李鵬，譚曉宇，雷志斌，陳耀，王春政，何錫然，鄺偉鍵，郭家钘，陳素平， 歐陽青，何洹，陳建雄，林炎志，霍楓〔. 廣東順德工業(yè)設(shè)計(jì)研究院（廣東順德創(chuàng)新設(shè)計(jì)研究院〕，廣東 佛山 583；.中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院肝膽外科與肝移植中心，廣東 廣州 5000）

目前供體器官缺乏，成為醫(yī)療界亟待解決的問題［1-2］。1955 年Hume 首次報(bào)道了使用心死亡器官捐獻(xiàn)（donation after circulatory death， DCD）進(jìn)行移植手術(shù)［3］，其后DCD 器官使用數(shù)量逐年增多，但由于DCD 供體在移植前經(jīng)歷了長時(shí)間的熱缺血，致使移植后缺血/再灌注損傷更為嚴(yán)重，導(dǎo)致原發(fā)性無功能（primary non-function，PNF）和移植物丟棄等嚴(yán)重術(shù)后并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)升高［4-5］。根據(jù)英國DCD 指南，功能性熱缺血時(shí)間（warm ischemia time， WIT）超過20 min，肝功能將受到明顯影響，不建議使用WIT 超過30 min 的供肝［6］。

體外膜肺氧合 （extracorporeal membrane oxygenation， ECMO）代替了呼吸和心臟的功能，可以償還DCD器官功能性熱缺血階段導(dǎo)致的“氧債”，減輕器官熱缺血損傷，越來越多地運(yùn)用于器官捐獻(xiàn)領(lǐng)域［7］，但ECMO 作為機(jī)械性的體外循環(huán)裝置，血液中炎性因子釋放、肝素等抗凝藥物以及其他多因素均會(huì)制約ECMO 運(yùn)行時(shí)間［8］，Thomas 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，在體常溫局部灌注對(duì)腎臟供體最佳的灌注時(shí)間為 4 h，臨床專家也建議：采用V-A 模式，對(duì)DCD供體腹腔器官原位氧合血灌注2 ～4 h，可對(duì)損傷的器官進(jìn)行一定的“修復(fù)”作用［7］。但WIT 超過30 min 的邊緣供肝是否可以通過原位氧合灌注對(duì)其進(jìn)行修復(fù)，目前無相關(guān)研究報(bào)道。

因此，本研究利用自主研發(fā)的在體機(jī)械灌注設(shè)備（in situ machine perfusion device，IMPD）對(duì) 豬DCD 30 min 肝臟進(jìn)行在體常溫局部灌注4 h，來探索在體常溫局部灌注對(duì)豬DCD 30 min 肝臟的修復(fù)作用。

1 資料與方法

1.1 設(shè)備：課題團(tuán)隊(duì)針對(duì)供體器官維護(hù)、修復(fù)和獲取的具體需求，利用ECMO 原理研發(fā)出了國內(nèi)首創(chuàng)專用于器官捐獻(xiàn)領(lǐng)域的灌注設(shè)備，命名為便攜式IMPD（圖1）。

圖1 在體機(jī)械灌注設(shè)備（IMPD）

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與耗材

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：檢疫合格的巴馬小型豬3 只， 雌性，月齡4 個(gè)月，體重40 ～45 kg。術(shù)前12 h 禁食，4 h 禁水。

1.2.2 耗材：氧合器（科威，中國）、離心泵泵頭 （索林，意大利）、管路（科威，中國）。

1.2.3 管路預(yù)沖液配方：羥乙基淀粉400 ml +生理鹽水400 ml +肝素0.1 ml +甘露醇200 ml，共配 置1 L。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)中擴(kuò)容用液：① 膠體液組：羥乙基淀粉500 ml；② 晶體液組：生理鹽水500 ml。

1.3 手術(shù)通路：肌肉注射2 ml 阿托品，15 min后肌肉注射2 ml 舒泰和阿托品混合液誘導(dǎo)麻醉， 建立耳緣靜脈通路和氣管插管，連接呼吸機(jī)， 呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)置SIMV 模式：潮氣量=體重×7， 頻率為20，呼氣終末正壓為5 cmH2O（1 cmH2O ＝ 0.098 kPa），靜脈連接微量注射泵，連續(xù)泵入丙泊酚維持麻醉〔丙泊酚∶生理鹽水＝1 ∶1，流速為1 ml /（kg·h）〕，對(duì)動(dòng)物呼吸頻率、心率、血氧 飽和度、心電圖、體溫和有創(chuàng)動(dòng)脈壓進(jìn)行監(jiān)測(cè)。 備皮，右側(cè)頸靜脈經(jīng)皮放入6 F 血管鞘（美敦力，美國），建立擴(kuò)容通路；右側(cè)股動(dòng)脈經(jīng)皮放入11 F血管鞘（cordis，美國），連接壓力傳感器，監(jiān)測(cè)動(dòng)脈壓；分離左側(cè)頸外靜脈，使用超聲定位，將 23 F 靜脈插管（科威，中國）放入到右心耳處，建立引流通路；分離左側(cè)髂動(dòng)脈，放入18 F 動(dòng)脈插管（科威，中國），建立灌注通路；沿最后肋弓切開，行膽囊管插管，收集膽汁，縫合切口；注射肝素 1 ml（6 250 U），將動(dòng)、靜脈插管接入體外循環(huán)管路，連接微量注射泵，配制肝素生理鹽水（1 ml 肝素加入60 ml 生理鹽水），注射流速為20 ml/h，激活全血凝固時(shí)間（activated clotting time，ACT）維持在180 ～ 220 s，等IMPD 設(shè)備運(yùn)行后再啟動(dòng)。

1.4 心停跳：耳緣靜脈注射2 meq/kg 的氯化鉀，誘發(fā)心臟停搏，維持5 min 后，確定心死亡，開始計(jì)算死亡時(shí)間，維持30 min，同時(shí)停止呼吸機(jī)。

1.5 局部灌注：20 mm 阻斷球囊（科威，中國）通過右股動(dòng)脈插管進(jìn)入，由0.035 inch × 260 cm 導(dǎo)引導(dǎo)絲（cordis，美國）引導(dǎo)置入胸主動(dòng)脈，超聲定位，使用球囊壓力擴(kuò)張泵擴(kuò)張球囊，阻斷胸主動(dòng)脈，DCD 30 min 后，局部灌注4 h，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)速，維持靜脈血氧飽和度（oxygen saturation of mixed venose blood，SVO2）為60%～70%。

1.6 取樣：在灌注前和灌注后0、1、2、3、4 h 的時(shí)候取血樣，檢測(cè)血?dú)?、生化、ACT。在灌注前和灌注后4 h 取肝臟組織，浸泡于10%甲醛溶液中，送廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心進(jìn)行HE 染色并出具第三方病理檢驗(yàn)報(bào)告，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)［10］。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析：運(yùn)用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用單因素方差分析方法進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)間分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P ＜0.01 為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 設(shè)備監(jiān)測(cè)指標(biāo)（表1）：IMPD 在局部灌注過程中，各時(shí)間點(diǎn)、流量和轉(zhuǎn)速穩(wěn)定，引流壓大于 -50 mmHg，灌 注 壓 小 于150 mmHg，SVO2維 持在60%～70%，各項(xiàng)設(shè)備指標(biāo)均在臨床推薦范圍 之內(nèi)［11］。

2.2 血?dú)庵笜?biāo)（表2）：0 h pH 值顯著低于基礎(chǔ)值和其他時(shí)間點(diǎn)（P ＜0.05），除0 h 以外，各時(shí)間點(diǎn)pH 值與基礎(chǔ)值相比差異不顯著（P ＞0.05）， 各時(shí)間點(diǎn)間差異不顯著（P ＞0.05）。二氧化碳分壓（partial pressure of carbon dioxide，pCO2）各時(shí)間點(diǎn)數(shù)值比0 h 低，與2 h 和4 h 相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＜0.05）。乳酸（lactic acid，Lac）各時(shí)間點(diǎn)濃度都顯著高于基礎(chǔ)值（P ＜0.05），0 h 和1 h的乳酸濃度顯著高于2、3 h 及4 h（P ＜0.05）。

表2 血?dú)庵笜?biāo)（±s）

表2 血?dú)庵笜?biāo)（±s）

注：a 為與基礎(chǔ)值相比，P ＜0.05；b 為與0 h 相比，P ＜0.05；c 為與1 h 相比，P ＜0.05

時(shí)間 pH pCO2（mmHg） Lac（mmol/L）基礎(chǔ)值 7.41 ±0.11b 39±3 1.08±0.08 0 h 7.08±0.10 50 ±17 10.62±1.27a 1 h 7.34 ±0.06b 35±2 10.52±1.19a 2 h 7.40 ±0.17b 35±11b 7.37±2.30abc 3 h 7.40 ±0.76b 37±3 7.45±1.10abc 4 h 7.28 ±0.05b 34±1b 7.81±1.67abc

2.3 生化指標(biāo)（表3）：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）濃度在第3 小時(shí)和第4 小時(shí)顯著高于基礎(chǔ)值和第0 小時(shí)（P ＜0.05），但都在正常生理值范圍。各時(shí)間點(diǎn)Na+、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、總膽紅素（total bilirubin，TBil）及谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（glutamyl transpeptidase，GGT）濃度穩(wěn)定，與生理值比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05）。在灌注階段，膽汁生成量均高于10 ml/h，其中第2 小時(shí)的生成量顯著高于其余時(shí)間點(diǎn)（P ＜0.05）。

表1 設(shè)備監(jiān)測(cè)指標(biāo)（±s）

表1 設(shè)備監(jiān)測(cè)指標(biāo)（±s）

時(shí)間 管路流量（L/min） 血泵轉(zhuǎn)速（kr/min） 引流壓（mmHg） 灌注壓（mmHg） SVO2（%）0 h 2.08±0.25 1.98±0.38 -24±19 123±25 59±5 1 h 1.62±1.41 2.00±0.26 -39±23 115±19 63±2 2 h 2.45±0.20 2.21±0.41 -49±21 144±34 60±1 3 h 2.06±0.31 2.07±0.23 -42±28 134±31 63±2 4 h 2.05±0.28 2.00±0.28 -31±8 120±20 63±3

2.4 肝臟病理分析：圖2 顯示DCD 30 min 后，肝臟變?yōu)榘岛谏?，?jīng)過IMPD 灌注4 h 后，肝臟的顏色變?yōu)轷r紅色。圖3 顯示DCD 30 min 肝臟灌注前肝臟瘀血和肝細(xì)胞空泡化嚴(yán)重，灌注后4 h，肝臟瘀血、壞死和肝細(xì)胞空泡化為無或者較少，灌注前和灌注后病理評(píng)分平均值分別為：（11.7±0.6）分和（4.7±2.5）分，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.01）。

圖2 DCD 30 min 肝臟灌注前和灌注4 h 后大體觀察

圖3 DCD 30 min 肝臟灌注前和灌注后4 h HE 切片

3 討 論

近年來，人類對(duì)供體器官的需求量與日俱增與捐獻(xiàn)者供體器官的數(shù)量相對(duì)不足之間的矛盾日益突出，擴(kuò)大標(biāo)準(zhǔn)供體成為解決這一問題的關(guān)鍵方法。臨床上，WIT 超過30 min 肝臟將被遺棄［12］，本研究通過利用自主研發(fā)的IMPD，探索在體常溫局部灌注對(duì)豬DCD 30 min 肝臟的修復(fù)作用，為臨床使用提供理論依據(jù)。

結(jié)果顯示，在灌注期間，IMPD 運(yùn)行穩(wěn)定，靜脈引流壓全程高于-50 mmHg，灌注壓全程低于150 mmHg，SVO2全程維持在60%～70%，符合臨床推薦標(biāo)準(zhǔn)［11］，以上結(jié)果表明，自主研發(fā)的IMPD 可對(duì)供體進(jìn)行穩(wěn)定的局部灌注。

由于DCD 供體獲取前經(jīng)歷了低流量灌注、 缺血和缺氧的損傷，直接導(dǎo)致細(xì)胞供氧不足， 線粒體呼吸鏈功能發(fā)生改變，無氧酵解增多導(dǎo)致乳酸、酮體沉積，引起代謝性酸中毒［13-14］、細(xì)胞腫脹和壞死［15］，ECMO 可通過恢復(fù)組織器官的血流灌注與供氧、糾正酸中毒，減輕臟器的熱缺血損傷［8］。本研究結(jié)果顯示，在DCD 30 min 后，灌注0 h 時(shí)，與基礎(chǔ)值相比，pCO2與乳酸濃度顯著升高（P ＜0.05），pH 值顯著下降（P ＜0.05），出現(xiàn) 酸中毒癥狀。在IMPD 作用下，在灌注第1 小時(shí)， pH 和pCO2恢復(fù)到正常生理值，乳酸在第2 小時(shí)之后濃度顯著低于第0 小時(shí)和第1 小時(shí)（P ＜0.05），表明機(jī)體內(nèi)環(huán)境得到改善。肝臟顏色由DCD30 min 后的暗黑色變?yōu)楣嘧? h 后的鮮紅色。對(duì)組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，DCD 30 min 肝臟灌注前，肝臟淤血和肝細(xì)胞空泡化嚴(yán)重，肝臟灌注4 h 后，肝臟瘀血、壞死和肝細(xì)胞空泡化變?yōu)闊o或者較少，灌注前、后病理評(píng)分平均值分別為（11.7±0.6）分和（4.7±2.5）分，統(tǒng)計(jì)學(xué)差異極顯著（P ＜0.01），這表明，IMPD 在對(duì)DCD 30 min 在體常溫局部灌注的4 h 內(nèi)，肝細(xì)胞空泡化與肝竇內(nèi)淤血得到明顯 改善。

表3 生化指標(biāo)（±s）

表3 生化指標(biāo)（±s）

注：a 為與基礎(chǔ)值相比，P ＜0.05；b 為與0 h 相比，P ＜0.05；c 為與2 h 相比，P ＜0.05；ALT 為丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶；AST 為天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶；Bile 為膽汁生成量；GGT 為谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶；TBil 為總膽紅素

時(shí)間 Na+（mmol/L） ALT（U/L） AST（U/L） Bile（ml） GGT（U/L） TBil（μmol/L）基礎(chǔ)值 144±5 69±25 41±20 —— 24±5 5.18±1.96 0 h 131±3 45±23 40±19 —— 16±13 3.47±0.37 1 h 139±2 58±27 60±17 14c±4 24±9 3.67±1.26 2 h 140±6 63±24 65±14 24±7 28±5 4.33±2.81 3 h 144±2 63±24 79ab±16 16c±3 26±9 4.99±1.91 4 h 147±3 50±18 87ab±15 13c±2 22±3 3.34±1.00

在供體維護(hù)時(shí)，供體肝功能與血清鈉離子水平是影響供肝移植效果的重要因素［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，全程膽汁持續(xù)產(chǎn)生，每小時(shí)膽汁的生成量都高于10 ml，第2 小時(shí)為（24±7）ml，顯著高于其他時(shí)間段（P ＜0.05）。肝功能指標(biāo)中，ALT、TBil及GGT 穩(wěn)定，各時(shí)間點(diǎn)與生理值比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05），AST 在灌注過程中呈上升趨勢(shì)，第3 小時(shí)和第4 小時(shí)顯著高于基礎(chǔ)值與第0 小時(shí)（P ＜0.05），但均低于90 U/L，不屬于邊緣供肝范疇［17］。Na+先下降，后上升，各時(shí)間點(diǎn)與生理值比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P ＞0.05），未出現(xiàn)高鈉血癥，這表明，IMPD 在對(duì)DCD 30 min 在體常溫局部灌注的4 h 內(nèi)，肝臟指標(biāo)穩(wěn)定，無高鈉血癥，符合規(guī)范對(duì)供肝維護(hù)的要求。

綜上所述，本研究證明在體常溫局部灌注對(duì)豬DCD 30 min 肝臟具有修復(fù)作用。