潘 永，李 晨，楊 陽，劉麗娟，楊 琦,4*

（1.貴州大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2. 貴州省畜禽資源遺傳管理站，貴州 貴陽 550025；3. 貴州大學(xué) 動物疫病研究所，貴州 貴陽 550025；4. 貴州省動物疫病與獸醫(yī)公共衛(wèi)生重點實驗室，貴州 貴陽 550025；5. 都勻市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，貴州 都勻 558000）

鼠傷寒沙門菌（Salmonella typhimurium LT2，STM LT2）是腸道沙門菌中較為重要的一個血清型，因其感染宿主廣泛且可引起人和動物嚴(yán)重的胃腸炎，長期以來給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。沙門菌的致病機(jī)制較復(fù)雜，如III 型分泌系統(tǒng)將超過30 種特化效應(yīng)蛋白遞送到宿主細(xì)胞中以破壞宿主細(xì)胞細(xì)胞骨架、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑、膜運輸和促炎反應(yīng)[1]。ABC 型超家族（ATP-binding cassette superfamily）轉(zhuǎn)運蛋白包括寡肽轉(zhuǎn)運蛋白（Oligopeptide permease，Opp）、二肽轉(zhuǎn)運蛋白（Dipeptide permease，Dpp），它們行使功能需要在ATP 水解產(chǎn)生能量的情況下實現(xiàn)，在細(xì)菌生長、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和趨化性上發(fā)揮重要作用。細(xì)菌的群體感應(yīng)是細(xì)胞與細(xì)胞之間通信的過程，細(xì)菌通過產(chǎn)生、分泌和檢測被稱為自誘導(dǎo)物的細(xì)胞外信號分子來評估其種群密度，從而協(xié)調(diào)基因的表達(dá)。細(xì)菌ABC 轉(zhuǎn)運通路以及群體感應(yīng)通路與細(xì)菌的致病機(jī)制有著密切聯(lián)系，而這種關(guān)系可能通過某些共表達(dá)基因聯(lián)結(jié)[2-4]。

Hfq 是一種非編碼小RNA 結(jié)合伴侶蛋白，在多種細(xì)菌中存在，并且在控制基因表達(dá)中起關(guān)鍵作用。Hfq 通過促進(jìn)非編碼小RNA 與其靶mRNA 的配對影響特定轉(zhuǎn)錄物的翻譯和轉(zhuǎn)換率來調(diào)控復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄后網(wǎng)絡(luò)。體內(nèi)外實驗證明hfq 基因的缺失導(dǎo)致鼠傷寒沙門菌的毒力、侵襲力、生長速度和運動力顯著降低，Hfq 在多種細(xì)菌的致病機(jī)制、ABC 轉(zhuǎn)運通路和群體感應(yīng)的控制中扮演重要角色[5]。本實驗室前期利用Hiseq 測序平臺對鼠傷寒沙門菌LT2 hfq 缺失株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對數(shù)期共516 個基因上調(diào)，539 個基因下調(diào)，穩(wěn)定期共496 個基因上調(diào)，463 個基因下調(diào)[6]。由于基因數(shù)目較多且在對數(shù)期和穩(wěn)定期轉(zhuǎn)錄水平的差異顯著性相差較大，而細(xì)菌在不同的生長時期有著不同的調(diào)控活動，因此需對鼠傷寒沙門菌hfq基因敲除后不同時期轉(zhuǎn)錄水平差異表達(dá)的基因進(jìn)行篩選。許多研究表明，依賴Hfq 發(fā)揮作用的sRNA 中，如主要調(diào)控細(xì)菌氨基酸攝取與合成相關(guān)基因表達(dá)的GcvB，當(dāng)hfq基因敲除后，GcvB所調(diào)控的靶基因及Hfq 直接調(diào)控的靶基因在細(xì)菌不同生長期仍表現(xiàn)為相同趨勢的差異表達(dá)[7-8]，這為本研究篩選Hfq 調(diào)控的相關(guān)基因提供了理論前提。

本研究基于前期對指數(shù)生長期和穩(wěn)定期的鼠傷寒沙門菌hfq 基因敲除株轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上，從篩選的差異表達(dá)基因中隨機(jī)挑選6 個，利用熒光定量PCR 檢測表達(dá)量，以此驗證轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠性，并在驗證結(jié)果可靠的前提下分別將對數(shù)期和穩(wěn)定期篩選為差異表達(dá)的基因注釋到GO terms 細(xì)菌致病機(jī)制生物學(xué)過程以及Pathway 細(xì)菌ABC 轉(zhuǎn)運通路和群體感應(yīng)兩大信號通路，以期篩選在對數(shù)期和穩(wěn)定期均表現(xiàn)為差異上調(diào)或下調(diào)表達(dá)，疑似受sRNA 伴侶蛋白Hfq 所調(diào)控的基因。

1 材料與方法

1.1 主要實驗材料野生型STM LT2 標(biāo)準(zhǔn)株（STM LT2 wild）由法國國家科學(xué)研究中心（CNRS）分子遺傳學(xué)Bossi 實驗室惠贈。STM LT2 hfq 基因缺失株（STM LT2 △hfq::cat）由 本 實 驗 室 構(gòu) 建。RNA 提 取 試 劑TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMII1st strand cDNA Synthesis Kit 以及熒光染料SYBR?Premix Ex TaqTMII（TliRNaseH Plus）均購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 差異表達(dá)基因熒光定量PCR 檢測將STM LT2 標(biāo)準(zhǔn)株和STM LT2 hfq 基因缺失株分別培養(yǎng)至對數(shù) 期（OD600nm≈0.4）和 穩(wěn) 定 期（OD600nm≈2.0），利 用Trizol 試劑分別提取標(biāo)準(zhǔn)株和缺失株不同時期的總RNA，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板，選擇GAPDH 作為內(nèi)參基因，參照文獻(xiàn)[6]結(jié)果隨機(jī)選取6個差異表達(dá)基因dppA、spaP、prgH、mgtC、eutH、invG，利用文獻(xiàn)[6]中相應(yīng)的6 對引物進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95 ℃30 s；95 ℃5 s、60 ℃30 s，40 個循環(huán)。每個樣本設(shè)3 個重復(fù)，樣本數(shù)值按照2-ΔΔct法計算相關(guān)基因mRNA 轉(zhuǎn)錄水平，對比相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄組測序與熒光定量PCR 結(jié)果是否有一致性，若數(shù)據(jù)可靠則進(jìn)行后續(xù)研究。引物均由上海英濰捷基公司合成。

1.3 GO 富集細(xì)菌致病機(jī)制生物學(xué)過程篩選Hfq 調(diào)控基因在轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠的前提下，將前期分別在STM LT2 hfq 基因缺失株對數(shù)期和穩(wěn)定期所篩選得到的差異表達(dá)基因通過注釋GO terms 中的致病機(jī)制生物學(xué)過程（Pathogenesis，GO：0009405），篩選受Hfq 調(diào)控的基因，保留對數(shù)期和穩(wěn)定期轉(zhuǎn)錄水平均差異上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)據(jù)。實驗以STM LT2 標(biāo)準(zhǔn)株作為對照。

1.4 Pathway 富集細(xì)菌ABC 轉(zhuǎn)運通路篩選Hfq 調(diào)控基因在轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠的前提下，將前期分別在STM LT2 hfq 基因缺失株對數(shù)期和穩(wěn)定期所篩選得到的差異表達(dá)基因通過KEGG 注釋Pathway 富集細(xì)菌ABC 轉(zhuǎn) 運 通 路（ABC transporters， Pathway ID：ko02010），篩選受Hfq 調(diào)控的基因。保留對數(shù)期和穩(wěn)定期轉(zhuǎn)錄水平均差異上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)據(jù)。實驗以STM LT2 標(biāo)準(zhǔn)株作為對照。

1.5 Pathway 富集細(xì)菌群體感應(yīng)通路篩選Hfq 調(diào)控基因在轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果可靠的前提下，將前期分別在STM LT2 hfq 基因缺失株對數(shù)期和穩(wěn)定期所篩選得到的轉(zhuǎn)錄水平差異表達(dá)基因通過KEGG 注釋Pathway 富集細(xì)菌群體感應(yīng)通路（Quorum sensing，Pathway ID：ko02024），篩選受Hfq 調(diào)控的基因。保留對數(shù)期和穩(wěn)定期轉(zhuǎn)錄水平均差異上調(diào)或下調(diào)表達(dá)的基因數(shù)據(jù)。實驗以STM LT2 標(biāo)準(zhǔn)株作為對照。

2 結(jié) 果

2.1 熒光定量PCR 驗證結(jié)果從兩組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中隨機(jī)挑取6 個轉(zhuǎn)錄水平差異表達(dá)的基因dppA、spaP、prgH、mgtC、eutH、invG，用熒光定量PCR驗證前期轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可靠性，結(jié)果顯示，在STM LT2 hfq基因缺失株轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中表現(xiàn)為對數(shù)期或穩(wěn)定期轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的基因，在熒光定量PCR結(jié)果中也出現(xiàn)相同趨勢（表1）。表明前期的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)可靠，可進(jìn)行后續(xù)的實驗研究。

表1 差異表達(dá)基因的熒光定量PCR 驗證結(jié)果Table 1 Results of the real-time PCR for differentially expressed genes

2.2 GO 富集細(xì)菌致病機(jī)制生物學(xué)過程篩選Hfq 調(diào)控基因結(jié)果將分別在鼠傷寒hfq 基因缺失株對數(shù)期和穩(wěn)定期所篩選得到的轉(zhuǎn)錄水平差異表達(dá)基因通過注釋GO terms 中的致病機(jī)制生物學(xué)過程。結(jié)果顯示，共篩選到28 個受hfq 基因缺失影響轉(zhuǎn)錄水平差異表達(dá)上調(diào)或下調(diào)的基因，差異表達(dá)倍數(shù)均在2 倍以上，占鼠傷寒沙門菌致病機(jī)制生物學(xué)過程相關(guān)基因的35%。除hfq 基因外，共篩選到13 個基因ydiV、STM1583、sifB、rpoE、hilA、spaS、spaP、invI、invB、invA、invG、invF 和mgtC 在對數(shù)期和穩(wěn)定期轉(zhuǎn)錄水平均表達(dá)上調(diào)（圖1），而穩(wěn)定期轉(zhuǎn)錄水平普遍高于對數(shù)期。表明Hfq 調(diào)控鼠傷寒沙門菌的致病機(jī)制，13 個致病機(jī)制相關(guān)基因在鼠傷寒沙門菌對數(shù)期和穩(wěn)定期均受Hfq 的負(fù)調(diào)控。

圖1 細(xì)菌致病機(jī)制生物學(xué)過程相關(guān)基因的表達(dá)量Fig.1 Expression of genes related to bacterial pathogenesis

2.3 Pathway 富集細(xì)菌ABC 轉(zhuǎn)運通路篩選Hfq 調(diào)控基因結(jié)果將分別在STM LT2 hfq 基因缺失株對數(shù)期和穩(wěn)定期所篩選得到的轉(zhuǎn)錄水平差異表達(dá)的基因通過注釋KEGG 數(shù)據(jù)庫中的細(xì)菌ABC 轉(zhuǎn)運通路。結(jié)果顯示，總共篩選到95 個受hfq 基因缺失影響的轉(zhuǎn)錄水平差異表達(dá)上調(diào)或下調(diào)基因，差異表達(dá)倍數(shù)均在2 倍以上，占鼠傷寒沙門菌ABC 轉(zhuǎn)運通路相關(guān)基因的52%，其中20 個基因STM1491、STM1492、STM1493、STM1494、STM1678、mppA、cbiO、cboQ、cbiM、ccmC、ccmB、ccmA、sitD、ugpB、pstC、pstS、malK、yabJ、potF 和ybjZ 在對數(shù)期和穩(wěn)定期均受到不同程度的影響（圖2）。其中在對數(shù)期和穩(wěn)定期中轉(zhuǎn)錄水平差異表達(dá)趨勢相同的基因，均上調(diào)的有yabJ、ybjZ、cbiO、cboQ、cbiM、ccmC、ccmB、sitD和ccmA 基因，均下調(diào)的有ugpB 和malK 基因。以上結(jié)果表明，Hfq 調(diào)控鼠傷寒沙門菌的ABC 轉(zhuǎn)運系統(tǒng)，9 個ABC 轉(zhuǎn)運通路相關(guān)基因在鼠傷寒沙門菌對數(shù)期和穩(wěn)定期均受Hfq 的負(fù)調(diào)控，2 個ABC 轉(zhuǎn)運通路相關(guān)基因在鼠傷寒沙門菌對數(shù)期和穩(wěn)定期均受Hfq 的正調(diào)控。

圖2 細(xì)菌ABC 轉(zhuǎn)運通路相關(guān)基因的表達(dá)量Fig.2 Expression of genes related to bacterial ABC transport pathway

2.4 Pathway 富集細(xì)菌群體感應(yīng)通路篩選Hfq 調(diào)控基因結(jié)果將分別在STM LT2 hfq 基因缺失株對數(shù)期和穩(wěn)定期所篩選得到的轉(zhuǎn)錄水平差異表達(dá)基因通過注釋KEGG 數(shù)據(jù)庫中的細(xì)菌群體感應(yīng)通路。結(jié)果顯示，共篩選到31 個受hfq 基因缺失影響的轉(zhuǎn)錄水平差異表達(dá)上調(diào)或下調(diào)基因，差異表達(dá)倍數(shù)均在2 倍以上，占鼠傷寒沙門菌群體感應(yīng)通路相關(guān)基因的46%，其中有5 個基因yjeM、STM1678、yaeL、hfq 和mppA 在對數(shù)期和穩(wěn)定期均受到不同程度的影響（圖3）。除hfq 基因轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)均下調(diào)外，yjeM 和yaeL基因均上調(diào)。結(jié)果表明，Hfq 調(diào)控鼠傷寒沙門菌的群體感應(yīng)通路，2 個群體感應(yīng)通路相關(guān)基因在鼠傷寒沙門菌對數(shù)期和穩(wěn)定期均受Hfq 的負(fù)調(diào)控。

圖3 細(xì)菌群體感相關(guān)基因的表達(dá)量Fig.3 Expression of genes related to bacterial quorum sensing

3 討 論

關(guān)于細(xì)菌RNA 結(jié)合蛋白在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因表達(dá)的研究正變得越來越重要。由于Hfq 普遍存在于各種細(xì)菌中，調(diào)控機(jī)理復(fù)雜且尚未研究透徹，篩選可能性最大的靶基因?qū)罄m(xù)鑒定成功率具有助推意義。本研究通過熒光定量PCR 對隨機(jī)挑選的6 個差異表達(dá)基因進(jìn)行表達(dá)量的檢測，檢測結(jié)果與RNA-seq 結(jié)果相比，在表達(dá)量上存在一定差別，但這種差別是整體性的降低或升高，表明熒光定量PCR 檢測更加靈敏，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是由于轉(zhuǎn)錄組測序儀器的敏感性較低所致，而qRT-PCR檢測結(jié)果中各差異表達(dá)基因間的相對上調(diào)或下調(diào)趨勢與RNA-seq 結(jié)果完全相同，證明本次轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可靠，可用于進(jìn)一步的分析。

本研究分別從3 個方面篩選到除Hfq 外在兩個時期均出現(xiàn)差異表達(dá)的基因共37 個，細(xì)菌致病機(jī)制生物學(xué)過程中除Hfq 表達(dá)下調(diào)外，其它13 個基因ydiV、STM1583、sifB、rpoE、hilA、spaS、spaP、invI、invB、invA、invG、invF 和mgtC 呈現(xiàn)上調(diào)趨勢，其中有一半以上基因參與沙門菌III 型分泌系統(tǒng)（T3SS）核心結(jié)構(gòu)-針狀復(fù)合體裝置蛋白和效應(yīng)蛋白的形成，主要由SPI-1 和SPI-2 基因編碼，負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)病原菌中的毒力蛋白輸出，由此推測Hfq 在正常情況下可能對STM LT2 III 型分泌系統(tǒng)（T3SS）相關(guān)毒力基因的表達(dá)活動進(jìn)行負(fù)調(diào)控，并且穩(wěn)定期表達(dá)量普遍高于對數(shù)期，這種情況不排除細(xì)菌處于對數(shù)生長期時優(yōu)越的環(huán)境及營養(yǎng)條件信號促使細(xì)菌抑制致病機(jī)制生物學(xué)活動。也可能歸因于Hfq 在穩(wěn)定期細(xì)菌受外界環(huán)境壓力時受到抑制作用并且激發(fā)應(yīng)對外來干擾的機(jī)制[9]。ABC 轉(zhuǎn)運通路中共篩選到20 個基因，其中有11個基因在兩個時期均表現(xiàn)為統(tǒng)一上調(diào)或下調(diào)，均表達(dá)上調(diào)的有yabJ、ybjZ、cbiO、cboQ、cbiM、ccmC、ccmB、sitD 和ccmA 基因，其中值得關(guān)注的是參與細(xì)菌I 型細(xì)胞色素成熟系統(tǒng)（CCM）的基因ccmA、ccmB 和ccmC，它們執(zhí)行一種或多種對細(xì)菌生理學(xué)和生長至關(guān)重要的功能，包括鐵載體產(chǎn)生和利用，以及銅敏感性和錳氧化的改變等[10]，它們可能受到Hfq 的抑制作用，均下調(diào)的有ugpB 和malK基因，ugpB 在結(jié)核分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)其介導(dǎo)周質(zhì)空間中sn-甘油-3-磷酸（G3P）或甘油磷酸膽堿（GPC）分子的隔離，屬于ABC 轉(zhuǎn)運超家族成員[11]，malK 在鼠傷寒沙門菌中編碼麥芽糖ABC 轉(zhuǎn)運蛋白參與ATP 水解的亞基，Hfq 可能參與它們表達(dá)的正向調(diào)控。其余9 個 基 因potF、STM1491、STM1492、STM1493、STM1494、pstC 和pstS 先 上 調(diào) 后 下 調(diào)，STM1678 和mppA 基因先下調(diào)后上調(diào)，這種差異的產(chǎn)生懷疑受調(diào)控的因子不僅僅局限于Hfq 蛋白，Hfq 可能僅參與間接作用或不參與調(diào)控，這些基因可能在細(xì)菌響應(yīng)外界環(huán)境脅迫信號后通過其它機(jī)制進(jìn)行調(diào)節(jié)[12]。群體感應(yīng)通路中，篩選到4 個共表達(dá)基因，其中yjeM 和yaeL 基因均表現(xiàn)為上調(diào)，yjeM 是推定的APC 家族氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白，目前對其研究較少，在霍亂弧菌中發(fā)現(xiàn)yaeL 編碼的蛋白酶能夠降解毒力激活劑TcpP 蛋白從而影響細(xì)菌毒力[12]。

此前有相關(guān)研究應(yīng)用高通量焦磷酸測序技術(shù)（HTPS）對STM LT2 hfq 基因缺失株進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Hfq 是一種影響近五分之一沙門菌基因表達(dá)的全局調(diào)節(jié)因子，缺失造成279 個基因上調(diào)，455 個基因下調(diào)[13]。與之對比，本研究篩選到的26 個可疑基因中有11 個基因ydiV、STM1583、mgtC、 cbiO、 cboQ、 cbiM、 ccmC、 ccmB、 ccmA、malK 和yjeM 未見其報道，產(chǎn)生這種差異的原因可能與測序平臺的選擇或篩選方式等其它因素有關(guān)[14]。11 個可疑基因中有5 個基因目前未見與Hfq 相關(guān)研究，包括編碼細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)蛋白為沙門菌在小鼠脾臟定植所需的STM1583 基因，存在于沙門菌SPI-2 毒力島；沙門菌在鎂缺乏培養(yǎng)基和巨噬細(xì)胞中存活起關(guān)鍵作用編碼Mg2+轉(zhuǎn)運蛋白的mgtC 基因，由沙門菌SPI-3 毒力島攜帶[15]；與鈷轉(zhuǎn)運蛋白相關(guān)的cbiO 和cboQ 基因以及編碼推定的APC 家族氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的yjeM 基因，5 個基因均參與沙門菌的毒力及生長活動。

本研究對敲除hfq 基因的STM LT2 對數(shù)期和穩(wěn)定期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進(jìn)行再分析，從眾多差異表達(dá)基因中篩選到與細(xì)菌致病機(jī)制生物學(xué)過程以及ABC 轉(zhuǎn)運通路和群體感應(yīng)相關(guān)差異表達(dá)基因26 個，它們分別在細(xì)菌對數(shù)期和穩(wěn)定期表現(xiàn)同一趨勢的上調(diào)或下調(diào)，并預(yù)測其受sRNA 伴侶蛋白Hfq 調(diào)控，為后期驗證試驗以及sRNA 伴侶蛋白Hfq 對鼠傷寒沙門菌調(diào)控機(jī)理的下游研究奠定基礎(chǔ)，并提供了參考數(shù)據(jù)。