賴盼建 張維溪 李小兵

壞死性小腸結腸炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是新生兒科常見的急危重癥之一，死亡率高達20%～30%[1]。近年來，NEC發(fā)病率有增加趨勢，可能與其發(fā)病機制尚不清楚有關。早產、低體重和配方奶喂養(yǎng)等被認為是NEC的高風險因素，與新生兒（尤其是早產兒）腸黏膜損傷有關。目前臨床上主要采取支持治療，但預后不理想[2]?，F(xiàn)有研究表明，NEC腸黏膜損傷可能是氧自由基介導的炎癥因子釋放的結果，包括TNF、血小板活化因子、IL等；而且發(fā)現(xiàn)炎癥因子的釋放、炎癥反應以及活化的多形核白細胞的遷移會導致活性氧過量產生。這些活性物質的有害作用通過多種機制（包括細胞膜脂質過氧化和細胞蛋白氧化等途徑）損傷細胞并誘導細胞死亡[3]。磷脂酰膽堿是胃腸黏膜屏障的主要脂質，對黏膜有保護作用，并調節(jié)炎癥信號系統(tǒng)。實驗表明，磷脂層缺陷或損傷可引起炎癥，易導致NEC[4]。因此，筆者推測外源性磷脂酰膽堿對NEC有一定的治療作用。故本研究擬采用胞嘧啶核苷二磷酸膽堿（CDP-膽堿）干預NEC新生大鼠模型，以探討CDP-膽堿對NEC所致的腸道炎癥、腸黏膜損害及壞死的治療作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 新生（3日齡）清潔級SD大鼠40只，由浙江省醫(yī)科院實驗動物中心提供[許可證號：scxk（浙）20140001]，均飼養(yǎng)在無特定病原體環(huán)境中。本研究經金華市食品藥品檢驗檢測研究院動物實驗倫理委員會審查通過。

1.2 主要試劑與儀器 Beclin-1抗體（ab55878）和LC3Ⅱ抗體（ab128025）購自英國Abcam公司；驢抗兔二抗（A21206）購自美國Life Technology公司；ELISA試劑盒（CSB-E11987r、CSB-E08055r、CSB-E04640r）購自武漢華美生物工程有限公司。顯微鏡（BX53）購自日本OLYMPUS公司；酶標儀（Model680）購自美國BIO-RAD公司。

1.3 動物分組及處理 40只大鼠按隨機數(shù)字表法分成4組，每組10只。（1）空白對照組：正常母鼠喂養(yǎng)，無任何干預措施[5]。（2）NEC對照組：脫離母鼠、采用配方奶進行人工滴灌喂養(yǎng)，3次/d；依次用CO2（流量4 L/min）灌籠約10 min（直至動物膚色變紫）、O2（流量4 L/min）灌籠約8 min（直到動物膚色轉紅、呼吸恢復）、0℃冰箱中放置5 min，每日晨晚各1次，間隔12 h；腹腔注射0.9%氯化鈉注射液，1次/d，劑量30 ml/（kg·d）。（3）CDP-膽堿治療組：脫離母鼠、采用配方奶進行人工滴灌喂養(yǎng)，3次/d；依次用CO2（流量4 L/min）灌籠約10 min（直至動物膚色變紫）、O2（流量4 L/min）灌籠約8 min（直到動物膚色轉紅、呼吸恢復）、0℃冰箱中放置5 min，每日晨晚各1次，間隔12 h；腹腔注射CDP-膽堿注射液（2 ml∶0.1 g，國藥準字 H22026207，吉林百年漢克制藥有限公司），1次/d，劑量0.1 ml/（kg·d）。（4）CDP-膽堿對照組：正常母鼠喂養(yǎng)，同時腹腔注射CDP-膽堿注射液，1次/d，劑量0.1 ml/（kg·d）。實驗第7天采用腹腔注射過量水合氯醛處死大鼠，打開腹腔并從幽門后5 cm處開始往下取1 cm腸段進行腸道組織病理學觀察，再往下取4 cm腸段進行腸道組織細胞自噬程度檢測和炎癥因子水平檢測。

1.4 腸道組織病理學檢測 腸段用4%多聚甲醛固定72 h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，6 μm切片，常規(guī)HE染色，樹膠封片，置于光鏡下觀察并進行組織學評價。采用Shiou評分法[6]：腸黏膜絨毛完整，組織結構正常為0分；輕微的黏膜下和（或）固有層腫脹分離為1分；中度的黏膜下和（或）固有層分離，黏膜下和（或）肌層水腫為2分；重度的黏膜下和（或）固有層分離，黏膜下和（或）肌層水腫，局部絨毛脫落為3分；腸絨毛消失伴腸壞死為4分。

1.5 腸道組織細胞自噬程度檢測 采用免疫熒光法。腸道組織常規(guī)切片，二甲苯脫蠟，梯度乙醇復水，抗原修復，滴加相應的Beclin-1和LC3Ⅱ抗體，4℃孵育過夜，PBS水洗3×3 min，并設PBS作為陰性對照；滴加二抗，37 ℃孵育 60 min，PBS 沖洗 3×5 min；4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染核，室溫10 min；甘油PBS封片；置于熒光顯微鏡下觀察。藍色為細胞核，綠色熒光為Beclin-1和LC3Ⅱ。Beclin-1和LC3Ⅱ熒光強度越強，表示自噬越嚴重。

1.6 腸道組織炎癥因子水平檢測 采用ELISA法。腸段稱重后進行勻漿，4℃、12 000 g離心20 min；取上清液檢測TNF-α、IL-6和IL-1β水平。按照說明書步驟測定各樣本孔的吸光度（OD），利用標準品的OD值和濃度繪制標準曲線并轉化出公式，最后根據所測樣本的OD值計算其濃度。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 4組大鼠腸道組織病理學觀察 空白對照組、CDP-膽堿治療組和CDP-膽堿對照組大鼠腸黏膜上皮連續(xù)、完整，細胞與腺體排列規(guī)則，未見炎癥細胞浸潤；NEC對照組大鼠腸絨毛普遍水腫，黏膜及黏膜下層可見以中性粒細胞為主的大量炎癥細胞，毛細血管有擴張，血管外可見紅細胞，部分腸上皮細胞消失，見圖1（插頁）。4組大鼠腸道組織Shiou評分比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；其中NEC對照組 Shiou評分明顯高于其他3組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；而CDP-膽堿治療組、CDP-膽堿對照組、空白對照組之間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 4組大鼠腸道組織Shiou評分比較（分）

2.2 4組大鼠腸道組織細胞自噬程度比較 在相同檢測條件下，NEC對照組大鼠腸道組織Beclin-1、LC3Ⅱ熒光強度明顯增強，而CDP-膽堿治療組、CDP-膽堿對照組、空白對照組間熒光強度差異不明顯，見圖2-3（插頁）。

圖1 4組大鼠腸道組織病理學觀察所見（NEC為壞死性小腸結腸炎，CDP-膽堿為胞嘧啶核苷二磷酸膽堿；a：空白對照組；b：NEC對照組；c：CDP- 膽堿治療組；d：CDP- 膽堿對照組；HE 染色，×200）

圖2 4組大鼠腸道組織Beclin-1熒光強度比較（NEC為壞死性小腸結腸炎，CDP-膽堿為胞嘧啶核苷二磷酸膽堿；a：空白對照組；b：NEC對照組；c：CDP-膽堿治療組；d：CDP-膽堿對照組；免疫熒光法，×400）

圖3 4組大鼠腸道組織LC3Ⅱ熒光強度比較（NEC為壞死性小腸結腸炎，CDP-膽堿為胞嘧啶核苷二磷酸膽堿；a：空白對照組；b：NEC對照組；c：CDP- 膽堿治療組；d：CDP- 膽堿對照組；免疫熒光法，×400）

2.3 4組大鼠腸道組織炎癥因子水平比較 4組大鼠腸道組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；其中NEC對照組上述炎癥因子水平均明顯高于其他3組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；而CDP-膽堿治療組、CDP-膽堿對照組、空白對照組之間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表 2。

表2 4組大鼠腸道組織炎癥因子水平比較（ng/L）

3 討論

NEC是新生兒科常見的胃腸道急危重癥之一，病死率較高。研究表明，NEC腸道組織損害是由于非自然狀態(tài)下的腸道組織受到了傷害性刺激，機體產生了大量的氧自由基，在氧自由基的介導下各種炎癥因子大量釋放，使腸道組織發(fā)生炎性損害[4]。本研究采用CO2灌籠再轉為O2灌籠最后低溫刺激2次/d的干預方式建立大鼠NEC模型，同時使用CDP-膽堿治療，結果發(fā)現(xiàn)NEC對照組腸道組織TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯高于其他3組，提示TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子在NEC大鼠的腸道組織損傷甚至細胞死亡過程中扮演了重要角色。使用CDP-膽堿進行干預后，TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子水平明顯下降，提示CDP-膽堿對改善NEC大鼠的腸道組織炎癥反應具有明確的作用。

磷脂酰膽堿是一種位于胃腸道黏膜與黏液層之間的主要脂質，對黏膜具有保護作用，并調節(jié)炎癥信號系統(tǒng)。NEC的發(fā)生與磷脂層缺陷或損傷有關，有研究表明外源性磷脂酰膽堿給藥對潰瘍性結腸炎具有良好的療效[4-5]。而CDP-膽堿在磷脂酰膽堿的合成中起著重要作用，同時與甘油二酯水平的升高和游離脂肪酸的降低有關，臨床上常作為腦細胞代謝激活劑，特別對于遲發(fā)性神經損傷、防止凋亡調控因子Caspase-3的活化和減少細胞凋亡具有重要意義[7-8]。本實驗結果發(fā)現(xiàn)，CDP-膽堿對NEC炎癥反應有一定的保護效應。Cetinkaya等[9]也報道了NEC大鼠腸損害時腸道組織膜磷脂減少，而CDP-膽堿能明顯提高總磷脂和磷脂酰膽堿水平。

研究證實，早產兒NEC發(fā)病早期往往會發(fā)生腸黏膜上皮細胞的通透性增加，該事件會啟動一系列細胞凋亡過程，同時出現(xiàn)自噬現(xiàn)象[10]。細胞中出現(xiàn)自噬體是自噬的標志，主要由微管相關蛋白LC3Ⅱ介導形成[11]。而Beclin-1是Ⅲ型PI3-激酶復合物的主要成分，在細胞自噬泡的形成過程中必不可少，被認為是一種能代表自噬水平的標志物[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，NEC對照組大鼠腸道組織中微管相關蛋白LC3Ⅱ及自噬基因Beclin-1熒光強度明顯增強，而CDP-膽堿治療組、CDP-膽堿對照組、空白對照組間熒光強度差異不明顯，提示CDP-膽堿可下調NEC大鼠腸道組織細胞自噬水平。已有實驗在NEC動物模型中證實細胞凋亡是細胞自噬的一種延續(xù)[10]，提示CDP-膽堿可有效保護腸道細胞在病理刺激下的調亡。另有研究發(fā)現(xiàn)，大鼠NEC疾病模型與臨床病例的回腸部位腸黏膜上皮細胞自噬過程被激活[13]。

綜上所述，CDP-膽堿能有效抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達，從而使受損腸道的級聯(lián)炎癥反應難以持續(xù)，同時還能降低腸黏膜細胞的自噬水平，從而減少細胞凋亡，這說明CDP-膽堿對新生大鼠NEC有明顯治療作用。