氧化因子與清除氧自由基共同作用的結(jié)果[15]，因此推測，混合物雖然對一些酶的水平和活性提升不顯著，但可以顯著提升綜合抗氧化水平。

免疫調(diào)節(jié)功能對于動物的抗病能力具有重要意義，但很少有關(guān)于健康動物免疫調(diào)節(jié)能力的評價與報道，本實驗以小鼠IFN-γ和十二指腸SIgA 的變化指標(biāo)進(jìn)行分析，探究了這兩種免疫指標(biāo)的變化關(guān)系和調(diào)節(jié)特點。IFN-γ是Ⅱ型干擾素，主要由活化的NK 細(xì)胞和T 細(xì)胞產(chǎn)生，最近的研究表明，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）在接觸抗原的早期快速而短暫地分泌IFN-γ，這些早期產(chǎn)生的IFN-γ可以通過抑制初始T細(xì)胞的凋亡來阻止過度免疫反應(yīng)的啟動[16]。在本實驗中IFN-γ和十二指腸SIgA 的水平呈“此消彼長”的趨勢。由于本研究中的小鼠暴露于抗原中，并沒有在無菌環(huán)境中進(jìn)行試驗，可以推斷，隨著SIgA 含量的增加，對黏膜的保護(hù)作用增強，小鼠體內(nèi)抗原含量降低，IFN-γ的分泌將啟動相應(yīng)的機制，導(dǎo)致IFN-γ含量下降到一定水平。本研究中隨著混合物的劑量提升，兩種免疫指標(biāo)的負(fù)相關(guān)性也逐步提升，證明了黃芪與sEPS 混合物飼喂小鼠能夠增強IFN-γ和十二指腸SIgA 的雙向調(diào)節(jié)能力，且劑量越高其調(diào)節(jié)能力越強。本實驗結(jié)果佐證了中藥對動物免疫的雙向調(diào)節(jié)作用[17]，為健康動物的免疫調(diào)節(jié)評價提供了依據(jù)。