熊朝棟，陳 丹，洪麗婷，劉秀棉，余文靜，黃曉靖

（福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122）

玳玳又稱代代（Citrus AurantiμmL. var daidai Tanaka），是蕓香科柑桔亞屬植物，為酸橙的變種，藥食同源，在福建閩北地區(qū)建有基地大量栽培，四川、浙江等地也有栽培。 玳玳果含有豐富的黃酮類成分，臨床多用于胸腹?jié)M悶脹痛、食積不化、痰飲等病癥的治療［1-2］。 由玳玳果提取的有效部位玳玳果黃酮提取物［3-5］，具有良好的降血脂及抗氧化活性［6-8］，以及有多組分和多靶點(diǎn)作用的特點(diǎn)，其中主要特征效應(yīng)組分為新橙皮苷、柚皮苷等［9-13］。制備薄層色譜法（PTLC）是由普通薄層色譜［15-16］衍化而來的一種高提取率、無殘留的組分快速分離技術(shù)，簡(jiǎn)便快捷，可在適宜的展開體系中實(shí)現(xiàn)多個(gè)目標(biāo)成分的快速分離［14-15］。 高壓制備液相色譜（PHPLC）也是一種常見的分離目標(biāo)化合物的技術(shù)手段， 可從天然產(chǎn)物中分離制備化合物，得到高純度的化合物單體，既可以制備對(duì)照品，又是中藥活性成分分離和臨床研究的理想方法。 本實(shí)驗(yàn)采用制備薄層色譜結(jié)合高壓制備液相色譜，敲出分離玳玳果黃酮提取物中的主要效應(yīng)組分，并通過高效液相色譜法檢測(cè)分離的效應(yīng)組分純度，從而建立能快速、高效地從玳玳果黃酮提取物敲出制備純度大于98%新橙皮苷及柚皮苷的方法，為進(jìn)一步研究評(píng)價(jià)玳玳果黃酮提取物中調(diào)控脂質(zhì)代謝關(guān)鍵效應(yīng)組分奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695 高效液相色譜儀、Waters 2998 PDA 檢測(cè)器（美國(guó) Waters 公司）；島津 LC-8A高壓制備液相、SPD-10A 紫外檢測(cè)器（日本島津公司）；XS 205 十萬分之一電子天平、AR 2140 萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；DHG-9240 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；DZF-6050 真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 試藥 玳玳果飲片由福建恒馨天然香料有限公司提供，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室范世明高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定。 玳玳果黃酮降脂提取物（自制，總黃酮含量86.54%，批號(hào)：20190401）；柚皮苷對(duì)照品（南京廣潤(rùn)生物制品有限公司，純度≥98%，批號(hào)：GR-133-140506）；新橙皮苷對(duì)照品（南京廣潤(rùn)生物制品有限公司，純度≥98%，批號(hào)：GR-133-140403）；AB-8 樹脂（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)：20190313）；硅膠G（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：0170206）；甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；無水乙醇、三氯甲烷、碘等其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 玳玳果黃酮提取物的制備 取玳玳果飲片粗粉，6 倍量 75%乙醇回流提取 3 次，每次 2 h，合并提取液。 回收乙醇至浸膏狀，于50 ℃下減壓干燥成粉，即得玳玳果黃酮粗提物。 使用AB-8 大孔吸附樹脂濕法裝柱；配制上樣濃度為6.0～8.0 g/L 粗提物溶液，調(diào)節(jié) pH 值為 4～5，上樣流速為 2 BV/h，依次用 4 BV（柱體積）水洗脫，流速 2 BV/h；4 BV 30%乙醇洗脫，流速2 BV/h；4 BV 50%乙醇洗脫，流速 2 BV/h，收集濃度為50%乙醇溶液第 0.5～2.0 BV 洗脫液，回收溶劑，得浸膏；將浸膏置50 ℃下減壓干燥成粉，即得玳玳果黃酮提取物。

2.2 PTLC 法敲出分離新橙皮苷與柚皮苷

2.2.1 供試品溶液的制備 稱取同一批次玳玳果黃酮提取物干燥粉末約30 mg，加入10 mL 甲醇，超聲5 min 使溶解，即得濃度為 3.0 mg/mL 的玳玳果黃酮提取物供試品溶液。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取新橙皮苷、 柚皮苷對(duì)照品適量， 分別加甲醇制成濃度1.0 mg/mL 新橙皮苷對(duì)照品溶液、濃度 1.0 mg/mL 柚皮苷對(duì)照品溶液。

2.2.3 敲出分離新橙皮苷及柚皮苷 鋪制厚度約1 mm 的20 cm×20 cm 制備薄層板，供試品溶液條狀點(diǎn)樣，氯仿-甲醇-水（13∶6∶2）的下層溶液為展開劑，預(yù)飽和15～20 min，展開，取出板，揮干溶劑。碘蒸氣顯色，新橙皮苷及柚皮苷對(duì)照品示蹤。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜斑點(diǎn)相應(yīng)的位置上，出現(xiàn)效應(yīng)組分新橙皮苷和柚皮苷的棕黃色條帶。 分別刮取含效應(yīng)組分新橙皮苷與柚皮苷的硅膠條帶，采用60%乙醇分別解吸附洗脫，收集洗脫劑，減壓干燥，即得新橙皮苷粉末、柚皮苷粉末。按公式計(jì)算：

PTLC 法得率 /%＝（MPHPLC產(chǎn)物/M玳玳果黃酮提取物）×100%

柚皮苷與新橙皮苷粉末得率分別為23.15%和26.77%。 制備薄層色譜結(jié)果見圖1。

圖1 玳玳果黃酮提取物制備薄層色譜分離結(jié)果圖

2.3 PHPLC 法分離純化新橙皮苷及柚皮苷

2.3.1 供試品溶液的制備 分別精密稱取“2.2.3”項(xiàng)下制得柚皮苷及新橙皮苷粉末各適量，分別加入適量甲醇，超聲5 min 溶解樣品，制得濃度為3.0 mg/mL的供試品溶液。

2.3.2 色譜條件 色譜柱高壓制備柱Ultiamte XBC18（10 mm×250 mm，5 μm）；保護(hù)柱 XB-C18（5 μm）；流速3.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)284 nm；溫度為室溫；進(jìn)樣量 100 μL。

2.3.3 新橙皮苷及柚皮苷的純化 實(shí)驗(yàn)分別考察流動(dòng)相的甲醇-0.5%甲酸水體積比為 1∶1、2∶3、11∶19時(shí)，提取物敲出的效應(yīng)組分柚皮苷及新橙皮苷分離純化效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：當(dāng)流動(dòng)相的甲醇-0.5%甲酸水體積比為11∶19 時(shí)，新橙皮苷、柚皮苷與其他組分間的分離效果最佳，分離度＞1.5，故采用“2.3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)一步分離純化PTLC 法分離的柚皮苷及新橙皮苷粉末。 分別收集含柚皮苷及新橙皮苷的流動(dòng)相，減壓干燥，成粉，即得新橙皮苷與柚皮苷純品。 按公式計(jì)算：

PTLC 法結(jié)合 PHPLC 法得率 /%＝（MPHPLC 產(chǎn)物/M 玳玳果黃酮提取物）×100%

柚皮苷與新橙皮苷純品得率分別為21.73%和24.87%。 高壓制備液相色譜分離結(jié)果見圖2。

2.4 新橙皮苷與柚皮苷純品分析

2.4.1 供試品溶液的制備 分別精密稱取“2.2.3”項(xiàng)下和“2.3.3”項(xiàng)下所得敲出物（新橙皮苷與柚皮苷）各約 10 mg［16-17］，置 50 mL 量瓶，加甲醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取1.0 mL 于10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得PTLC新橙皮苷供試品溶液、PTLC 柚皮苷供試品溶液，PHPLC新橙皮苷供試品溶液、PHPLC 柚皮苷供試品溶液。

2.4.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取柚皮苷、新橙皮苷對(duì)照品適量［17-18］，分別置于 50 mL 量瓶，加適量甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取柚皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液和新橙皮苷對(duì)照品儲(chǔ)備液各5.0 mL 至50 mL 量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得含柚皮苷濃度為0.011 84 mg/mL 及新橙皮苷濃度為0.013 50 mg/mL 的混合對(duì)照品溶液。

2.4.3 色譜條件 色譜柱250-4 lichrocart C18（250 mm×4 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.1%磷酸水溶液（22∶78）；流速 1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng) 284 nm；柱溫為 25 ℃；進(jìn)樣量 20 μL。

2.4.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備及線性關(guān)系考察 精密吸取混合對(duì)照品溶液 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL 分別置于10 mL 量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。 按“2.4.3”項(xiàng)下分析，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標(biāo)，對(duì)照品溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：柚皮苷在 11.84～47.36 μg/mL 濃度范圍呈良好線性關(guān)系，回歸方程為Y1＝1.673×104X1－3.374×103，r＝0.999 8；新橙皮苷在 13.50～54.00 μg/mL 濃度范圍呈良好線性關(guān)系，回歸方程為Y2＝2.403×104X2－2.615×103，r＝0.999 9。

2.4.5 PTLC 結(jié)合PHPLC 敲出效應(yīng)組分純化結(jié)果分析 分別取PTLC 新橙皮苷供試品溶液、PTLC 柚皮苷供試品溶液，以及PHPLC 新橙皮苷供試品溶液、PHPLC 柚皮苷供試品溶液，按“2.4.3”項(xiàng)下色譜條件，每個(gè)樣品進(jìn)樣3 次，分析，計(jì)算平均純度。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：PTLC 法敲出分離效應(yīng)組分柚皮苷純度為69.24%，新橙皮苷單體純度為75.45%；結(jié)合PHPLC 法進(jìn)一步純化效應(yīng)組分后柚皮苷純度為98.81%，新橙皮苷純度為98.84%。 結(jié)果見表1，圖3。

表1 玳玳黃酮提取物效應(yīng)組分分離純化測(cè)定結(jié)果%

圖3 效應(yīng)組分純度測(cè)定結(jié)果高效液相色譜圖

3 討 論

PTLC 是在薄層分析色譜的基礎(chǔ)上，通過增加薄層的厚度，使其載樣量明顯高于分析型薄層，達(dá)到對(duì)多種化合物制備分離提純的目的。 常用的制備薄層色譜多為硅膠吸附色譜，其處理樣品量可達(dá)1～500 mg。 為了使分離產(chǎn)物不變性，實(shí)驗(yàn)采用碘蒸氣對(duì)效應(yīng)組分以對(duì)照品示蹤顯色。 由于碘蒸氣與效應(yīng)組分柚皮苷與新橙皮苷結(jié)合方式為物理結(jié)合，該過程可逆，碘蒸氣與效應(yīng)組分的結(jié)合物在常溫下放置時(shí)碘蒸氣自然揮發(fā)，使柚皮苷與新橙皮苷恢復(fù)原有狀態(tài)。

PHPLC 技術(shù)發(fā)展迅速，廣泛用于藥物及生物制品的純化，作為一種快速、高效的分離方法，具有良好的發(fā)展前景。 實(shí)驗(yàn)在摸索高壓制備液相色譜分離樣品的條件時(shí)，將分析型色譜柱接入高壓制備液相色譜上，確定樣品在分析型色譜柱上的分離條件，再通過線性放大，獲得樣品在高壓制備液相色譜的初步分離條件，進(jìn)一步篩選優(yōu)化高壓制備液相色譜條件。

實(shí)驗(yàn)中采用PTLC 對(duì)提取物的效應(yīng)組分先進(jìn)行敲出分離，效應(yīng)組分含量可達(dá)70%以上，再結(jié)合PHPLC 對(duì)效應(yīng)組分進(jìn)一步分離純化，可使效應(yīng)組分新橙皮苷、柚皮苷最終純度達(dá)98%以上，且最終柚皮苷得率為21.73%，新橙皮苷得率為24.87%。提示本實(shí)驗(yàn)建立的PTLC 結(jié)合PHPLC 敲出分離玳玳果黃酮提取物效應(yīng)組分方法可行，為后續(xù)課題組進(jìn)一步深入研究提取物及效應(yīng)組分調(diào)控脂質(zhì)代謝機(jī)制研究奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。