張圓，黃曉晨，高一珊，康貝寧，李增寬，趙勇，閔令江

（1.濟(jì)寧市畜牧業(yè)發(fā)展中心，山東 濟(jì)寧 272000；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，山東 青島 266109）

我國(guó)地方羊種類多樣。濟(jì)寧青山羊是我國(guó)典型的地方品種，原產(chǎn)于山東省濟(jì)寧市和菏澤市的各個(gè)縣區(qū)。外貌特征通常被定義為“四青一黑”，青色可以根據(jù)黑白毛的比例再次劃分為三種毛色，即正青色、粉青色和鐵青色，其中正青色最常見［1］。

繁殖力高是濟(jì)寧青山羊的顯著特點(diǎn)。根據(jù)《中國(guó)羊品種志》記載，在我國(guó)各種地方羊品種中，濟(jì)寧青山羊的繁殖力最高，大多數(shù)地方品種繁殖力較低［2］。濟(jì)寧青山羊一直以多胎高產(chǎn)、常年發(fā)情、全年可配種、適應(yīng)性強(qiáng)、羔皮質(zhì)量好而出名。母羊年產(chǎn)兩胎或兩年三胎，普通山羊排卵數(shù)一般為2～3個(gè)，濟(jì)寧青山羊可達(dá)5個(gè)以上，平均窩產(chǎn)仔數(shù)2.94只，高產(chǎn)者可達(dá)6～7只［3］。研究發(fā)現(xiàn)，濟(jì)寧青山羊每胎的產(chǎn)羔數(shù)隨著胎次的增加而增加，直到第四胎或第五胎達(dá)到產(chǎn)羔數(shù)的高峰期［4］。

FecB基因最初在布魯拉美利奴羊中發(fā)現(xiàn)，后證實(shí)該基因的確存在且能影響綿羊排卵率和繁殖力，1989年正式被綿、山羊遺傳命名委員會(huì)命名為FecB基因［5］。FecB基因是一個(gè)高繁殖力主效基因，由BMPR-IB基因編碼區(qū)的第746 bp發(fā)生A→G的堿基突變而形成。自FecB基因發(fā)現(xiàn)以來(lái)，研究人員針對(duì)該基因展開了分析研究。母羊若發(fā)生FecB基因突變，會(huì)影響與之識(shí)別的配體GDF-5和BMP-4對(duì)類固醇生成作用的反應(yīng)，削弱對(duì)顆粒細(xì)胞的抑制作用，促進(jìn)卵泡加快成熟以及增加排卵數(shù)［6］。FecB基因?qū)ε怕崖实挠绊懯羌有缘?，攜帶一個(gè)拷貝基因的排卵率為1.3～1.6，攜帶兩個(gè)為2.7～3.0［7］。柳淑芳等［8］研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)ecB基因能大大提高母羊的發(fā)情率，增強(qiáng)繁殖性能，一般非多胎性品種在非繁殖性季節(jié)的發(fā)情率極低，大約為20% ～30%，而攜帶FecB基因的母羊不僅能一年四季都發(fā)情，而且在非繁殖性季節(jié)，發(fā)情率也不低于60%。

PCR-RFLP技術(shù)作為一種DNA分子標(biāo)記技術(shù)，與傳統(tǒng)RFLP標(biāo)記相比，具有不需要克隆基因作探針，不依賴Southern blot技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，而且方法簡(jiǎn)便，分型時(shí)間短，逐漸用于動(dòng)物育種中［9］。王根林等［10］以湖羊和小尾寒羊?yàn)檠芯繉?duì)象，運(yùn)用PCR-RFLP技術(shù)在兩種羊中均檢測(cè)出了FecB基因。馬麗娜等［11］在373只灘羊上利用TaqMan探針對(duì)FecB基因進(jìn)行SNP分型研究，共發(fā)現(xiàn)三種基因型，對(duì)比其產(chǎn)羔數(shù)發(fā)現(xiàn)FecB基因能有效提高繁殖力，可通過(guò)基因型選育加快多羔品系的培育。劉錚鑄等［12］采用PCR-RFLP技術(shù)分析山羊MyoG基因的多態(tài)性，利用限制性核酸內(nèi)切酶Csp6Ⅰ對(duì)山羊MyoG基因的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，結(jié)果發(fā)現(xiàn)山羊MyoG內(nèi)含子二區(qū)域存在多態(tài)性。

自FecB基因發(fā)現(xiàn)以來(lái)，大量研究報(bào)道了該基因與綿羊的相關(guān)性，而對(duì)山羊的研究較少。本試驗(yàn)以濟(jì)寧青山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，應(yīng)用PCR-RFLP方法對(duì)濟(jì)寧青山羊FecB基因進(jìn)行檢測(cè)，并與產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，從而探究青山羊多胎性機(jī)理，為降低濟(jì)寧青山羊育種成本、加快品種選育進(jìn)度提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 本試驗(yàn)所用濟(jì)寧青山羊全部來(lái)自山東省濟(jì)寧青山羊原種場(chǎng)，通過(guò)查閱系譜檔案材料，選取連續(xù)三胎均產(chǎn)三羔或三羔以上的濟(jì)寧青山羊14只，連續(xù)三胎均產(chǎn)單羔的濟(jì)寧青山羊12只。選取的26只濟(jì)寧青山羊年齡、體重基本一致。

1.1.2 主要試劑 Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］；AvaⅡ限制性內(nèi)切酶、10×NEBuffer［NEB（北京）有限公司］；瓊脂糖干粉電泳緩沖液（1×TAE）、電泳上樣緩沖液（10×Loading Buffer）、核酸染料、2×Phanta Max Master Mix（南京諾唯贊醫(yī)療科技有限公司）。

1.1.3 主要器材 金屬?。暇┪滞貎x器設(shè)備有限公司）；高速離心機(jī)（Eppendorf生命科學(xué)公司）；勻漿機(jī)（德國(guó)IKA公司）；超微量分光光度計(jì)（上海美谷分子儀器有限公司）；PCR儀器（北京友華照欽醫(yī)療器械有限公司）；超低溫冰箱（海爾集團(tuán)有限公司）；DYY-8C型電泳儀（北京市六一儀器廠）；凝膠成像系統(tǒng)（北京科創(chuàng)銳新生物科技有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采集 對(duì)26只濟(jì)寧青山羊進(jìn)行同期發(fā)情處理，撤栓后次日進(jìn)行統(tǒng)一屠宰并收集完整子宮，在子宮相同位置取花生仁大小組織塊，迅速放入液氮中，于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品DNA提取 基因組DNA提取和測(cè)定等均參照Sambrook等［13］的方法，將提取的DNA于-20℃冰箱保存。

1.2.3 DNA純度與濃度檢測(cè) 利用DNA濃度純度測(cè)定儀測(cè)量濃度和純度，檢測(cè)其是否符合標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 PCR擴(kuò)增 參照李星星等［14］的研究設(shè)計(jì)引物（F：5′-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG-3′，P：5′-CAAGATGTTTTCATGCCTATCAACACGGTC-3′），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物大小為140 bp。

PCR反應(yīng)體系（20μL）：DNA 2.0μL，上下游引物（10μmol／L）各0.8μL，2 ×Phanta Max Master Mix 10.0μL，ddH2O 6.4μL。PCR反應(yīng)程序：95℃30 s；95℃15 s，50℃15 s，72℃30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃5 min，-20℃保存。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物采用3%瓊脂糖凝膠電泳（220 V，100 mA，20 min）進(jìn)行檢測(cè)，并于凝膠成像儀中拍照保存。

1.2.5 酶切試驗(yàn) 用限制性內(nèi)切酶AvaⅡ?qū)ι鲜鯬CR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切體系（50μL）：PCR擴(kuò)增產(chǎn)物1μL，10×NEBuffer 5μL，AvaⅡ酶1μL，ddH2O 43μL。將配制好的樣品于37℃水浴鍋中酶解30 min。采用3%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并拍照保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品DNA純度檢測(cè)

純的DNA樣品中OD260／OD230值應(yīng)在2.0～2.5之間，OD230是某些有機(jī)試劑和多糖的吸收峰，若比值小于2.0，說(shuō)明溶液中有多糖或有機(jī)試劑污染。OD260／OD280值在1.8～2.0范圍內(nèi)說(shuō)明核酸純度較高；如果大于2.0，則表明產(chǎn)物中有RNA污染；若低于1.8，則表明產(chǎn)物中有蛋白質(zhì)、酚等污染。上述樣品中除了H3和L6不符合需求之外（表1），其他樣品均可用于下一步試驗(yàn)。

表1 樣品DNA濃度和純度

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

如圖1所示，擴(kuò)增條帶大小約140 bp，與預(yù)期擴(kuò)增片段大小一致，條帶均勻、清晰明亮且無(wú)其他雜帶，說(shuō)明擴(kuò)增片段特異性良好，可用來(lái)進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.3 PCR-RFLP電泳結(jié)果

根據(jù)李東紅等［15］的研究，當(dāng)BMPR-IB基因的746 bp處發(fā)生A→G突變時(shí)，便會(huì)形成FecB基因并產(chǎn)生AvaⅡ酶的酶切位點(diǎn)，因此對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切后，會(huì)產(chǎn)生大小為110 bp和30 bp的片段；若沒有發(fā)生突變，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切后，只有140 bp一條帶。由于不同個(gè)體間存在不同的基因型，所以對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行限制性酶切后，理論上凝膠電泳會(huì)出現(xiàn)三種情況：第一種是存在突變位點(diǎn)，凝膠電泳結(jié)果出現(xiàn)兩條帶，其大小分別為110 bp和30 bp，則稱該基因型為純合突變型（BB）；第二種是只存在一個(gè)突變位點(diǎn)，凝膠電泳結(jié)果出現(xiàn)30、110 bp和140 bp三條帶，即一條鏈被限制性內(nèi)切酶切開，另一條沒有突變位點(diǎn)，該基因型為雜合型（B＋）；第三種是酶切后只有一條帶（140 bp），即不存在突變，故沒有限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，此基因型被稱為野生型（＋＋）。本試驗(yàn)并未在濟(jì)寧青山羊中檢測(cè)到A746G的突變，用AvaⅡ限制性內(nèi)切酶對(duì)PCR產(chǎn)物酶切后，所有樣品都表現(xiàn)為整齊的一條帶（圖2）。

3 討論與結(jié)論

FecB基因是發(fā)現(xiàn)較早的一個(gè)與繁殖力相關(guān)的基因。Fogarty［16］對(duì)布魯拉美利奴羊FecB基因純合子（BB）、雜合子（B＋）和非攜帶者（＋＋）基因型進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)攜帶一個(gè)FecB基因（B＋）的母羊排卵率為1.3（0.8～2.0），產(chǎn)仔數(shù)為0.7（0.4～1.3），該基因?qū)ε怕崖实挠绊懸话闶羌有缘?，純合基因型（BB）的母羊產(chǎn)仔數(shù)會(huì)進(jìn)一步增加。劉永斌等［17］研究發(fā)現(xiàn)，繁殖力較高的中國(guó)美利奴羊與布魯拉美利奴羊均產(chǎn)生了FecB基因突變，而繁殖力低的呼倫貝爾羊、內(nèi)蒙古細(xì)毛羊和蒙古羊并沒有發(fā)現(xiàn)此突變。韓穎潔等［18］對(duì)600只小尾寒羊進(jìn)行PCR-RFLP分析，發(fā)現(xiàn)存在FecB基因突變位點(diǎn)，并出現(xiàn)三種情況：一條片段（＋＋），兩條片段（BB）和三條片段（B＋），對(duì)其中100只羊的產(chǎn)羔數(shù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)BB基因型的平均產(chǎn)羔數(shù)最多，其次是B＋型，＋＋型的產(chǎn)羔數(shù)最少，由此說(shuō)明FecB基因是提高小尾寒羊繁殖力的有利基因。候廣田等［19］以小尾寒羊和其與多浪羊、德國(guó)美利奴羊、薩?？搜虻碾s交F1代為研究對(duì)象，分析不同綿羊群體中FecB基因的多態(tài)性，發(fā)現(xiàn)小尾寒羊與德國(guó)美利奴羊和薩?？搜虻碾s交后代都存在雜合基因型（B＋），表明這兩個(gè)雜交群體已成功引入多胎基因FecB，因此以小尾寒羊作為親代，對(duì)于改善子代的繁殖性能有積極作用。

本試驗(yàn)酶切結(jié)果顯示只有一條140 bp大小的片段，原因可能為：第一，濟(jì)寧青山羊不存在A746G突變，所以限制性內(nèi)切酶不能將其切開；第二，由于時(shí)間、條件有限，樣品數(shù)目太少，可能這批樣品正好沒有多態(tài)性，即都是野生型（＋＋）；第三，進(jìn)行酶切時(shí)需要嚴(yán)格的試驗(yàn)條件，可能是酶切體系、加熱時(shí)間或溫度等設(shè)置不當(dāng)，導(dǎo)致酶切失敗。因此，濟(jì)寧青山羊多胎高產(chǎn)的性能是否與FecB基因有關(guān)仍然有待研究。朱蘭等［20］以云南黑山羊和龍陵黃山羊?yàn)檠芯繉?duì)象，并運(yùn)用PCRSSCP與測(cè)序相結(jié)合的技術(shù)對(duì)FecB基因進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果在這兩種羊中也沒有發(fā)現(xiàn)FecB基因。

FecB基因雖然能有效提高產(chǎn)仔數(shù)、增強(qiáng)繁殖力，但胚胎成活率和斷奶重卻有所下降。曹陽(yáng)等［21］發(fā)現(xiàn)有FecB基因突變的母羊胚胎死亡率增加15%左右，且生產(chǎn)性能較差。由此可見，F(xiàn)ecB基因的存在并不是只有益處。這就要求我們?cè)谂嘤嗵テ贩N、追求高繁殖力的同時(shí)，也要注意出生重、胚胎成活率、斷奶后的生長(zhǎng)狀況等一些質(zhì)的保證，嚴(yán)格制定科學(xué)合理的育種計(jì)劃，保證質(zhì)和量的雙豐收。

濟(jì)寧青山羊作為皮肉兼用的代表性品種，具有較大的市場(chǎng)價(jià)值，因此對(duì)其繁殖力機(jī)制，特別是控制多胎性狀主效基因的研究和利用十分重要。利用篩選出的基因?qū)?jì)寧青山羊進(jìn)行輔助育種，不僅能大大提高選育速度、節(jié)約時(shí)間，而且還能減少生產(chǎn)成本、提高經(jīng)濟(jì)效益。雖然濟(jì)寧青山羊是皮肉兼用，但其產(chǎn)肉率比較低，可以通過(guò)雜交提高產(chǎn)肉率，但雜交后產(chǎn)羔率又會(huì)下降，故希望能有效利用基因檢測(cè)技術(shù)，將肉用和高產(chǎn)結(jié)合起來(lái)，既能解決產(chǎn)肉率又能解決產(chǎn)羔率問(wèn)題，從而使養(yǎng)殖業(yè)實(shí)現(xiàn)成本最小化、效益最大化。PCR-RFLP技術(shù)在動(dòng)物育種方面被廣泛利用，能有效、簡(jiǎn)便地檢測(cè)基因多態(tài)性，然而該技術(shù)也存在一些不足之處，如檢測(cè)的多態(tài)性水平過(guò)分依賴于限制性內(nèi)切酶的種類和數(shù)目，酶切條件十分嚴(yán)格等。相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和進(jìn)步，各研究方法和技術(shù)都將不斷提高和完善。