王鵬，葛曉陽，李付廣

（中國農業(yè)科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南安陽455000）

1983 年轉基因煙草首次獲得成功， 標志著植物轉基因技術的誕生。 1997 年我國開始種植轉基因抗蟲棉花，并取得良好的抗蟲效果，創(chuàng)造了巨大的經濟效益。 隨著轉基因棉花種植面積的持續(xù)擴大，國家越來越重視轉基因生物安全評價。 轉基因材料的種植和審批必須要明確其分子特征，明確轉基因植株T-DNA 的插入位點及側翼序列是對轉基因知識產權的保護， 可以作為監(jiān)管和保護的依據，為進一步研究其分子機理提供理論基礎。

基因組學技術的出現給生物學研究帶來了革命性的變化，側翼序列的測定仍然是確定基因結構的重要步驟。現階段對側翼序列的測定都是基于以下2 種方法，1 種是基于基因組文庫連續(xù)區(qū)域或大片段克隆， 另1 種是基于聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction，PCR）的近距離克隆。 根據這些方法的原理， 主要分為基于限制性內切酶的PCR、 基于隨機引物的PCR 和基于接頭的PCR[1]。使用常規(guī)的技術測定側翼序列存在一些缺點，當擴增靶區(qū)域時，有些未知/ 已知區(qū)域中限制性內切酶位點的可用性成為限制因素[2]，有些非特異性擴增產物太多[3]，都會導致側翼序列的鑒定效率與準確率下降。 由Liu 等[4]首次提出的熱不對稱交錯PCR技術（Thermal asymmetric interlaced PCR，Tail-PCR），具有簡單易行、靈敏度高、特異性好、重復性高、不涉及酶切連接等多種優(yōu)勢。 2007 年，Liu 等[5]對Tail-PCR 改進為了高效熱不對稱交錯PCR（High-efficiencythermal asymmetric interlaced PCR，hiTail-PCR），在兼并引物的5’端增加了23 bp 的已知序列， 提高了Tail-PCR 的特異性與擴增效率。Wang 等[6]提出了融合引物與巢式聚合酶鏈式反應（Fusion primer and nested integrated PCR，FPNI-PCR），與Tail-PCR 和hiTail-PCR 原理類似，但效率更高、特異性更好、更加靈敏和準確。隨著技術的改進提高， 對于已經創(chuàng)建了大型T-DNA 插入文庫的生物，如水稻和擬南芥[7]，以及轉基因棉花不斷發(fā)展的今天，1 種準確高效的方法具有重要的意義。

本研究通過FPNI-PCR 對cry2Ab4 轉基因棉花材料L280 及cry2Ab4、vip3Aa11 雙價轉基因棉花材料L282 的T-DNA 在基因組上的插入位置進行測定分析。cry2Ab4 與vip3Aa11 兩個外源殺蟲基因均來自于蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis,Bt），分別編碼殺蟲晶體蛋白和營養(yǎng)期殺蟲蛋白，轉基因植株對鱗翅目害蟲如小地老虎、棉鈴蟲等具有較好的殺蟲效果，對2 種轉基因抗蟲棉側翼序列進行測定，為后續(xù)科研試驗、專利保護以及安全評價等提供了重要的分子理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

轉cry2Ab4 基因抗蟲棉L280 與轉cry2Ab4、vip3Aa11 雙價抗蟲棉L282 由本實驗室通過農桿菌介導轉化棉花下胚軸的方法獲得，通過檢測為穩(wěn)定遺傳的T5轉基因材料。 Ex-Taq DNA 聚合酶、DNA marker、pMD18-T 載體等購自寶生物工程（大連）有限公司；PCR 產物回收試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、DH5α 感受態(tài)菌株等購自全式金生物技術（北京）有限公司，PCR 引物的合成和克隆片段的測序由生工生物工程（上海）有限公司完成。

1.2 DNA 的提取

本研究對棉花基因組DNA 的完整性要求較高，參考李忠旺等[8]的CTAB 法提取DNA，注意在提取的過程中不要劇烈晃動，將提取的DNA 于4 ℃保存待用。

1.3 FPNI-PCR 引物及驗證引物

參考Wang 等[7]在棉花基因組上設計9 個融合引物FP1-FP9、及2 個特定引物FSP1、FSP2。 根據轉化時用到的植物表達載體pCAMBIA2300 的左邊界（Left border,LB）和右邊界（Right border,RB）的序列，由Primer Premier 5.0 軟件設計， 分別設計3 對引物為：LSP1/RSP1、LSP2/RSP2、LSP3/RSP3。此外還分別設計驗證L280 與L282 轉基因植株T-DNA 完整性的引物各3 對：L280-a1/L280-b1、L280-a2/L280-b2、L280-a3/L280-b3；L282-a1/L282-b1、L282-a2/L282-b2、L282-a3/L282-b3 引物具體序列見表1。

表1 FPNI-PCR 的引物序列

表1 （續(xù)）

1.4 FPNI-PCR 擴增體系與反應條件

FPNI-PCR 擴增體系和擴增程序參考文獻[7]，具體體系與程序見表2。 第一輪PCR 以基因組DNA 為模板，分別將左邊界引物LSP1 與9 個融合引物FP、 右邊界引物RSP1 與9 個融合引物FP 配對，共18 對引物，按照第一輪PCR 程序進行擴增；第二輪PCR 分別以第一輪PCR 的18 個產 物 （1 μL） 作 為 模 板， 左 邊 界 引 物 對 使 用LSP2/FSP1，右邊界引物對使用RSP2/FSP1，按照第二輪PCR 程序進行擴增； 將第二輪PCR 的產物分別稀釋50 倍，各取1 μL 作為模板，左邊界引物對使用LSP3/FSP2， 右邊界引物對使用RSP3/FSP2， 按照第三輪PCR 程序進行擴增，共計18 個產物，三輪PCR 結束后將有條帶的送去測序，將測序結果分別與載體和棉花基因組進行比對分析。

表2 三輪PCR 反應程序

1.5 側翼序列的獲取及比對分析

將第三輪擴增產物經瓊脂糖電泳分離后，特異條帶用膠回收試劑盒回收純化， 將回收的PCR 片段連接到pGEM-T easy 載體，轉化大腸桿菌，每個轉化隨機挑5 個單克隆菌落， 使用通用引物M13進行測序驗證。 根據測序的結果，分別與載體骨架pCAMBIA2300 左右邊界序列以及Cotton FGD 的棉花基因組數據庫 （https://cottonfgd.org/） 進行比對， 通過比對結果確定T-DNA 左右邊界在基因組上的插入位置。

1.6 側翼序列的驗證與T-DNA 區(qū)域的分析

根據插入的位置， 在T-DNA 兩側的棉花基因組上設計引物（圖2A、2C），L280-F1 或L280-F2 結合載體的左邊界序列LSP3 配對擴增，L280-R1 或L280-R2 結合載體的右邊界序列RSP3 配對擴增；L282-F1 或L282-F2 結合載體的左邊界序列LSP3配對擴增，L282-R1 或L282-R2 結合載體的右邊界序列RSP3 配對擴增， 以此對T-DNA 插入位點進行驗證。 同時分別在T-DNA 區(qū)域內設計引物進行擴增驗證（圖2A、2C），將擴增的結果與預測的條帶大小比較驗證， 根據驗證的結果將T-DNA 的完整序列在棉花基因組中的插入位置標識出來。

2 結果與分析

2.1 FPNI-PCR 擴增結果

分別選取轉cry2Ab4 抗蟲棉（田間編號L280）與轉cry2Ab4、vip3Aa11 雙價抗蟲棉 （田間編號L282）的DNA 作為模板，通過FPNI-PCR 進行三輪擴增，擴增產物通過瓊脂糖凝膠電泳（圖1），L280左邊界有8 個條帶，大于500 bp 的有6 條，主要集中在500～2 000 bp；右邊界沒有條帶，可能是載體右側邊緣存在缺失等原因造成的。 L282 左邊界擴增的4 個有條帶， 右邊界擴增的2 個有條帶，6 個條帶均大于500 bp。

圖1 兩個轉基因抗蟲棉FPNI-PCR 的電泳圖

2.2 側翼序列的克隆分析及驗證

根據電泳結果，將擴增條帶切膠回收，純化后的產物測序驗證。 將測序結果分別與Cotton FGD的棉花基因組數據庫和載體骨架pCAMBIA2300左右邊界序列進行比對，結果表明，L280 的擴增條帶L1、L3、L6、L7、L8、L9 的序列均能與載體骨架pCAMBIA2300 和棉花基因組比對上，T-DNA 插入位點位于棉花基因組D13 染色體上61 309 969-61 309 997 bp 區(qū)間 （圖2A） 基因組缺失27 bp，T-DNA 左右兩端分別缺失15 bp 與28 bp。 小于500 bp 的2 個條帶與T-DNA 和棉花基因組都沒有相似序列，推測這2 個條帶可能是非特異性擴增產物。L282 擴增的6 個條帶核苷酸比對結果表明，這6 個條帶與載體骨架pCAMBIA2300 和棉花基因組都有部分相同的核苷酸序列，T-DNA 插入位點位于D11 染色體上11 069 019-11 069 039 bp 區(qū)間（圖2C），基因組缺失19 bp，T-DNA 左右兩端分別缺失21 bp 與17 bp。 根據基因組比對的結果，分別選取L280 和L282 兩個材料LB 與RB 的側翼序列各1 000 bp ，通過計算分析，側翼序列的AT 堿基含量較高。 材料L280 的LB 與RB 側翼序列AT堿基含量分別為72%、69%； 材料L282 的LB 與RB 側翼序列AT 堿基含量分別為64%、67%。 為進一步驗證T-DNA 插入的準確性， 分別在T-DNA插入位點兩側的棉花基因組DNA 上設計特異性引物與載體邊界序列進行PCR 擴增（圖2A、2C），產物測序結果表明分離得到的側翼序列是正確的。

2.3 T-DNA 完整性分析

根據在圖2A 和2C 上標識的T-DNA 特異性引物，經PCR 擴增、瓊脂糖凝膠電泳，從圖2B 和圖2D 中可以看出， 條帶大小與預測一致。 說明T-DNA 插入的各個元件都保持了較好地完整性。

圖2 兩個轉基因抗蟲棉T-DNA 插入位點及完整性示意圖

3 討論

本研究為了分析cry2Ab4 基因抗蟲棉（L280）與轉cry2Ab4＋vip3Aa11 基因雙價抗蟲棉（L282）的插入位點，探究了FPNI-PCR 在棉花中高效的側翼序列克隆方法。 研究結果表明，18 個泳道只要有1 個擴增的條帶可以與載體骨架與基因組分別比對上，就可以確定插入位點，然后通過在基因組上設計特異性的引物即可進行驗證。隨著基因編輯技術的發(fā)展，功能基因的不斷挖掘以及未來棉花突變體庫的建立，1 種高效的側翼序列測定的方法是必不可少的。 FPNI-PCR 在本實驗中能夠高效對側翼序列進行測定，因此在載體邊界序列信息清楚的情況下，使用該方法省時省力，特異性高。轉基因抗蟲棉的種植不僅能夠減少棉花生產的成本和棉農的勞動強度， 同時也對生態(tài)環(huán)境起到良好的保護作用。 轉基因的側翼序列就是該品種的標簽，明確轉基因抗蟲棉的插入位點對申請安全證書有一定幫助，對改善轉基因棉花市場的監(jiān)管也能起到積極的作用。 因此，測定兩種抗蟲棉的側翼序列是對其進行后續(xù)研究的必要步驟。

4 結論

本研究通過FPNI-PCR 成功擴增出cry2Ab4基因抗蟲棉（L280）與轉cry2Ab4＋vip3Aa11 基因雙價抗蟲棉 （L282） 的側翼序列。 確定了它們的T-DNA 插入位置， 分別位于棉花基因組染色體D13 上61 309 969-61 309 997 bp 區(qū) 間 和D11 上11 069 019-11 069 039 bp 區(qū)間。 通過設計特異性引物， 對插入位點的準確性與T-DNA 區(qū)域的完整性分別進行了驗證分析。檢測兩種抗蟲棉的側翼序列不僅能夠為品種的保護在申請專利時提供理論依據， 也在后續(xù)研究以及安全證書的申請?zhí)峁祿巍?/p>