周紅蕾，程淑琴，胡永青，劉 靜*

（1. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 寵物科技學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2. 吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062；3. 河北省農(nóng)業(yè)對(duì)外貿(mào)易促進(jìn)中心，河北 石家莊 050011）

單核細(xì)胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，L.monocytogenes），簡(jiǎn)稱單增李斯特菌，屬乳酸桿菌科，革蘭氏陽性小桿菌，是一種重要的人畜共患病病原菌，臨床上引起李氏特菌病，表現(xiàn)為：敗血癥、腦膜炎、熱性腸胃炎、流產(chǎn)、肺炎、淋巴結(jié)腫大和單核細(xì)胞增多等，通過直接或間接接觸污染物而傳播，致死率高達(dá)44%[1]。單增李斯特菌廣泛存在于自然界中，是胞內(nèi)寄生菌，感染動(dòng)物機(jī)體后主要依靠宿主的細(xì)胞免疫對(duì)其清除，該病主要見于幼畜和免疫力低下的動(dòng)物群體。由于單增李斯特菌培養(yǎng)營養(yǎng)要求不高，在4 ℃～45 ℃中均能生長，是冷藏食品威脅人畜健康的主要病原菌之一，肉制品或乳制品等食品中存在的單增李斯特菌對(duì)人畜的健康有著重大的危害[2]。因此，建立一種快速、靈敏、特異性的單增李斯特菌檢測(cè)方法在人畜公共衛(wèi)生安全中尤為重要。

單增李斯特菌的傳統(tǒng)檢測(cè)方法為生化培養(yǎng)，雖然該方法檢測(cè)的精準(zhǔn)性高，但由于樣品中細(xì)菌含量通常較低，需要富集培養(yǎng)來提高菌體濃度的前處理步驟，這一過程通常需要12 h～36 h，疑似樣品到最終確定耗時(shí)久，因此無法廣泛推廣應(yīng)用。而分子生物學(xué)方法因其檢測(cè)速度快、靈敏度高而被廣泛研究并應(yīng)用。重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增（Recombinase polymerase amplification，RPA）技術(shù)是一種可以替代PCR的核酸檢測(cè)技術(shù)。該技術(shù)無需昂貴的PCR 儀，反應(yīng)速度快，靈敏度高，擴(kuò)增產(chǎn)物可以與瓊脂糖凝膠電泳終點(diǎn)法、熒光定量實(shí)時(shí)檢測(cè)法、測(cè)流層析試紙條等方法結(jié)合起來進(jìn)行檢測(cè)，廣泛應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[3-6]。本研究基于單增李斯特菌基因組序列設(shè)計(jì)特異性識(shí)別引物，利用RPA技術(shù)建立了單增李斯特菌快速、特異、靈敏的檢測(cè)方法，適用于基層實(shí)驗(yàn)室和現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，是人畜公共衛(wèi)生安全監(jiān)測(cè)的重要手段。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料單增李斯特菌（ATCC 19115）、伊氏李斯特菌（Listeria ivanovii，ATCC 19119）、無害李斯特菌（Listeria innocua，ATCC 33090）、斯氏李斯特菌（Listeria seeligeri，ATCC 35967）、格氏李斯特菌（Listeria grayi，ATCC 25401）、腸致病性大腸埃希菌O157（Escherichia coli O157，ATCC 43888）、沙門氏菌（Salmonella enteritidis，ATCC 14028）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus，ATCC 14579）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 6538）均購自北京普天同創(chuàng)生物科技有限公司；TwistAmp?Basic kit購自英國TwistDX公司；HiPure Bacterial DNA Kit、HiPureMicro-Biome DNA Kit 和HiPure Gel Pure Micro Kit 購自廣州美基生物科技有限公司；Marker III 購自天根生化科技（北京）有限公司；TB Green?Premix Ex TaqTM（TliRNaseH Plus），Bulk 購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank 已公布的單增李斯特菌（CP025567.1）基因組DNA 序列，按照RPA 引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)引物，序列如下：LM-F：5'-AAATAGA ATAGGAACCCTGCTACTAAAATC-3'/LM-R：5'-GCA AGTAACATAGAAACACCTCTCCTTCAA-3'。引物由通用生物（安徽）有限公司合成。

1.3 RPA 反應(yīng)體系和程序的建立利用HiPure Bacterial DNA Kit 提取單增李斯特菌的基因組DNA，以其為模板，利用TwistAmp?Basic kit 反應(yīng)體系如下：LM-F（10 μmol/L）2.1 μL、LM-R（10 μmol/L）2.1 μL、2×Reaction Buffer 25 μL、10×Basic E-mix 5 μL、dNTP（1.8 mmol/L）2.25 μL、細(xì)菌基因組1 μL、ddH2O 7.55 μL、20×core Reaction mix 2.5 μL、MgOAc（280 mmol/L）2.5 μL 共50 μL 反應(yīng)體積，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，充分混勻后將反應(yīng)體系在37 ℃條件下孵育30 min。按照HiPure Gel Pure Micro Kit 產(chǎn)品說明書對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化后的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.4 RPA 最適反應(yīng)溫度和時(shí)間的優(yōu)化配置RPA反應(yīng)體系，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，在37 ℃條件下，采用方陣法進(jìn)行最適反應(yīng)時(shí)間篩選（5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min）和最適反應(yīng)溫度篩選（25 ℃、30 ℃、37 ℃、42 ℃、45 ℃）。

1.5 特異性試驗(yàn)利用HiPure Bacterial DNA Kit 提取伊氏李斯特菌、無害李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、腸致病性大腸埃希菌O157、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA，利用建立的RPA 方法對(duì)單增李斯特菌及其它常見病原微生物基因組DNA 進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)價(jià)該反應(yīng)體系的特異性。

1.6 敏感性試驗(yàn)將提取的單增李斯特菌基因組DNA（3×106拷貝/μL）10 倍倍比稀釋，以3×106拷貝/μL～3×100拷貝/μL 基因組DNA 為模板，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，按照優(yōu)化后的反應(yīng)條件分別對(duì)其擴(kuò)增。

對(duì)單增李斯特菌菌液（106cfu/mL）進(jìn)行10 倍倍比稀釋，制成106cfu/mL～100cfu/mL 的樣品，各取1 mL 提取的基因組DNA 為模板按照優(yōu)化后的反應(yīng)條件分別對(duì)其擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。確定該方法的敏感性。

1.7 人工污染樣品的檢測(cè)鮮牛奶、牛肉、魚肉均從當(dāng)?shù)爻匈徺I，按照國標(biāo)（GB 4789.30-2016）的方法檢測(cè)，證實(shí)不含單增李斯特菌，可用于后續(xù)人工污染樣本的建立。量取50 mL 鮮牛奶分成50 份，即1 mL/份，隨機(jī)選取10份摻入單增李斯特菌至終濃度為106cfu/mL。稱取牛肉、魚肉樣品各10 g，加入90 mL生理鹽水中勻漿，取上清分成50 份，即1 mL/份，隨機(jī)選取10 份摻入單增李斯特菌至終濃度為106cfu/mL，利用HiPureMicroBiome DNA Kit 提取上述樣品的基因組DNA。應(yīng)用RPA 方法和熒光定量PCR（qPCR）方法[7]對(duì)污染樣本進(jìn)行快速檢測(cè)，同時(shí)利用國標(biāo)（GB 4789.30-2016）檢測(cè)方法作為對(duì)照，以驗(yàn)證該方法的適用性。

2 結(jié) 果

2.1 單增李斯特菌RPA 擴(kuò)增結(jié)果利用設(shè)計(jì)的特異性引物L(fēng)M-F/LM-R 對(duì)單增李斯特菌DNA 進(jìn)行RPA擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行柱純化。擴(kuò)增結(jié)果顯示獲得一條約320 bp 的目的條帶，與預(yù)期相符（圖1）。表明特異性引物L(fēng)M-F/LM-R可用于檢測(cè)單增李斯特菌。

圖1 單增李斯特菌目的基因的RPA 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification of L.monocytogenes target gene by RPA

2.2 RPA 反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果使RPA 反應(yīng)體系在37 ℃條件下，采用方陣法篩選最適反應(yīng)時(shí)間和最適反應(yīng)溫度，結(jié)果顯示反應(yīng)時(shí)間在15 min～30 min 之間均可獲得約320 bp 大小的目的片段，而5 min 的反應(yīng)時(shí)間下無擴(kuò)增，10 min 的反應(yīng)時(shí)間下可獲得微弱的目的條帶（圖2）。因此，最終確定15 min 為最適反應(yīng)時(shí)間。

圖2 單增李斯特菌RPA 檢測(cè)體系最適反應(yīng)時(shí)間篩選Fig.2 Optimal amplification time of the RPA system targeting L.monocytogenes

反應(yīng)溫度在25 ℃～45 ℃之間均可獲得約320 bp大小的目的片段，當(dāng)反應(yīng)溫度在42 ℃時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)量最高，37 ℃時(shí)產(chǎn)物量略減少，而25 ℃、30 ℃和45 ℃時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物較低（圖3）。因此，最終確定42 ℃為最適反應(yīng)溫度。

圖3 單增李斯特菌RPA 檢測(cè)體系最適反應(yīng)溫度篩選Fig.3 Optimal amplification temperature of the RPA system targeting L.monocytogenes

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果對(duì)單增李斯特菌及伊氏李斯特菌、無害李斯特菌、斯氏李斯特菌、格氏李斯特菌、腸致病性大腸埃希菌O157、沙門氏菌、蠟樣芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌基因組DNA 進(jìn)行RPA 檢測(cè)，結(jié)果顯示，該方法僅對(duì)單增李斯特菌擴(kuò)增獲得約320 bp 大小的目的片段，而對(duì)其他細(xì)菌基因組DNA 均無特異性擴(kuò)增（圖4）。可見該方法能夠特異性的擴(kuò)增致病性的單增李斯特菌，但對(duì)其它常見的食源性微生物和非致病性的李斯特菌無擴(kuò)增。表明該方法特異性較強(qiáng)。

圖4 特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Specificity test of the RPA system targeting L.monocytogenes

2.4 敏感性試驗(yàn)結(jié)果分別以10 倍倍比稀釋的基因組DNA 3×106拷貝/μL～3×100拷貝/μL 和106cfu/mL～100cfu/mL 菌液1 mL 提取的基因組DNA 為模板，進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。結(jié)果顯示該RPA 檢測(cè)系統(tǒng)的最低檢出限分別為3×102拷貝/μL（圖5A）和103cfu/mL（圖5B），表明單增李斯特菌RPA 方法敏感性較高。

圖5 敏感性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Sensitivity test of the RPA system targeting to L.monocytogenes

2.5 人工污染樣品的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用本研究建立的單增李斯特菌RPA 方法和已報(bào)道的qPCR 方法分別對(duì)人工污染的50 份鮮牛奶、50 份牛肉勻漿和50 份魚肉勻漿樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，各污染樣品檢出率均為20%，各樣品均有10 份陽性樣品，RPA 方法與qPCR 方法和國標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果一致，表明RPA方法可以用于臨床樣品的單增李斯特菌污染測(cè)定。

3 討 論

單增李斯特菌被世界衛(wèi)生組織（WHO）列入20世紀(jì)90 年代食品污染的重要致病菌，廣泛存在于各類肉制品、水產(chǎn)品、奶制品等。單增李斯特菌的傳統(tǒng)的檢測(cè)方法包括前增菌、分離培養(yǎng)、生化實(shí)驗(yàn)等復(fù)雜的檢測(cè)流程，不僅需要較長的鑒定時(shí)間，而且檢測(cè)通量低，無法滿足細(xì)菌性疾病暴發(fā)和食物中毒等臨床快速檢驗(yàn)。因此，分子生物學(xué)診斷技術(shù)在很多應(yīng)用性檢測(cè)中逐漸替代了傳統(tǒng)的生化培養(yǎng)診斷。目前，基于分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)單增李斯特菌的研究有很多。楊國興等人基于單增李斯特菌內(nèi)化素基因（inlA）設(shè)計(jì)特異性引物，建立了多重PCR 檢測(cè)方法同時(shí)檢測(cè)多種病原微生物[8]。該方法可以同時(shí)檢測(cè)4 種食源性病原微生物，檢測(cè)時(shí)間為2 h，靈敏度為103cfu/mL。然而該實(shí)驗(yàn)依賴于溫度梯度PCR 儀，限制了在實(shí)驗(yàn)設(shè)備匱乏的應(yīng)用場(chǎng)景。O'Grady 等以單增李斯特菌ssr A 基因設(shè)計(jì)引物，建立了qPCR 檢測(cè)方法，并測(cè)定了天然和人工染菌的食物中的單增李斯特菌[9]。雖然qPCR 實(shí)驗(yàn)技術(shù)將檢測(cè)控制在1.5 h 以內(nèi)，但該實(shí)驗(yàn)不僅需昂貴的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀器，而且對(duì)樣本純度要求非常高，模板中的雜質(zhì)會(huì)抑制DNA 聚合酶的活性，影響擴(kuò)增熒光信號(hào)的強(qiáng)度[10]。王瑞娜等通過環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）擴(kuò)增單增李斯特菌的inlA 基因，并通過橫向流動(dòng)試紙條來檢測(cè)擴(kuò)增的核酸產(chǎn)物[11]。雖然LAMP 技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備要求低，僅需要一臺(tái)可設(shè)定為65 ℃恒溫水浴鍋即可完成實(shí)驗(yàn)，適合于基層檢測(cè)，但該方法也存在了一定的弊端。一方面，引物設(shè)計(jì)時(shí)需要選定6 個(gè)獨(dú)立的區(qū)域設(shè)計(jì)2對(duì)特殊的引物，增加了引物設(shè)計(jì)的難度。另一方面，反應(yīng)結(jié)果的判定根據(jù)肉眼觀察擴(kuò)增副產(chǎn)物焦磷酸鎂的沉淀濁度，易出現(xiàn)誤判的情況[12]。

近年由于RPA 技術(shù)的興起，被廣泛應(yīng)用于多種病原生物的檢測(cè)。姜一曈等基于犬細(xì)小病毒VP2 基因的保守序列設(shè)計(jì)特異性引物，建立了犬細(xì)小病毒的RPA 快速檢測(cè)方法[13]。而單增李斯特菌的RPA 檢測(cè)應(yīng)用研究較少。RPA 技術(shù)成功的關(guān)鍵在于引物設(shè)計(jì)，其設(shè)計(jì)基本原則與普通PCR 相似，但也有不同之處。根據(jù)TwistAmp?Basic kit 的說明書中關(guān)于引物設(shè)計(jì)的指導(dǎo)原則：引物長度介于30 bp～36 bp，靶標(biāo)區(qū)域GC含量介于20%～70%，Tm值介于50 ℃～100 ℃，為降低引物二聚體或發(fā)卡結(jié)構(gòu)生成，可適當(dāng)引入錯(cuò)配堿基，同時(shí)擴(kuò)增產(chǎn)物長度不超過500 bp。本研究在單增李斯特菌基因組上篩選得到的最佳引物，正反向引物長度均為30 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約320 bp，軟件分析發(fā)夾結(jié)構(gòu)和二聚體自由能均較低，保證了RPA 檢測(cè)方法實(shí)施的可行性。雖然病原性檢測(cè)診斷時(shí)選取毒力基因是較為常見的研究手段，如：?jiǎn)卧隼钏固鼐膇nlA 基因[8,11]，可以特異性檢測(cè)到致病性病原菌，但另一方面也局限了引物設(shè)計(jì)。本研究在單增李斯特菌全基因組上篩選引物對(duì)，能夠特異性的擴(kuò)增致病性的單增李斯特菌，但對(duì)其它常見的食源性微生物和非致病性的李斯特菌無擴(kuò)增。

與普通PCR 技術(shù)和qPCR 技術(shù)相比，RPA 最顯著的特點(diǎn)是不依賴于高精密的溫控PCR 儀，無需高溫模板變性和引物退火，僅需要在25 ℃～45 ℃低溫條件下利用重組酶、鏈置換酶完成核酸的擴(kuò)增[7]。因此，減少了升降溫的過程，縮短了反應(yīng)時(shí)間。本研究建立的單增李斯特菌的RPA 檢測(cè)方法在15 min即可獲得準(zhǔn)確的檢測(cè)結(jié)果，遠(yuǎn)快于其它分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)。在RPA基礎(chǔ)擴(kuò)增體系內(nèi)加入不同的探針、修飾的引物，可以實(shí)現(xiàn)多樣化檢測(cè)。李林等根據(jù)非洲豬瘟病毒（ASFV）基因組序列設(shè)計(jì)特異性引物和exo 探針，建立了檢測(cè)ASFV 的實(shí)時(shí)熒光RPA 方法[14]。樊曉旭等根據(jù)塞尼卡谷病毒（SVV）基因組序列設(shè)計(jì)特異性的生物素標(biāo)記的引物和FAM 熒光基團(tuán)修飾的探針，建立了檢測(cè)SVV 的RPA-側(cè)流層析試紙條可視化檢測(cè)方法[15]。為模擬實(shí)際檢測(cè)場(chǎng)景，本研究選取了無單增李斯特菌污染的牛奶、牛肉、魚肉樣品，建立了人工污染實(shí)驗(yàn)樣本模型。將RPA 檢測(cè)結(jié)果與qPCR 方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較，獲得了一致性的檢測(cè)結(jié)果，證實(shí)了建立的單增李斯特菌RPA 方法的準(zhǔn)確性。

本研究建立一種用于檢測(cè)單增李斯特菌的RPA方法，反應(yīng)速度快、特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)流程簡(jiǎn)單，能夠進(jìn)行實(shí)時(shí)實(shí)地的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，滿足單增李斯特菌引起的疾病暴發(fā)和食物中毒等多種應(yīng)用場(chǎng)景診斷。