張益溢 吳佳琛 郝然 金尚忠? 曹良才?

1) (中國(guó)計(jì)量大學(xué)光學(xué)與電子科技學(xué)院, 杭州 310018)

2) (浙江省現(xiàn)代計(jì)量測(cè)試技術(shù)及儀器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 杭州 310018)

3) (精密測(cè)試技術(shù)及儀器國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 清華大學(xué)精密儀器系, 北京 100084)

1 引 言

數(shù)字全息顯微技術(shù)(digital holographic microscopy, DHM)結(jié)合數(shù)字全息與顯微成像技術(shù), 充分利用兩者優(yōu)勢(shì), 不僅能夠?qū)Υ郎y(cè)樣本進(jìn)行放大, 而且能實(shí)時(shí)記錄待測(cè)樣本的三維信息.1999 年 E. Cuche 課題組在待測(cè)樣本與CCD(charge coupled device)像感器之間放置顯微物鏡[1], 用于放大待測(cè)樣本的物光波, 僅基于單幅全息圖便可獲取有關(guān)樣品三維結(jié)構(gòu)的精確定量信息, 降低了對(duì)CCD 分辨率的要求, 實(shí)現(xiàn)了高分辨率顯微成像. 但由于顯微物鏡的小孔徑限制, 全息圖部分高頻成分在記錄過(guò)程中丟失, 重建像質(zhì)量受到影響, 因此數(shù)字全息顯微技術(shù)仍存在需要改進(jìn)的地方. 2003 年Ferraro 等[2,3]研究了自動(dòng)跟蹤聚焦的數(shù)字全息顯微鏡, 并在隨后的研究中提出了運(yùn)用多波長(zhǎng)數(shù)字全息技術(shù)來(lái)校正色差. 2006 年Charrière 等[4]將數(shù)字全息顯微技術(shù)與電子計(jì)算機(jī)斷層掃描技術(shù)(computed tomography, CT)相結(jié)合, 通過(guò)旋轉(zhuǎn)花粉細(xì)胞獲取其各方向的相位圖分布, 根據(jù)濾波反投影算法實(shí)現(xiàn)了生物樣品的三維成像. 2007 年Kemper 等[5]將數(shù)字全息顯微技術(shù)與生物醫(yī)學(xué)相結(jié)合, 重建了人體肝臟腫瘤細(xì)胞與血紅細(xì)胞(red blood cell, RBC)的三維形貌, 進(jìn)一步拓展了數(shù)字全息顯微的實(shí)踐應(yīng)用. 2008 年Kim 等[6]通過(guò)數(shù)字全息顯微術(shù)結(jié)合生物醫(yī)學(xué), 揭示了血管的形貌以及視網(wǎng)膜層的光學(xué)厚度分布. 國(guó)內(nèi)圍繞數(shù)字全息成像分辨率提升與生物細(xì)胞定量相位測(cè)量開(kāi)展了大量的工作. 在分辨率提升方面, 2010 年翟宏琛等[7]利用一種相位掩模板進(jìn)行多角度照明,實(shí)現(xiàn)了綜合孔徑數(shù)字全息超分辨率成像;2013年馬俊等[8]基于結(jié)構(gòu)光照明的數(shù)字全息顯微技術(shù),通過(guò)分離和合成傅里葉域中不同頻率區(qū)域的帶寬,可以獲得更高空間分辨率的重建圖像;同年王華英等[9,10]綜合分析了數(shù)字全息顯微成像系統(tǒng)的分辨率影響因素,對(duì)像面數(shù)字全息系統(tǒng)展開(kāi)了討論與研究;2015年姚保利等[11]利用散斑照明獲得重建物波中的合成數(shù)值孔徑,以提高分辨率;同年王大勇等[12,13]利用動(dòng)態(tài)空間光柵提高了數(shù)字全息成像分辨率,并通過(guò)微球體與像面數(shù)字全息相結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了分辨率增強(qiáng)的相襯成像.在上述研究中,由于分辨率得到了大幅提升,使得數(shù)字全息顯微更有效地分辨生物微觀結(jié)構(gòu)如人體細(xì)胞與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)等.在數(shù)字全息定量相位測(cè)量方面,2007 年董可平等[14]成功實(shí)現(xiàn)了生物細(xì)胞的定量相位測(cè)量;2008年趙建林等[15]通過(guò)拍攝兩幅全息圖并利用相位相減技術(shù)實(shí)現(xiàn)了活體細(xì)胞組織等相位型生物樣本的定量測(cè)量和有效觀察;2012年馬利紅等[16]建立了一套預(yù)放大式數(shù)字全息顯微成像系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了高分辨率的細(xì)胞定量相位測(cè)量;2018年肖文等[17]利用離軸馬赫澤德實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)成像,證明了細(xì)胞質(zhì)中肌動(dòng)蛋白對(duì)細(xì)胞骨架具有更大的支撐作用.2019年左超等[18,19]通過(guò)數(shù)字全息顯微結(jié)合自適應(yīng)松弛超像素分辨技術(shù),在利用相位恢復(fù)與數(shù)字重聚焦等算法或方法的基礎(chǔ)上,開(kāi)發(fā)了無(wú)透鏡數(shù)字全息顯微系統(tǒng),集成了定量相位、剖面分析、三維顯示和細(xì)胞計(jì)數(shù)等多項(xiàng)功能,具有無(wú)標(biāo)記、高通量、低成本和微型化的特點(diǎn),為面向臨床檢驗(yàn)應(yīng)用的顯微設(shè)備提供了有效的技術(shù)支撐.基于數(shù)字全息的定量相位成像技術(shù)滿足了活體細(xì)胞組織等相位型生物樣本定量測(cè)量和動(dòng)態(tài)觀察的需求,對(duì)于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展具有重要意義.

相較于當(dāng)前細(xì)胞成像領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的激光掃描共聚焦顯微(confocal laser scanning microscope,CLSM)技術(shù)[20]、近場(chǎng)光學(xué)顯微(near-fieldoptical microscopy,NSOM)技術(shù)[21]和光學(xué)相干層析成像(opticalcoherencetomography,OCT)技術(shù)[22]等,

數(shù)字全息顯微技術(shù)具備以下優(yōu)點(diǎn):(1)屬于面成像,在成像速度上極具優(yōu)勢(shì),僅根據(jù)單次曝光即可實(shí)時(shí)記錄待測(cè)樣本完整三維信息[5,23],利于生物活體組織的動(dòng)態(tài)變化的研究,傳統(tǒng)方法主要基于點(diǎn)掃描成像;(2)屬于寬光束照射,對(duì)光功率密度要求較低的同時(shí)無(wú)需熒光標(biāo)記,實(shí)現(xiàn)了無(wú)擾分析,而激光掃描共聚焦需在樣品上實(shí)現(xiàn)激光束聚焦,對(duì)焦點(diǎn)處的光功率密度要求較高,或需要對(duì)樣品進(jìn)行熒光標(biāo)記,無(wú)法實(shí)現(xiàn)無(wú)擾分析;(3)可以得到細(xì)胞折射率分布信息,對(duì)比當(dāng)前CT技術(shù)具有更高的空間分辨率,且對(duì)比度高,可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)聚焦,近場(chǎng)光學(xué)顯微技術(shù)僅能實(shí)現(xiàn)表面成像,而光學(xué)相干層析成像技術(shù)雖能得到生物體組織內(nèi)部的折射率分布信息,其空間分辨率約為5μm,成像深度在毫米量級(jí),需要進(jìn)一步改進(jìn)才能觀察人體細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)(1μm左右).通過(guò)數(shù)字全息顯微技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)寬視場(chǎng)亞微米級(jí)空間分辨率(0.5μm 左右),不僅可以清晰分辨人體細(xì)胞與亞細(xì)胞結(jié)構(gòu),并且可實(shí)現(xiàn)定量、三維和快速追蹤的成像,在細(xì)胞成像領(lǐng)域上具有獨(dú)特的應(yīng)用價(jià)值.

本文從生物醫(yī)學(xué)細(xì)胞成像應(yīng)用需求出發(fā),介紹了數(shù)字全息顯微成像的原理,綜述了同軸、離軸以及光鑷輔助離軸數(shù)字全息顯微系統(tǒng)如何對(duì)RBC進(jìn)行形貌信息提取,重點(diǎn)分析了瑞利索末菲反向傳播算法、清晰度量化算法、分水嶺分割算法、數(shù)字重聚焦方法與熱漲落方法在研究RBC的微形變、三維體積測(cè)量與空間分布等方面的應(yīng)用,概述了當(dāng)前數(shù)字全息顯微成像的發(fā)展與應(yīng)用前景.

2 數(shù)字全息顯微成像原理

2.1 數(shù)字全息顯微記錄原理

數(shù)字全息顯微光路如圖1所示,其中Object plane 代表物平面x0-y0,MOplane 代表顯微物鏡平面xm-ym,Hologramplane代表全息記錄平面x-y,Imageplane 代表透鏡成像平面xi-yi,樣品放置于距離顯微物鏡平面z0距離處[24],顯微物鏡平面與全息記錄面距離為zm,全息記錄面與透鏡成像平面的距離為z,R 作為參考光,與經(jīng)顯微物鏡放大后的物光O于全息記錄面上發(fā)生干涉,形成明暗相間的干涉條紋,這些條紋記錄了物體光波所有振幅與相位信息,是一個(gè)編碼和調(diào)制的過(guò)程.

設(shè)物光在物平面的光場(chǎng)分布為O0(x0,y0),根據(jù)菲涅爾衍射近似條件,物光波經(jīng)過(guò)距離z0衍射至顯微物鏡前表面時(shí), 其光場(chǎng)復(fù)振幅分布Of(xm,ym)為

圖1 數(shù)字全息原理示意圖Fig. 1. Optical layout of digital holography.

其中,λ表示物光波長(zhǎng),x0與y0表示物平面上的空間坐標(biāo),xm與ym表示顯微物鏡平面上的空間坐標(biāo),z0表示物平面與顯微物鏡平面的距離. 由于顯微物鏡在全息記錄過(guò)程中僅作為放大作用的透鏡, 依據(jù)透鏡的相位調(diào)制特性, 物光波經(jīng)過(guò)顯微物鏡傳播至其后表面時(shí), 其光場(chǎng)復(fù)振幅分布Ob(xm,ym) 為

其中,f為顯微物鏡的焦距, 物光波由顯微物鏡后表面經(jīng)過(guò)距離zm傳播至全息記錄面時(shí), 其光場(chǎng)復(fù)振幅分布O(x,y) 為

由于顯微物鏡的放大作用, 全息記錄面記錄的物光場(chǎng)相對(duì)原物光場(chǎng)存在坐標(biāo)縮放的關(guān)系. 同理,參考光傳播至全息記錄面的光學(xué)路徑與物光類(lèi)似,參考光到全息記錄面的距離與物光到全息記錄面的距離相等, 設(shè)參考光在全息記錄面的光場(chǎng)分布為R(x,y) , 物光和參考光在全息記錄面上發(fā)生干涉形成全息圖, 全息圖的光場(chǎng)分布為

則全息記錄面上全息圖的強(qiáng)度分布為其光場(chǎng)分布的平方, 其強(qiáng)度分布為

式中, 第一項(xiàng)表示物光的強(qiáng)度分布, 第二項(xiàng)表示參考光的強(qiáng)度分布, 第一項(xiàng)與第二項(xiàng)合稱為零級(jí)項(xiàng)或直流項(xiàng); 第三項(xiàng)表示物光場(chǎng)的復(fù)振幅分布, 包含了物光波波前的振幅信息與相位信息, 進(jìn)行數(shù)值重建時(shí)可獲得待測(cè)樣本的真實(shí)物像[25]; 第四項(xiàng)表示物光場(chǎng)的的共軛復(fù)振幅分布, 數(shù)值重建時(shí)會(huì)產(chǎn)生孿生像, 這是全息圖重建時(shí)獲得重建像的最大干擾項(xiàng),需要在重建過(guò)程中通過(guò)算法進(jìn)行分離.

2.2 數(shù)字全息顯微重建原理

數(shù)字全息重建通過(guò)計(jì)算機(jī)數(shù)值模擬重建光波經(jīng)過(guò)數(shù)字全息圖后的衍射過(guò)程, 實(shí)現(xiàn)數(shù)值重建, 在數(shù)字全息顯微成像系統(tǒng)中重建的并非物光本身, 而是由顯微物鏡放大后所成的物光場(chǎng), 根據(jù)近似條件不同可將模擬衍射成像方法分為菲涅爾重建法、卷積重建法、角譜重建法[26]. 三種重建法均基于菲涅爾-基爾霍夫衍射公式進(jìn)行近似處理或變換后所得.菲涅爾重建法重建圖像的像素尺寸δx與重建距離z滿足關(guān)系:δx=λz/X0, 其中X0為全息圖尺寸.這意味著重建圖像的大小會(huì)隨著重建距離增加, 而采用卷積重建法和角譜重建法所得圖像像素尺寸始終與全息圖像素尺寸相同. Kreis 等[27]采用菲涅爾重建法與卷積重建法分別對(duì)CCD 記錄下的骰子全息圖進(jìn)行了重建, 其中骰子位于CCD 前1.054 m處, 且骰子尺寸大于CCD 尺寸. 采用菲涅爾重建法可直接重建完整的骰子圖像, 而采用卷積重建法需要平移CCD 采集多幅全息圖或者補(bǔ)零操作才能完整重建骰子圖像, 因此菲涅爾重建法適用于尺寸大于像感器的待測(cè)樣本. 王大勇等[28]分別利用菲涅爾重建法、卷積重建法與角譜重建法對(duì)骰子全息圖進(jìn)行重建, 比較了三種方法的重建速度, 其中菲涅爾重建法的執(zhí)行時(shí)間為0.97 s, 速度最快, 而卷積重建法的執(zhí)行時(shí)間為2.36 s, 速度最慢, 另外角譜重建法的執(zhí)行時(shí)間為1.22 s. 菲涅爾重建法僅通過(guò)一次正傅里葉變換即獲得重建像; 卷積重建法由于其傳播函數(shù)在空域中表示, 需要經(jīng)過(guò)兩次正傅里葉變換和一次逆傅里葉變換獲得重建像; 角譜重建法與卷積重建法原理類(lèi)似, 其傳播函數(shù)在頻域中表示, 需要經(jīng)過(guò)一次正傅里葉變換和一次逆傅里葉變換獲得重建像, 通過(guò)比較像質(zhì)得到角譜重建法的準(zhǔn)確性優(yōu)于卷積重建法. 而根據(jù)USAF 鑒別率板的重建, 得到在卷積重建與角譜重建中均存在最優(yōu)重建距離, 當(dāng)重建距離不同于最優(yōu)距離時(shí), 重建像的分辨率會(huì)下降, 此時(shí)角譜重建法的結(jié)果優(yōu)于卷積重建法[29,30]. 卷積重建法僅能在最佳重建距離附近較小的范圍內(nèi)獲得高分辨率重建像, 適用性上存在不足, 而角譜重建法重建速度較快, 在最佳重建距離附近較大范圍都能獲得高分辨率的重建像[31].

下面以卷積重建法與角譜重建法為例, 介紹生物細(xì)胞全息圖的重建, 卷積重建過(guò)程由記錄全息圖的光場(chǎng)分布H(x,y) 以及卷積重建空域內(nèi)的傳播函數(shù)h(xi ?x,yi ?y) 構(gòu)成, 通過(guò)快速傅里葉變換(fast Fourier transform, FFT)進(jìn)行運(yùn)算:

而角譜重建過(guò)程由光場(chǎng)分布H(x,y) 與角譜重建頻域內(nèi)的傳播函數(shù)G(fxi,fyi) 構(gòu)成, 通過(guò)FFT 進(jìn)行運(yùn)算:

其中,F與F?1分別表示快速傅里葉變換與快速傅里葉逆變換, 如圖2 所示,x,y表示全息記錄面上的空間坐標(biāo),xi與yi表示重建成像平面上的空間坐標(biāo),fxi與fyi表示成像面上 (xi,yi) 對(duì)應(yīng)的頻率坐標(biāo),K(fx,fy)=F{H(x,y)}表示在全息記錄面上的全息圖頻譜.

圖2 數(shù)字全息顯微重建原理圖Fig. 2. Optical layout of digital holographic reconstruction.

重建圖像的強(qiáng)度可根據(jù)|Γ(xi,yi)|獲得, 由角譜分析方法可對(duì)(8)式進(jìn)行進(jìn)一步簡(jiǎn)化[32], 其表達(dá)式如下:

其中,λ表示光源波長(zhǎng),z表示全息記錄面與成像面的距離. 可通過(guò)(7)式對(duì)記錄面所得全息圖進(jìn)行卷積重建或結(jié)合(8)式與(9)式對(duì)記錄面所得全息圖進(jìn)行角譜重建, 獲得經(jīng)顯微物鏡放大后待測(cè)樣本的數(shù)值重建像.

對(duì)于同軸全息系統(tǒng), 由于重建像與孿生像重疊, 需要在數(shù)字全息記錄過(guò)程中引入相移裝置, 再根據(jù)相移法將所需重建像與孿生像進(jìn)行分離, 提取出待測(cè)樣本的物像[33,34]; 對(duì)于離軸全息系統(tǒng), 選擇適當(dāng)?shù)奈锕馀c參考光的入射夾角, 使物光與參考光以一定夾角入射至像感器記錄面上, 產(chǎn)生干涉全息圖, 通過(guò)濾波以濾除孿生像, 提取出待測(cè)樣本的物像. 在離軸全息系統(tǒng)中, 由于物光與參考光存在夾角, 會(huì)產(chǎn)生一次項(xiàng)附加相位(呈現(xiàn)斜面分布), 而無(wú)論是離軸還是同軸全息系統(tǒng), 當(dāng)RBC 等弱散射物體的相位信息加載于經(jīng)顯微物鏡后形成的球面波上時(shí), 均會(huì)引入二次項(xiàng)附加相位(呈現(xiàn)球面分布),這些附加相位所產(chǎn)生的調(diào)制會(huì)使待測(cè)樣本自身的相位分布難以恢復(fù), 引起包裹相位的欠采樣, 最終影響到相位解包裹的準(zhǔn)確性, 可在參考光路放置與物光光路完全相同的顯微物鏡進(jìn)行補(bǔ)償[35], 或通過(guò)數(shù)據(jù)擬合進(jìn)行自動(dòng)相位校正[36], 或采用前后兩次拍攝全息圖進(jìn)行相位相減來(lái)實(shí)現(xiàn)相位校正[15],此時(shí)通過(guò)同軸或離軸系統(tǒng)獲得的校正相位分布在[–π, π]之間, 還需要進(jìn)行相位解包裹以實(shí)現(xiàn)待測(cè)樣本相位圖像的恢復(fù)[37,38].

為有效測(cè)量RBC 的微形變, 三維體積及其空間分布, 當(dāng)前相關(guān)RBC 測(cè)量的數(shù)字全息顯微系統(tǒng)在重建時(shí)主要采用卷積重建法或角譜重建法.

3 血紅細(xì)胞數(shù)字全息顯微成像系統(tǒng)

RBC 是血液中的主要有形成分, 約占血液體積的50%, 生存環(huán)境的改變會(huì)引起RBC 病理性變化, 如糖尿病患者體內(nèi)的高血糖環(huán)境會(huì)導(dǎo)致RBC 雙凹圓盤(pán)狀喪失、形態(tài)拉長(zhǎng)、體積減小、變形性降低[39,40], 心血管疾病患者體內(nèi)RBC 體積分布寬度(RDW)升高[41,42], 帕金森氏疾病患者體內(nèi)存在氧化應(yīng)激, 氧化應(yīng)激會(huì)引起體內(nèi)RBC 功能性障礙與凋亡[43,44], 因此如何提取RBC 的生物學(xué)參數(shù)與形貌信息將有助于研究人體的糖尿病、心血管疾病、帕金森氏疾病等. 常規(guī)的RBC 血液測(cè)量技術(shù)血管造影與超聲多普勒分析所提供的血管形狀信息與血流速度信息的空間分辨率較差[45,46]; 粒子圖像測(cè)速(particle image velocimetry, PIV)在血液動(dòng)力學(xué)信息的測(cè)量得到廣泛應(yīng)用, 但其僅能在較淺的景深中固有地提供二維平面信息, 在應(yīng)用范圍上存在較大缺陷[47,48]; 光學(xué)相干層析成像在血流動(dòng)力學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用, 能實(shí)現(xiàn)生物組織微觀結(jié)構(gòu)顯示,但RBC 的對(duì)比度較低[49]; 光聲成像(photoacoustic imaging, PAI)能同時(shí)實(shí)現(xiàn)灌注成像與血流成像,且RBC 的對(duì)比度較高, 但其難以完成單個(gè)RBC 的動(dòng)態(tài)追蹤[50]. 本節(jié)綜述了同軸、離軸以及光鑷輔助離軸數(shù)字全息顯微技術(shù), 這些技術(shù)利用瑞利索末菲反向傳播算法、清晰度量化算法、分水嶺分割算法、數(shù)字重聚焦方法等不僅可以獲取高分辨率的血管形狀與血流速度信息[51], 進(jìn)一步地還能夠檢測(cè)單個(gè)RBC 的形狀變化[52], 甚至可以完成RBC 動(dòng)態(tài)追蹤, 實(shí)時(shí)測(cè)量RBC 三維體積, 實(shí)現(xiàn)無(wú)損3D 成像[53,54], 對(duì)于人體的糖尿病、心血管疾病、帕金森氏疾病等病理研究具有重大意義.

3.1 同軸數(shù)字全息顯微系統(tǒng)測(cè)量RBC 形變

為實(shí)現(xiàn)以數(shù)字全息顯微成像技術(shù)為基礎(chǔ), 高效率、低計(jì)算強(qiáng)度、低成本地分析細(xì)胞的形態(tài)變化并跟蹤軸向位置提取三維坐標(biāo), 瑞典于默奧大學(xué)Andersson 等[52]設(shè)計(jì)了一套同軸數(shù)字全息系統(tǒng)并提出了一種方法, 通過(guò)瑞利索末菲反向傳播算法重建復(fù)振幅實(shí)部信息, 精確確定RBC 軸向位置并提供幾何形狀信息. 其光學(xué)系統(tǒng)的分析與實(shí)現(xiàn)可根據(jù)圖3 所述結(jié)構(gòu)進(jìn)行描述, 光學(xué)系統(tǒng)圍繞Olympus IX71 顯微鏡引入相關(guān)光學(xué)元件, 采用低成本發(fā)光二極管(470 nm, M470 L3-C1)發(fā)射LED 光[55], 多模光纖安裝于壓電控制顯微鏡載物臺(tái)(PS)上方[56],載物臺(tái)上放置單個(gè)RBC 樣品, 其通過(guò)人體血液與500 μL 的 pH=7.4 磷酸鹽緩沖溶液混合并離心提取制備而成, 多模光纖可以對(duì)LED 光進(jìn)行頻率濾波, 穩(wěn)定輸出光源, 經(jīng)過(guò)RBC 發(fā)生衍射的光作為物光, 而未經(jīng)過(guò)待測(cè)樣本的光作為參考光, 兩束光均 經(jīng) 過(guò) 浸 水物鏡MO(60×/1.40NA)放 大,在CCD 像感器上發(fā)生相干疊加, 記錄下RBC 全息圖, 其中顯微鏡的壓電控制載物臺(tái)可進(jìn)行軸向移動(dòng)以精確控制物面與記錄面的距離 z , 以10 μm 為記錄間隔分別記錄z = 30—100 μm 共8 幅RBC 全息圖像. 根據(jù)同軸全息重建算法分別對(duì)8 幅RBC 全息圖進(jìn)行重建, 計(jì)算各RBC 全息圖像在不同重建距離 z′下的歸一化強(qiáng)度, 認(rèn)定歸一化強(qiáng)度最大位置即幾何焦點(diǎn)位置, 如圖4(a)所示, 插圖表示仿真實(shí)驗(yàn)使用6.3 μm 寬, 折射率 n=1.40 的RBC形狀的Cassini 模型, 綠線與紅線分別代表實(shí)際實(shí)驗(yàn)與仿真實(shí)驗(yàn)中RBC 在不同記錄距離z =30—100 μm下對(duì)應(yīng)的最佳反向重建距離, 可以看出, 在不同的記錄距離z 下, 通過(guò)分別計(jì)算RBC全息重建圖的歸一化強(qiáng)度最大值, 可以精確地得到8 個(gè)記錄距離下對(duì)應(yīng)的幾何焦點(diǎn)位置, 作為最佳反向重建距離, 仿真實(shí)驗(yàn)與實(shí)際實(shí)驗(yàn)所得到的反向重建距離曲線一致.

圖3 同軸數(shù)字全息顯微成像系統(tǒng)檢測(cè)血紅細(xì)胞形變[52]Fig. 3. Inline digital holographic microscopic system for detecting micro-deformation of RBC[52].

第一步, 在合適的記錄距離下, 將實(shí)際實(shí)驗(yàn)RBC 與仿真實(shí)驗(yàn)RBC 在不同重建距離z′ = 0—100 μm 復(fù)振幅實(shí)部信息 Re(U) 進(jìn)行對(duì)應(yīng)比較, 圖4(b)中表示綠線與紅線分別代表當(dāng)記錄距離z = 60 μm時(shí), 實(shí)際實(shí)驗(yàn)RBC 與仿真實(shí)驗(yàn)RBC 的復(fù)振幅實(shí)部信息 Re(U) 隨反向重建距離變化而相應(yīng)的值, 在相變位置z′ = 60 μm 周?chē)? 實(shí)際實(shí)驗(yàn)RBC 與仿真實(shí)驗(yàn)RBC 的 Re(U) 曲線吻合良好; 第二步, 進(jìn)一步研究RBC 微小形態(tài)變化對(duì) Re(U) 的影響, 通過(guò)改變仿真實(shí)驗(yàn)RBC 的模型參數(shù), 使初始RBC 發(fā)生微小形變, 微形變后RBC 在不同記錄距離 z 下歸一化強(qiáng)度峰值分布與初始RBC 基本重疊, 但其Re(U) 變化較大, 如圖4(b)中紫線所示, z′ = 60 μm附近波峰值提高, 而波谷位置由z′ = 50 μm 處移至z′ = 35 μm 附近, 且波谷值出現(xiàn)了下降, 表明RBC 微小形變可根據(jù)檢測(cè) Re(U) 的變化得出; 第三步, 為證明提出實(shí)部信息 Re(U) 重建方法的魯棒性, 作者在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中選取了比初始RBC 體積小約20%的新型RBC 作為對(duì)象, 在仿真實(shí)驗(yàn)中更改RBC 模型參數(shù), 使其表示為一個(gè)5.04 μm 寬的RBC 形狀模型, 其實(shí)際實(shí)驗(yàn)RBC 與仿真實(shí)驗(yàn)RBC 在不同重建距離z′ = 0—100 μm 復(fù)振幅實(shí)部信息 Re(U) 的曲線如圖4(c)所示, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 在選取不同體積的RBC 的情況下, 實(shí)際實(shí)驗(yàn)與仿真實(shí)驗(yàn)的 Re(U)曲線仍良好吻合, 因此 Re(U)提供了足夠信息以區(qū)分細(xì)胞不同的幾何形狀. 綜上所述, 所提出瑞利索末菲反向傳播算法可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞形狀的辨別, 應(yīng)用于生物學(xué)中數(shù)量龐大且深度不同的細(xì)胞在特定時(shí)間段內(nèi)形態(tài)變化的病理研究.

圖4 RBC 形變與重建的復(fù)振幅實(shí)部信息之間聯(lián)系的結(jié)果分析 (a)不同記錄距離z 下最佳反向重建距離z', 綠線代表實(shí)際實(shí)驗(yàn), 紅線代表模擬實(shí)驗(yàn), 插圖代表模擬實(shí)驗(yàn)所用RBC; (b)綠線代表實(shí)際實(shí)驗(yàn)RBC 的Re(U), 紅線與紫線分別代表模擬實(shí)驗(yàn)中初始RBC 與變形后RBC 的Re(U); (c)所用RBC 比(b)所用小約20%, 綠線與紅線分別代表實(shí)際實(shí)驗(yàn)與模擬實(shí)驗(yàn)所得Re(U)結(jié)果;(b)與(c)所用黑線表示RBC 的記錄距離[52]Fig. 4. The relationship between the RBC deformation and the real part of reconstructed amplitude. (a) The reconstruction distance z' to the focus at different recording distances z of the simulated RBC (red) and the experiment using a real RBC (green). Inset shows the Cassini model of the RBC used in the simulations; (b) the experiment using a real RBC (green), the reconstructed Re(U) for the simulated unaltered RBC and a deformed RBC represented by the red and blue curves, respectively; (c) reconstructed data from a ~20% smaller RBC compared with the one used in (b). Red and green curves represent the Re(U) of simulation and experiment, respectively; Gray vertical line in (b) and (c) indicates position of the RBC[52].

3.2 同軸數(shù)字全息顯微測(cè)量RBC 空間分布

通過(guò)高空間分辨率地提取血流量信息, 進(jìn)而實(shí)現(xiàn)人體循環(huán)系統(tǒng)血管疾病的跟蹤監(jiān)測(cè), 這是當(dāng)前生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要課題之一. 韓國(guó)浦項(xiàng)科技大學(xué)Lee 等[51]提出了一套同軸數(shù)字全息顯微系統(tǒng), 通過(guò)數(shù)字全息顯微成像技術(shù)對(duì)流動(dòng)的RBC 逐一進(jìn)行追蹤, 引入了清晰度量化算法對(duì)重建的RBC 圖像進(jìn)行評(píng)估, 定位RBC 的精確深度位置, 可獲取單個(gè)RBC 的運(yùn)動(dòng)狀態(tài), 實(shí)現(xiàn)高空間分辨率的血流量信息測(cè)量. 其光學(xué)系統(tǒng)的分析與實(shí)現(xiàn)可根據(jù)圖5 所述結(jié)構(gòu)進(jìn)行描述, 注射泵(SP)注射血溶液經(jīng)過(guò)肝素化處理, 防止凝結(jié), 溶液中RBC 數(shù)量為3.2 ×103cell/mm3以防止RBC 在全息圖中出現(xiàn)重疊.He-Ne 激光器發(fā)出632.8 nm 波長(zhǎng)紅光, 經(jīng)過(guò)水溶液與氟化乙烯丙烯(FEP)微管后進(jìn)入血溶液, 部分光經(jīng)過(guò)血溶液中的RBC 發(fā)生衍射作為物光, 而未通過(guò)RBC 而直接透過(guò)的光作為參考光, 兩束光由浸水顯微物鏡MO(20×/0.50NA)放大后在CMOS 記錄面上發(fā)生相干疊加, 產(chǎn)生干涉全息圖,由于血溶液折射率nmedium=1.346 , FEP 微管折射率nFEP=1.338, 水的折射率nwater=1.333 , 三者折射率幾乎相同, 避免了折射像畸變問(wèn)題. 實(shí)驗(yàn)初始階段首先移動(dòng)CMOS 像感器以找到同時(shí)滿足成像清晰與足夠視場(chǎng)兩個(gè)條件的合適位置, 將CMOS像感器固定, 在測(cè)量體積600 μm × 350 μm ×350 μm 范圍內(nèi)可觀察到185 個(gè)RBC. 根據(jù)同軸全息重建算法對(duì)RBC 圖像進(jìn)行重建, 重建距離設(shè)定為深度方向上以2 μm 為間隔建立共計(jì)200 個(gè)重建切片進(jìn)行RBC 圖像的重建得到重建圖像.

圖5 同軸數(shù)字全息顯微成像系統(tǒng)追蹤紅細(xì)胞空間分布[51]Fig. 5. Inline digital holographic microscopic system for tracking spatial distribution of RBCS[51].

為得到流動(dòng)RBC 實(shí)際深度位置z, 引入圖像清晰度量化算法對(duì)重建圖像進(jìn)行判斷[57]:

式中表示重建圖像強(qiáng)度梯度的變化狀況, 其中參數(shù)指標(biāo) LAP(z) 可以在忽略恒定強(qiáng)度梯度部分的情況下, 用于測(cè)量圖像的高頻邊緣成分進(jìn)而反映RBC 的聚焦值, 在本實(shí)驗(yàn)中對(duì)比其余圖像清晰度量化算法其精度更高[58,59], 參數(shù)指標(biāo) LAP(z) 的大小隨著重建距離z′的變化而變化, 可用于描述同一個(gè)RBC 在不同距離的重建切片下其聚焦值的大小變化, 由于實(shí)驗(yàn)在深度方向上以2 μm 為間隔建立共計(jì)200 個(gè)重建切片, 則同一個(gè)RBC 在200 個(gè)重建距離下存在200 個(gè)聚焦值, 以重建距離為橫坐標(biāo), 用光滑曲線表示200 個(gè)聚焦值, 其聚焦值最大位置表示焦點(diǎn)位置, 定義此位置為RBC 的最佳重建距離, 根據(jù)計(jì)算顯微物鏡的軸向放大率可進(jìn)一步得到RBC 的深度位置. 圖6(a)表示CMOS 像感器所采集的RBC 全息圖, 圖中共存在185 個(gè)RBC, 且RBC 的深度互有異同. 首先對(duì)RBC 進(jìn)行分割與重建, 根據(jù)清晰度量化算法對(duì)重建圖像進(jìn)行最佳重建距離判定, 進(jìn)一步獲得RBC 的深度位置. 圖6(b)—6(d)分別表示重建距離z'= 168 μm、z'= 250 μm、z'= 382 μm 時(shí)RBC 重建圖像, 其中箭頭表示該重建距離下可清晰觀察到的單個(gè)RBC 樣品, 依次確定全息圖中185 個(gè)RBC 的深度位置, 聚焦RBC 中心位置的光強(qiáng)度具有局部最小值, 可通過(guò)光強(qiáng)度大小判斷每一個(gè)RBC 的橫向位置 (x,y) .

綜上所述, 可以獲取全息圖記錄的每一個(gè)RBC 的三維信息, 其相關(guān)x,y,z測(cè)量精度如表1所示, 由表可知RBC 的橫向信息與軸向信息的測(cè)量精度均較高, 能準(zhǔn)確獲取RBC 的三維信息. 進(jìn)一步地, 通過(guò)CMOS 像感器的連續(xù)拍攝, 記錄RBC 的運(yùn)動(dòng)軌跡全息圖, 通過(guò)同軸全息重建算法對(duì)RBC 進(jìn)行重建, 分析FEP 微流管內(nèi)RBC 的三維運(yùn)動(dòng), 實(shí)現(xiàn)RBC 動(dòng)態(tài)追蹤, 得到RBC 的實(shí)時(shí)空間分布.

圖6 RBC 的全息圖與重建圖像 (a) CMOS 像感器拍攝FEP 微管內(nèi)RBC 所得全息圖; (b), (c), (d)分別表示不同重建深度下RBC 重建圖像, 箭頭表示聚焦的RBC[51]Fig. 6. The hologram and the reconstruction images of RBCs. (a) The RBC hologram obtained from CMOS; (b),(c), and (d) represent RBC reconstruction images at different reconstruction depths, respectively. Each focused RBC is shown by an arrow[51].

表1 RBC 橫向信息與軸向信息的測(cè)量精度[51]Table 1. The lateral and axial measurement accuracy of RBC[51].

3.3 離軸數(shù)字全息顯微系統(tǒng)識(shí)別RBC 形狀

為實(shí)現(xiàn)高分辨率和無(wú)損地識(shí)別不同形狀生物細(xì)胞[60,61], 韓國(guó)朝鮮大學(xué)的Moon 等[54]提出一套離軸數(shù)字全息顯微系統(tǒng)用于測(cè)量RBC 的三維體積, 該系統(tǒng)引入分水嶺分割算法, 它是一種基于拓?fù)淅碚摰臄?shù)學(xué)形態(tài)學(xué)分割算法, 將圖像看作一幅地形圖, 圖像中每一點(diǎn)像素灰度值表示該點(diǎn)海拔高度, 將每一個(gè)局部極小值及其影響區(qū)域作為集水盆, 集水盆的邊界形成分水嶺, 根據(jù)圖像自身灰度差異進(jìn)行區(qū)域劃分[62]. 通過(guò)分水嶺分割算法對(duì)重建RBC 相位圖像進(jìn)行區(qū)分, 單獨(dú)提取每一個(gè)RBC, 根據(jù)單個(gè)RBC 自身表面積和相位值使用自動(dòng)算法分別計(jì)算每個(gè)RBC 的體積, 生成全部RBC 的三維體積分布. 為驗(yàn)證該方案的可行性, 通過(guò)上述方案分別計(jì)算生成口腔狀RBC 與盤(pán)狀RBC 的三維體積分布, 實(shí)驗(yàn)表明, 所提出的離軸數(shù)字全息顯微成像方法可以對(duì)各種形狀RBC 進(jìn)行三維體積定量分析, 其光學(xué)系統(tǒng)的分析與實(shí)現(xiàn)可根據(jù)圖7 所述結(jié)構(gòu)進(jìn)行描述, 激光器發(fā)射682 nm 波長(zhǎng)紅光, 由分束器(BS1)將入射光分為兩束, 第一束經(jīng)過(guò)待測(cè)樣本發(fā)生衍射, 經(jīng)顯微物鏡MO(40×/0.75NA)放大后作為放大物光先后經(jīng)過(guò)反射鏡與分束器后入射至CCD 像感器, 第二束光作為參考光, 通過(guò)分束器(BS2)后與放大物光在CCD 像感器上發(fā)生干涉, CCD 像感器記錄生成的全息圖.

圖7 離軸數(shù)字全息顯微成像系統(tǒng)測(cè)量不同形狀RBC 三維體積[54]Fig. 7. Off-axis digital holographic microscopy system for measuring RBCs’ three-dimensional volume of different shapes[54].

根據(jù)離軸全息重建算法對(duì)記錄的全息圖進(jìn)行重建生成RBC 相位圖, 單個(gè)RBC 的體積計(jì)算公式如下:

其中,N表示RBC 的像素總數(shù),p表示像素尺寸大小,φ表示RBC 內(nèi)每個(gè)像素對(duì)應(yīng)的相位值,M為顯微物鏡的放大倍數(shù). RBC 折射率nrbc=1.396 ,HEPA 介質(zhì)折射率nm=1.3334 .

為了研究不同形狀RBC 的三維體積, 在圖7 中選取了口腔狀(stomatcyte)RBC 與盤(pán)狀(discocyte)RBC 進(jìn)行對(duì)比. 口腔狀RBC 與盤(pán)狀RBC 重建相位圖像如圖8(a)、8(b)所示, 通過(guò)分水嶺分割算法去除相位圖像背景與RBC 的互相重疊部分, 對(duì)RBC 進(jìn)行逐一區(qū)分, 如圖8(c), 8(d)所示, 可以看出口腔狀RBC 的重建相位圖像與盤(pán)狀RBC 的重建相位圖像中相鄰細(xì)胞間均明顯隔開(kāi), 能夠?qū)崿F(xiàn)單個(gè)口腔狀RBC 或盤(pán)狀RBC 的提取. 為了對(duì)RBC的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行更合理地分析, 通過(guò)標(biāo)記分水嶺分割算法對(duì)圖8(e)所表示的單個(gè)RBC 進(jìn)行標(biāo)記, 得到標(biāo)記后的單個(gè)RBC 的整體C 部分, 如圖8(h)所示, 經(jīng)過(guò)標(biāo)記分水嶺分割算法計(jì)算得到單個(gè)RBC 的A 部分, 如圖8(f)所示. 通過(guò)減法運(yùn)算, 將單個(gè)RBC 的整體C 部分減去A 部分可得到RBC的B 部分, 如圖8(g)所示.

圖8 RBC 的相位重建圖像 (a)重建的口腔形狀RBC 相位圖像; (b)重建的盤(pán)狀RBC 相位圖像; (c)重建后經(jīng)分水嶺算法分割的口腔形狀RBC 相位圖像; (d)重建后經(jīng)分水嶺算法分割的盤(pán)狀RBC 相位圖像; (e)分割的單個(gè)RBC 相位圖像; (f)(g)(h)分別經(jīng)標(biāo)記分水嶺算法進(jìn)一步分割得到的單個(gè)RBC 的A、B、C 部分[54]Fig. 8. The reconstructed phase image for RBCs (a) The reconstructed phase image for RBCs having a stomatocyte shape; (b) the reconstructed RBCs phase image for RBCs having a discocyte shape; (c)the segmented phase image for RBCs having a stomatocyte shape; (d) the segmented phase image for RBCs having a discocyte shape; (e) the segmented phase image for single RBC(f), (g) and(h) represent the A, B and C parts by the marker-controlled watershed algorithm in RBC, respectively[54].

為了對(duì)兩種不同形狀RBC 的三維體積進(jìn)行定量研究, 首先計(jì)算出最佳重建距離下RBC 的相位分布, 再根據(jù)(11)式分別對(duì)每個(gè)口腔狀或盤(pán)狀RBC 的A 與B 部分進(jìn)行計(jì)算, 得到平均體積和均方根誤差的數(shù)值, 結(jié)果如表2 所示. 由表可知盤(pán)狀RBC 的A 部分體積大于口腔狀RBC 的A部分體積, 而B(niǎo) 部分體積小于口腔狀RBC 的B部分體積, 根據(jù)進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)假設(shè)檢驗(yàn)證明了RBC 的三維體積隨著其形狀的改變會(huì)出現(xiàn)較大區(qū)別[63]. 綜上所述, 根據(jù)RBC 的體積自動(dòng)計(jì)算算法結(jié)合分水嶺分割算法可以研究不同形狀RBC 的三維體積并且實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)RBC 的三維體積變化, 對(duì)生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中細(xì)胞成像發(fā)展研究具有極大價(jià)值.

表2 兩種不同形狀RBC 的A、B 部分的三維體積Table 2. The different shapes of RBC’s three-dimensional volume of A and B parts.

3.4 離軸數(shù)字全息顯微系統(tǒng)測(cè)量RBC 體積

數(shù)字全息的定量相襯成像在顯微生物成像中具備了多種新應(yīng)用[64], 其中包括微觀對(duì)象的評(píng)估,如生物細(xì)胞生長(zhǎng)觀測(cè)[65], 由滲透壓引起的細(xì)胞體積變化檢測(cè)[66], RBC 監(jiān)測(cè)[67]. 這些研究中通常使用定性指標(biāo)即通過(guò)重建圖像視覺(jué)質(zhì)量來(lái)進(jìn)行焦平面評(píng)估, 因此獲取結(jié)果具有不確定性[68?70]. 基于此, 美國(guó)杜克大學(xué) Wax 等[53]設(shè)計(jì)了一套離軸數(shù)字全息系統(tǒng)并提出了一種數(shù)字重聚焦方法, 通過(guò)定量指標(biāo)評(píng)估焦平面并描述微觀物體的方法, 在嘗試多種最佳焦平面的評(píng)估方法并對(duì)比每種方法的重建圖像效果后, 選擇振幅方差最小化作為定量指標(biāo),由于其在評(píng)估物體透射的相位圖像時(shí), 在深度方向聚焦清晰度與聚焦范圍均具有較大優(yōu)勢(shì), 且計(jì)算量較小, 可找到理想的焦平面位置. 其光學(xué)系統(tǒng)的分析與實(shí)現(xiàn)可根據(jù)圖9 所述結(jié)構(gòu)進(jìn)行描述, 低相干激光器發(fā)射589 nm 黃光, 分束器將黃光分為兩束,由后向反射鏡實(shí)現(xiàn)兩束光的光程匹配, 第一束光通過(guò)后向反射鏡調(diào)整光程入射至RBC 發(fā)生衍射,RBC 置于樣品臺(tái)上, 樣品臺(tái)可移動(dòng)以控制樣品與焦平面距離, 衍射光經(jīng)過(guò)顯微物鏡MO( 40×/0.75NA)放大后作為放大物光入射至CMOS 像感器; 另一束光作為參考光通過(guò)后向反射鏡調(diào)整光程經(jīng)顯微物鏡MO(40×/0.75NA)放大后作為放大參考光與放大物光在CMOS 像感器上發(fā)生相干疊加, 形成全息圖, 由CMOS 記錄生成的全息圖.

圖9 離軸數(shù)字全息顯微系統(tǒng)研究散焦現(xiàn)象對(duì)RBC 三維體積測(cè)量影響[53]Fig. 9. Off-axis digital holographic microscopy system for investigating the effect of defocus on RBC three-dimensional volume measurement[53].

根據(jù)離軸全息重建算法對(duì)記錄全息圖進(jìn)行重建, 獲得RBC 重建圖像. 為檢驗(yàn)該定量指標(biāo)評(píng)估焦平面后重建物體的指標(biāo), 定義了微觀物體的光學(xué)體積, 公式如下

其中, 光程長(zhǎng)度的變化 ?OPL(x,y)=?φ(x,y)/k=?n(x,y)·h(x,y)用于描述微觀物體,h(x,y) 表示物體的厚度(高度)圖, ?n(x,y) 表示物體折射率圖,k=2π/λ表示波數(shù), 合并 ?OPL(x,y) 參數(shù)產(chǎn)生物體光學(xué)體積OV的度量, 若物體的折射率均勻,即 ?n(x,y)=?, 說(shuō)明物體光學(xué)體積與物體真實(shí)體積線性相關(guān),OV=?.

為進(jìn)一步比較定性指標(biāo)與定量指標(biāo)分析中分別評(píng)估得到的焦平面效果, 根據(jù)焦平面各自對(duì)應(yīng)的重建物體圖像的光學(xué)體積對(duì)比原物體光學(xué)體積真值, 以誤差值衡量所得焦平面的效果. 引入直徑為8 μm 的聚苯乙烯微球(直徑變異系數(shù)1%)作為樣品, 首先根據(jù)人工聚焦方法即重建圖像視覺(jué)質(zhì)量來(lái)進(jìn)行焦平面評(píng)估, 移動(dòng)樣品臺(tái)通過(guò)CMOS 像感器記錄微球全息圖, 在不同重建距離下對(duì)微球圖像進(jìn)行重建, 通過(guò)人工觀察重建微球的圖像質(zhì)量確定最佳焦平面位置, 再計(jì)算重建微球的相位分布, 設(shè)定此時(shí)重建微球球心所在平面位置為z= 0. 根據(jù)提出的數(shù)字重聚焦方法計(jì)算z= ± 50 μm 范圍內(nèi)微球球心處的振幅方差, 確定振幅方差最小值位置為z= –2.46 μm, 將其作為最佳焦平面位置, 并計(jì)算微球的相位分布. 通過(guò)(12)式分別計(jì)算人工聚焦方法與數(shù)字重聚焦方法所得微球光學(xué)體積, 對(duì)比微球光學(xué)體積真值(1%的直徑變異系數(shù)對(duì)應(yīng)于3%光學(xué)體積變異系數(shù)), 結(jié)果如表3 所示. 表中±7.98 fL 表示聚苯乙烯微球3%的光學(xué)體積變異系數(shù), 人工聚焦方法測(cè)得微球OV= 281.7 fL, 以5.90%比率高于微球真值OV= 266.0 fL, 而數(shù)字重聚焦方法測(cè)得微球光學(xué)體積為OV= 266.6 fL,僅以0.22%比例高于微球光學(xué)體積真值, 說(shuō)明根據(jù)數(shù)字重聚焦方法所得焦平面更具可靠性, 將其認(rèn)定為理論最佳焦平面, 此時(shí)人工聚焦方法所得z=0 處距離理論最佳焦平面距離為2.46 μm, 側(cè)面反映了即使在2.46 μm 的輕微散焦距離下, 所測(cè)得光學(xué)體積結(jié)果仍會(huì)產(chǎn)生明顯誤差. 為研究散焦距離變化對(duì)微球光學(xué)體積測(cè)量結(jié)果的影響, 通過(guò)移動(dòng)控制臺(tái)改變微球散焦距離, 實(shí)時(shí)測(cè)量對(duì)應(yīng)微球的光學(xué)體積, 對(duì)比最佳焦平面處測(cè)得微球的光學(xué)體積, 可以得到, 即散焦距離每改變1 μm,其光學(xué)體積測(cè)量結(jié)果相差2.2%, 當(dāng)散焦距離達(dá)到± 10 μm 時(shí), 會(huì)出現(xiàn)相位包裹偽影進(jìn)一步降低測(cè)量精度, 而根據(jù)數(shù)字重聚焦方法可以解決散焦的問(wèn)題, 進(jìn)一步證明了該方法在待測(cè)樣本光學(xué)體積測(cè)量時(shí)的高精度優(yōu)勢(shì).

表3 人工聚焦方法與數(shù)字重聚焦方法測(cè)得微球光學(xué)體積對(duì)比[53]Table 3. Comparison of OV measured by manually-focused and digitally-refocused methods[53].

為顯示生物樣品中光學(xué)體積測(cè)量中散焦的影響, 選取單一RBC 作為測(cè)試樣品, 在約200 μm 范圍人工選取7 個(gè)不同焦平面, 分別對(duì)RBC 進(jìn)行重建得到相對(duì)應(yīng)的振幅圖與相位圖, 如圖10(a)中首行與中間行(A—G)所示.

圖10 對(duì)單一RBC 圖像進(jìn)行數(shù)字重聚焦與相應(yīng)的RBC 光學(xué)體積測(cè)量 (a)通過(guò)人工聚焦方法與數(shù)字重聚焦方法對(duì)單一RBC 重建所得振幅圖與相位圖; (b)A—G 的振幅方差分布; (c)RBC 在人工聚焦方法所得光學(xué)體積(黑線)與數(shù)字重聚焦方法所得光學(xué)體積(藍(lán)線), 光學(xué)體積OV 表示為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差[53]Fig. 10. Digital refocusing of a single red blood cell image and corresponding optical volume measurements. (a) The amplitude and phase images by the manually-focused method and digitally-refocused method from a single RBC; (b) amplitude variance metric of holograms A-G; (c) computed OV of RBC from manually-focused phase images(black) and digitally-refocused phase images(blue).OV reported as mean ± standard deviation[53].

其中, D 圖表示重建微球視覺(jué)質(zhì)量最佳時(shí)所得微球的振幅圖與相位圖, D 圖的焦平面位置即為定性指標(biāo)中最佳焦平面位置, 分別計(jì)算A—G 對(duì)應(yīng)的振幅方差最小值可得到7 個(gè)焦平面相對(duì)定量指標(biāo)中理論最佳焦平面位置(z=0 )各自的散焦距離,如圖10(b)所示, 人工聚焦方法所得重建RBC 圖像A—G 的光學(xué)體積計(jì)算結(jié)果如圖10(c)中黑色線所示, 隨著散焦距離的變化, RBC 在OV=5.15—7.03 fL (σ=13.55% )范圍內(nèi)波動(dòng), 散焦距離較大影響了RBC 體積測(cè)量數(shù)值的可靠性; 而通過(guò)數(shù)字重聚焦方法獲取振幅方差最小值以得到理論最佳焦平面位置, 重建所得RBC 相位圖如圖10(a)末行所示, 通過(guò)數(shù)字重聚焦方法所得A—G 的相位圖相似, RBC 的光學(xué)體積僅在OV= 5.54—5.70 fL(σ=0.99% )范圍內(nèi)波動(dòng), 進(jìn)一步證明數(shù)字重聚焦方法對(duì)光學(xué)體積測(cè)量的實(shí)用性與可靠性. 綜上所述, 根據(jù)數(shù)字全息顯微成像方法表征微觀物體三維體積時(shí), 重建圖像的散焦現(xiàn)象是潛在的重要誤差來(lái)源, 提出的數(shù)字重聚焦方法能夠以定量指標(biāo)評(píng)估焦平面, 對(duì)重建RBC 進(jìn)行光學(xué)體積測(cè)量, 實(shí)時(shí)獲得準(zhǔn)確RBC 的三維體積, 可廣泛應(yīng)用于人體的心血管疾病與糖尿病的病理研究之中.

3.5 光鑷輔助離軸數(shù)字全息系統(tǒng)

帕金森氏疾病(PD)作為一種中腦區(qū)神經(jīng)元丟失的神經(jīng)退行性疾病, 隨著PD 發(fā)病機(jī)理研究的不斷深入, 在各種病理假設(shè)之中, 氧化應(yīng)激是引起細(xì)胞功能障礙與細(xì)胞凋亡的主要因素[43,44]. 在隨后的研究中, 證實(shí)了PD 中氧化應(yīng)激的存在, 根據(jù)以往研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激還會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞變形[71], 因此,研究氧化應(yīng)激下細(xì)胞的機(jī)械性能對(duì)PD 的研究具有重要意義. 基于此, 祝連慶等[72]設(shè)計(jì)了一套光鑷輔助離軸數(shù)字全息顯微系統(tǒng), 用于研究氧化應(yīng)激下RBC 的高度與三維體積變化, 有助于帕金森氏疾病的深入研究. 其光學(xué)系統(tǒng)的分析與實(shí)現(xiàn)可通過(guò)圖11 所述結(jié)構(gòu)進(jìn)行描述, 引入含有鏈霉親和素涂層的聚苯乙烯微球(直徑4 μm)以2∶1 的濃度比與人類(lèi)RBC 樣本進(jìn)行混合至磷酸鹽緩沖溶液之中(PBS, pH = 7.4), 篩選出RBC 水平兩側(cè)分別連結(jié)一個(gè)微球的樣品作為實(shí)驗(yàn)待測(cè)對(duì)象, 如圖11中待測(cè)樣本放大圖所示. 具有統(tǒng)一參數(shù)的水平兩側(cè)微球通過(guò)光鑷控制一側(cè)微球靜止, 另一側(cè)恒定慢速移動(dòng)以實(shí)現(xiàn)RBC 的拉伸, 考慮到RBC 的尺寸并非絕對(duì)均勻, 因此, 從滿足實(shí)驗(yàn)條件細(xì)胞中隨機(jī)選取10 個(gè)RBC 取計(jì)算結(jié)果平均值, 通過(guò)如圖11 所示光學(xué)系統(tǒng)進(jìn)行全息圖的記錄, 光學(xué)系統(tǒng)由離軸數(shù)字全息顯微系統(tǒng)與光鑷組成, 632.8 nm激光器發(fā)射紅光通過(guò)分束器(BS1)分為物光與參考光, 物光通過(guò)油浸物鏡MO(60× /1.40NA)放大后與參考光于CMOS 像感器記錄面上發(fā)生相干疊加, 形成干涉全息圖, 參考光的反射角度通過(guò)反射鏡的傾斜度調(diào)整, 用于控制干涉條紋的方向與寬度, 1064 nm激光器(5 W, Nd: YAG)作為光鑷的照明光源, 發(fā)射紅外光通過(guò)二向色鏡(DM)進(jìn)入倒置顯微鏡的后孔形成光鑷, 其中聲光偏轉(zhuǎn)器(AOD)通過(guò)聲光的相互作用, 改變激光角度從而控制RBC 水平兩側(cè)微球的位置以實(shí)現(xiàn)拉伸.

利用離軸全息重建算法對(duì)CMOS 像感器所記錄的全息圖進(jìn)行重建, 并通過(guò)重建相位圖像的參數(shù)計(jì)算不同氧化應(yīng)激濃度下RBC 的高度與三維體積, 公式如下:

圖11 光鑷輔助離軸數(shù)字全息顯微系統(tǒng)測(cè)量RBC 體積[72]Fig. 11. Off-axis digital holographic microscopy system with optical tweezer for measuring RBCs’ three-dimensional volume[72].

其中,λ代表全息顯微系統(tǒng)中的激光波長(zhǎng)(632.8 nm),φ代表相位值, RBC 的折射率ncell=1.37 ,溶液的折射率nmedium=1.34,V表示RBC 的體積,h(xi,yj)表示RBC 上任意點(diǎn)的 (xi,yj)的高度,M和N表示RBC 的橫向坐標(biāo)范圍.將過(guò)氧化氫(H2O2)溶液(0.1 mol/L)在PBS中稀釋至50、100、150 和200 μmol/L 對(duì)照組, 置于5 個(gè)培養(yǎng)皿中, 與符合實(shí)驗(yàn)條件附著有微球的RBC 樣品進(jìn)行混合. 為具體分析陷阱的拉伸力與細(xì)胞變形之間的關(guān)系, 需對(duì)光阱剛度值進(jìn)行校準(zhǔn),校準(zhǔn)分為已知力校準(zhǔn)方法和熱漲落方法[73,74]. 熱漲落是系統(tǒng)在平衡狀態(tài)下相對(duì)于其平均狀態(tài)的隨機(jī)偏差, 是系統(tǒng)溫度的基本體現(xiàn), 根據(jù)Boltzmann 統(tǒng)計(jì)分析熱噪聲下隨機(jī)運(yùn)動(dòng)粒子的布朗軌跡, 可以獲得粒子位移概率分布圖, 接著通過(guò)計(jì)算粒子的電勢(shì)獲得光阱剛度k, 該值被校準(zhǔn)為14.23 ± 0.46 pN/μm.校準(zhǔn)后保持激光功率不變以確保光阱強(qiáng)度均勻. 光阱拉伸力F由光阱剛度k和微球與陷阱之間中心差 ?x共同確定, 控制陷阱拉伸力在0~3 pN 之間變化. 將RBC 所能達(dá)到的最大高度值定義為H,同時(shí)為了清楚觀察H的變化, 在圖12 中分別顯示了H大于2 μm 的高度部分, 隨著氧化應(yīng)激濃度的增大, RBC 的細(xì)胞膜出現(xiàn)粗糙度且其邊緣呈現(xiàn)鋸齒狀. 分別計(jì)算五項(xiàng)氧化應(yīng)激濃度下測(cè)量所得10 個(gè)RBC 的最大高度與三維體積的平均值, 能夠更直觀比較RBC 在不同濃度氧化應(yīng)激下高度與三維體積的變化, 繪制的相關(guān)折線圖如圖13 所示,H/H0表示拉伸過(guò)程中細(xì)胞的最大高度H與未拉伸前RBC 的原始高度H0的比值, 圖13(a)表示0—200 μmol/L 氧化應(yīng)激濃度下RBC 高度比H/H0與陷阱拉伸力的關(guān)系, 反映了RBC 的微形變機(jī)械性能, 由圖可知, 隨著氧化應(yīng)激濃度的增加,RBC 的變形能力下降, 因此氧化應(yīng)激下的RBC 其機(jī)械性能會(huì)受到嚴(yán)重影響. 圖13(b)表示0—200 μmol/L 氧化應(yīng)激濃度下RBC 三維體積的變化, 由圖可知, 對(duì)比不加入H2O2的常規(guī)PBS 中的RBC, 氧化應(yīng)激使RBC 的體積減小, 在50—200 μmol/L 的H2O2濃度下, RBC 的體積變?yōu)槌跏俭w積的90%—87.3%, 該結(jié)果與過(guò)往研究相一致[75]. 綜上所述, 在氧化應(yīng)激下RBC 的機(jī)械性能會(huì)發(fā)生變化, 微形變能力下降, 而氧化應(yīng)激是導(dǎo)致PD 的主要因素, 該光鑷輔助離軸數(shù)字全息顯微成像的技術(shù)將助于PD 的基礎(chǔ)研究與臨床應(yīng)用.

圖12 0?3 pN 陷阱拉伸力變化下不同濃度(0?200 μmol/L)氧化應(yīng)激下重建RBC 的高度變化, 顏色深淺代表RBC 高度的大小[72]Fig. 12. Height change of reconstructed RBCs under different concentrations of oxidative stress (0?200 μmol/L). Four images in each group are corresponding to trap force varying from 0?3 pN. Color bar represents different thickness[72].

圖13 RBC 在不同濃度氧化應(yīng)激下的性能 (a)不同濃度氧化應(yīng)激下RBC 最大高度H 與陷阱拉伸力關(guān)系; (b)不同濃度氧化應(yīng)激下RBC 體積[72]Fig. 13. Performance of RBC under different oxidative stress. (a) The relationship between the maximum height H of RBC and the trap tensile force under different oxidative stress; (b) the volume of RBC under different oxidative stress[72].

4 結(jié)論與展望

本文簡(jiǎn)要介紹了數(shù)字全息顯微成像由全息圖記錄到全息圖重建的原理, 分析討論了不同數(shù)字全息顯微系統(tǒng)在RBC 成像的應(yīng)用, 在數(shù)字全息顯微系統(tǒng)方面, 主要分為同軸、離軸、光鑷輔助離軸的數(shù)字顯微全息成像系統(tǒng). 同軸數(shù)字全息顯微成像系統(tǒng)光路簡(jiǎn)單, 可采用激光作為光源, 但其對(duì)光源的相干性以及系統(tǒng)的穩(wěn)定性要求相對(duì)離軸數(shù)字全息顯微成像系統(tǒng)較低, 可通過(guò)弱相干光源(如LED)代替激光作為光源, 采用弱相干光源避免了激光產(chǎn)生的散斑噪聲, 可以得到較好的生物細(xì)胞圖像, 降低成本, 裝置結(jié)構(gòu)輕便, 便于集成. 離軸數(shù)字全息顯微成像系統(tǒng)引入?yún)⒖脊夤饴? 通過(guò)改變參考光入射角度, 實(shí)現(xiàn)重建像與孿生像的分離. 光鑷輔助離軸的數(shù)字全息系統(tǒng)中, 光鑷作為輔助檢測(cè)的手段,可給予活體細(xì)胞不同拉伸力使之產(chǎn)生形變, 并根據(jù)離軸數(shù)字全息系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時(shí)成像, 進(jìn)而對(duì)活體細(xì)胞的性能進(jìn)行更深一步的研究. 在不同的實(shí)驗(yàn)要求下, 可根據(jù)具體需求選擇合適的全息顯微成像系統(tǒng)以實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?

在細(xì)胞三維信息提取的過(guò)程中, 數(shù)字重聚焦方法選擇圖像在不同距離下振幅方差最小值作為定量指標(biāo)代替圖像視覺(jué)質(zhì)量判斷的定性指標(biāo), 以評(píng)估RBC 的焦平面位置, 減少由于散焦造成的三維體積測(cè)量誤差. 或根據(jù)圖像清晰度量化算法也可以實(shí)現(xiàn)RBC 焦平面評(píng)估, 確定重建距離, 通過(guò)重建圖像信息進(jìn)一步獲取RBC 表面積、相位值, 并根據(jù)入射光波長(zhǎng)、折射率等參數(shù)信息計(jì)算RBC 高度與三維體積, 也可通過(guò)反向重建放大物光復(fù)振幅的實(shí)部信息來(lái)判斷RBC 幾何形狀的變化; 對(duì)于多個(gè)RBC 的情況, 引入分水嶺分割算法對(duì)重建RBC 相位圖像進(jìn)行分割, 單獨(dú)提取每一個(gè)RBC 后, 再通過(guò)上述算法分別計(jì)算每個(gè)RBC 的高度與三維體積并取對(duì)應(yīng)平均值獲得RBC 整體三維信息. 更進(jìn)一步地, 通過(guò)光鑷控制RBC 拉伸產(chǎn)生微形變, 根據(jù)細(xì)胞的三維信息探究RBC 在不同濃度氧化應(yīng)激下的形變能力.

通過(guò)數(shù)字全息顯微成像技術(shù)有效實(shí)現(xiàn)細(xì)胞三維體積的測(cè)量, 并且可以檢測(cè)出細(xì)胞幾何形狀的微小形變, 對(duì)比于當(dāng)前顯微成像領(lǐng)域廣泛運(yùn)用的激光掃描共聚焦顯微技術(shù), 近場(chǎng)光學(xué)顯微技術(shù), 光學(xué)相干層析成像技術(shù), 其非接觸、無(wú)損性、定量化、實(shí)時(shí)性的優(yōu)勢(shì)更有利于細(xì)胞生物學(xué)參數(shù)與細(xì)胞性能的研究. 未來(lái)數(shù)字全息顯微成像技術(shù)有兩個(gè)大方向可以進(jìn)行持續(xù)探索, 一方面可進(jìn)一步發(fā)揮先進(jìn)光學(xué)器件優(yōu)勢(shì), 在硬件上實(shí)現(xiàn)分辨率的提升, 并設(shè)計(jì)更優(yōu)化的重建算法, 通過(guò)更少的數(shù)據(jù)量與更精確的焦平面評(píng)估來(lái)實(shí)現(xiàn)更高分辨率, 更高精度的細(xì)胞成像;另一方面由于系統(tǒng)的分辨率受限于顯微物鏡數(shù)值孔徑, 可采用合理的數(shù)字全息無(wú)透鏡成像方法, 待測(cè)細(xì)胞與像感器之間不存在光學(xué)透鏡, 因此可避免透鏡表面灰塵造成的雜散光影響, 且簡(jiǎn)化了成像的光路, 具有更大的成像視野, 同時(shí)滿足細(xì)胞顯微成像的大視場(chǎng)與高分辨率需求, 便于細(xì)胞成像研究方面的集成化運(yùn)用. 同時(shí), 基于深度學(xué)習(xí)的圖像重建算法的發(fā)展, 可根據(jù)增加像素?cái)?shù)的方式在傳統(tǒng)方法的基礎(chǔ)上進(jìn)一步提升細(xì)胞成像的分辨率, 提高成像質(zhì)量.