李藝垚，馬少丹，苑述剛

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種病因復(fù)雜的直腸和結(jié)腸慢性非特異性炎癥性疾病，屬中醫(yī)“泄瀉”“痢疾”“腹痛”等范疇，發(fā)病率逐年上升。 因其發(fā)病機(jī)制尚未明確，該病近年來一直是研究熱點(diǎn)，最安全有效的方法就是通過建立動(dòng)物模型進(jìn)行相關(guān)研究。 目前制備UC 模型的方法主要有：化學(xué)刺激法、免疫刺激法、復(fù)合法等，常見的UC 中醫(yī)證型模型有：① 肝郁脾虛型［1-2］；② 脾虛（濕蘊(yùn)）型［3］；③ 大腸濕熱型［4］；④ 脾腎陽虛型［5］。

中醫(yī)學(xué)根據(jù)其證型采用相應(yīng)的主方加減治療UC 能取得較好療效［6-7］，本實(shí)驗(yàn)為研究久瀉寧顆粒的治療機(jī)制的前期實(shí)驗(yàn)。 久瀉寧顆粒是原福建中醫(yī)學(xué)院院長俞長榮教授治療慢性泄瀉的經(jīng)驗(yàn)方，臨床治療肝郁脾虛濕盛證之UC 療效確切。 而現(xiàn)有的UC 大鼠模型與本課題實(shí)驗(yàn)所需大鼠模型均不相符合，故本實(shí)驗(yàn)擬采用DSS 溶液灌胃結(jié)合飲食、環(huán)境、情緒等因素干預(yù)，與單純采用DSS 溶液灌胃的造模方法進(jìn)行比較，試建立一種穩(wěn)定的肝郁脾虛濕盛證之UC 大鼠模型。

1 材 料

1.1 動(dòng)物與分組 SPF 級(jí)SD 大鼠18 只，雌雄各半，體質(zhì)量（170±20） g，由浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號(hào)：SCXK（浙）2014-0001）。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在福建中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)和管理（環(huán)境設(shè)施合格證書：SYXZ（閩）2014-0005）。 隨機(jī)分為正常對(duì)照組、葡聚糖硫酸鈉組（DSS 組）、模型組，每組 6 只。

1.2 試劑 DSS（大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：S0808A）；豬油（天津聚龍糧油有限公司，批號(hào)：20180912C）；0.9%氯化鈉注射液（江西科倫藥業(yè)有限公司，批號(hào)：B18120702）。

1.3 儀器 生物組織自動(dòng)脫水機(jī)（亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司，型號(hào)：ZT-14S1）；生物組織石蠟包埋機(jī)（湖北錦源醫(yī)用電子技術(shù)有限公司，型號(hào)：YJ-BMC）；石蠟切片機(jī)（德國 Leica 公司，型號(hào)：RM2235）；攤烤片機(jī)（孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司，型號(hào)：YT-7FB）；研究級(jí)生物顯微鏡（德國Leica 公司，型號(hào)：DM4000B）。

2 方 法

2.1 造模方法 參照相關(guān)文獻(xiàn)［8-10］并加以改進(jìn)：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周， 正常對(duì)照組予正常飼養(yǎng)，每日予生理鹽水灌胃2 次，每次2 mL，連續(xù)7 d。 DSS組每日灌胃 10% DSS 溶液 20 mL/kg，2 次 /d，連續(xù)7 d。 模型組采用DSS 組造模方法外，單日禁食，并予4 ℃冰水灌胃，每日1 次，每次2 mL；雙日正常飲食，并予灌胃豬油1 次，每次2 mL；每日用紗布包裹長尾夾夾住大鼠尾部，使其暴怒，每次30 min；強(qiáng)迫大鼠站立在2 cm 深的水中每日至少8 h。 連續(xù)7 d。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 一般情況 造模期間觀察3 組大鼠一般情況，包括體質(zhì)量、精神狀態(tài)、動(dòng)作行為、毛發(fā)光澤度、糞便性狀等，并按 UC 活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［11］進(jìn)行評(píng)分，見表1。

表1 DAI 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.2.2 病理學(xué)改變 造模第8 天，各組大鼠禁食不禁飲 24 h，腹腔注射 20%烏拉坦（5 mL/kg）麻醉。打開腹腔，從肛門向上截取大鼠結(jié)腸組織，沿大鼠腸系膜緣縱向剪開，用生理鹽水沖洗干凈，平鋪于濾紙上，肉眼觀察結(jié)腸組織形態(tài)學(xué)改變，根據(jù)結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)［12］進(jìn)行評(píng)分，見表2。 選取約1 cm×1 cm 病變最明顯處結(jié)腸組織，置于4%多聚甲醛固定后編號(hào)，酒精梯度脫水，二甲苯透化，常規(guī)石蠟包埋，切片厚度4 μm，蘇木精-伊紅染色（HE 染色），中性樹膠封片后，光鏡下觀察結(jié)腸病理變化。

表2 CMDI 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.3 模型評(píng)定

2.3.1 肝郁脾虛濕盛證模型評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)文獻(xiàn)［13-16］，主癥：① 倦怠疲乏，懶動(dòng)扎堆；② 精神萎靡，毛色光澤度下降、晦暗枯槁、稀疏易脫落；③ 便軟或溏，肛周污穢，排便時(shí)肛門紅腫，甚至脫肛；④ 行動(dòng)緩慢，甚至斜行。 兼癥：① 體質(zhì)量不增或增長緩慢，甚至降低；② 飲食量減少；③ 胃腸明顯脹氣。 出現(xiàn) 3 項(xiàng)主癥，或 2 項(xiàng)主癥加 2 項(xiàng)兼癥，即可認(rèn)定肝郁脾虛濕盛證模型復(fù)制成功。

2.3.2 UC 模型評(píng)定標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)文獻(xiàn)［17-18］：①DAI 評(píng)分初步了解動(dòng)物病癥發(fā)展的嚴(yán)重程度；②肉眼觀察結(jié)腸組織可見結(jié)腸充血水腫、腸壁增厚，嚴(yán)重者尚可見散落的潰瘍點(diǎn)； ③ 病理學(xué)觀察一般表現(xiàn)為大量淋巴、單核及中性白細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，腺體呈現(xiàn)杯狀細(xì)胞減少或消失，有隱窩膿腫和潰瘍形成。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 運(yùn)用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行結(jié)果分析，計(jì)量資料屬正態(tài)分布的以表示，采用單因素方差分析。

3 結(jié) 果

3.1 3 組大鼠一般情況比較 正常對(duì)照組大鼠精神狀態(tài)良好，反應(yīng)靈活，飲食量正常，皮毛光澤順滑，糞便呈橢圓狀。 模型組造模第3 天出現(xiàn)飲食量減少，蜷縮扎堆，大便溏，肛門稍有污穢；第7 天出現(xiàn)精神萎靡，蜷臥懶動(dòng)，嗜睡，抓取時(shí)暴躁易怒，體質(zhì)量明顯下降，大便偏稀帶血，肛周污穢，與正常對(duì)照組比較，體質(zhì)量顯著下降（P＜0.01），DAI 評(píng)分顯著升高（P＜0.01）。 DSS 組造模第 7 天出現(xiàn)懶動(dòng)，蜷縮扎堆，飲食量減少，便稀，肛門污穢，與正常對(duì)照組比較，體質(zhì)量下降，但不明顯（P＞0.05），DAI 評(píng)分顯著升高（P＜0.01）。 見表3、表4。

表3 3 組大鼠造模后體質(zhì)量比較g

表3 3 組大鼠造模后體質(zhì)量比較g

注：與正常對(duì)照組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01；與 DSS 組比較，3） P＜0.01。

組別正常對(duì)照組DSS 組模 型 組n666 1 d 162.00±5.69 164.17±4.88 163.67±4.64 3 d 171.00±12.96 169.50±12.04 168.50±5.35 5 d 195.17±10.52 191.83±10.05 165.83±5.171）7 d 221.27±14.45 214.53±12.72 153.84±5.802）3）

表4 3 組大鼠造模后 DAI 評(píng)分 分

表4 3 組大鼠造模后 DAI 評(píng)分 分

注：與正常對(duì)照組比較，1） P＜0.01；與 DSS 組比較，2） P＜0.01。

組別正常對(duì)照組DSS 組模 型 組n666 1 d 000 3 d 0 0.15±0.07 0.62±0.101）2）5 d 0 0.47±0.061）1.38±0.151）2）7 d 0 0.55±0.101）1.72±0.081）2）

3.2 3 組大鼠結(jié)腸黏膜改變及病理觀察比較 正常對(duì)照組結(jié)腸紋理清晰結(jié)構(gòu)完整，無損傷，腺體排列整齊，間質(zhì)未見水腫、充血、潰瘍。 模型組結(jié)腸黏膜明顯充血、水腫，肉眼可見潰瘍點(diǎn)，與正常對(duì)照組比較，CMDI 評(píng)分顯著升高（P＜0.01），黏膜層潰爛嚴(yán)重，腺體結(jié)構(gòu)完全破壞，杯狀細(xì)胞消失，大量炎癥細(xì)胞浸潤，間質(zhì)水腫、充血明顯且有炎癥細(xì)胞浸潤。DSS 組結(jié)腸黏膜表面可見充血、水腫，偶可見針尖樣潰瘍，與正常對(duì)照組比較，CMDI 評(píng)分顯著升高（P＜0.01），腺體排列紊亂，結(jié)構(gòu)破壞，杯狀細(xì)胞消失，間質(zhì)充血、水腫，大量炎癥細(xì)胞浸潤。 見表5、圖1。

4 討 論

圖1 光學(xué)顯微鏡下3 組大鼠結(jié)腸組織HE 染色圖（×20）

表5 3 組大鼠造模后 CMDI 評(píng)分 分

表5 3 組大鼠造模后 CMDI 評(píng)分 分

注：與正常對(duì)照組比較，1） P＜0.01；與 DSS 組比較，2） P＜0.01。

組別正常對(duì)照組DSS 組模 型 組n666 CMDI 評(píng)分0 1.07±0.191）1.68±0.201）2）

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為UC 的發(fā)病與脾胃功能虛弱密切相關(guān)，因飲食不節(jié)或進(jìn)食生冷，損傷脾氣，或者情志失調(diào)，肝氣乘脾，脾胃運(yùn)化失職，食積濕勝而致泄瀉。本病以脾虛失健為主要發(fā)病基礎(chǔ)，緩解期主要以脾虛為本。 本病病機(jī)與“濕”密不可分，若濕與熱結(jié)于大腸，大腸傳化失司而致泄瀉，急則暴下如注，緩則時(shí)止時(shí)瀉。DSS 法是制備UC 的常用方法之一，其致炎機(jī)制可能與細(xì)胞功能失調(diào)、腸道菌群失調(diào)有關(guān)［19］，通常采用自由飲用一定濃度的DSS 溶液制備急性UC 模型。 制備中醫(yī)證型的UC 模型常在此基礎(chǔ)上施加環(huán)境、飲食、情緒等因素干擾，使模型出現(xiàn)與中醫(yī)證候相類似的癥狀。

本實(shí)驗(yàn)擬建立肝郁脾虛濕盛型UC 模型，控制DSS 誘導(dǎo)次數(shù)，使模型產(chǎn)生急性期與緩解期交替出現(xiàn)的癥狀，更符合人類UC 發(fā)病周期規(guī)律，且有研究［20］發(fā)現(xiàn) DSS 溶液定量灌胃誘導(dǎo)的 UC 模型在潰瘍出現(xiàn)的時(shí)間、程度、位置比自由飲用相比均一性高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：?jiǎn)渭儾捎肈SS 定量灌胃，模型雖在有結(jié)腸組織病理學(xué)改變，但在飲食量、皮毛光澤度等一般情況未見明顯變化，缺乏中醫(yī)證候特點(diǎn)；采用DSS 定量灌胃結(jié)合內(nèi)外因素干預(yù)的方法，模型既表現(xiàn)出倦怠懶動(dòng)，飲食量減少，拱背，毛色光澤度降低等體征，結(jié)腸黏膜改變也符合組織病理學(xué)特點(diǎn)，故本研究選擇DSS 溶液定量灌胃結(jié)合內(nèi)外因素干預(yù)的方法誘導(dǎo)UC 模型。

DAI 評(píng)分表是較公認(rèn)地、能較準(zhǔn)確地早期診斷UC［21］，本實(shí)驗(yàn)中模型組與正常對(duì)照組比較，DAI、CMDI 評(píng)分均顯著升高，在造模后也出現(xiàn)類似肝郁脾虛濕盛的癥狀，結(jié)腸組織病理學(xué)也支持造模成功結(jié)論，以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步顯示：肝郁脾虛濕盛證之UC 大鼠模型基本成功。 本實(shí)驗(yàn)后期將對(duì)此造模法再做深入研究，試采用DSS 溶液定量灌胃重復(fù)誘導(dǎo)的方法，探究該模型的穩(wěn)定性，以建立較理想、穩(wěn)定、更符合實(shí)驗(yàn)課題的肝郁脾虛濕盛證UC 大鼠模型。