林丹櫻 牛敬敬 劉雄波 張瀟 張嬌 于斌 屈軍樂

(深圳大學(xué)物理與光電工程學(xué)院, 光電子器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 深圳 518060)

1 引 言

隨著熒光標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展, 熒光顯微成像技術(shù)已成為生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域不可或缺的工具之一. 熒光壽命作為熒光的一個(gè)重要參量, 反映了熒光分子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)的退激發(fā)速率, 是熒光分子的固有特性, 其變化能非常靈敏地反映熒光分子所處微環(huán)境(如細(xì)胞微環(huán)境中的溫度、黏度、pH 值、離子濃度等)的變化情況[1]. 同時(shí)由于熒光壽命的測(cè)量可不受熒光探針濃度、激發(fā)光強(qiáng)度、光漂白等因素的影響, 相比強(qiáng)度測(cè)量更有利于實(shí)現(xiàn)定量化, 因此探測(cè)樣品中熒光壽命的分布和變化的熒光壽命顯微成像技術(shù)(fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM)常常被應(yīng)用于定量測(cè)量細(xì)胞內(nèi)的一些生物物理和生物化學(xué)參數(shù)[2,3], 或氣溶膠的黏度測(cè)量等[4]. 另一方面, 許多熒光團(tuán)分子具有相似的熒光光譜, 假如利用它們對(duì)樣品中不同的結(jié)構(gòu)進(jìn)行特異性標(biāo)記, 直接從光譜上很難分離, 但利用它們熒光壽命不同的特點(diǎn), 可借助FLIM 技術(shù)對(duì)其熒光進(jìn)行區(qū)分, 從而實(shí)現(xiàn)多結(jié)構(gòu)的同時(shí)標(biāo)記和成像. 這些特點(diǎn)使得FLIM 在生命科學(xué)研究中有著越來(lái)越廣泛的應(yīng)用.

一般而言, FLIM 中熒光壽命的測(cè)量方法有時(shí)域法與頻域法兩類, 其中頻域法使用周期調(diào)制的連續(xù)光激發(fā)樣品, 檢測(cè)熒光信號(hào)相對(duì)激發(fā)光的振幅和相位變化來(lái)計(jì)算樣品的熒光壽命; 時(shí)域法采用高重復(fù)頻率的飛秒脈沖激光激發(fā)樣品, 利用門控技術(shù)、掃描相機(jī)技術(shù)、時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)(timecorrelated single photon counting, TCSPC)技術(shù)等記錄脈沖過(guò)后熒光信號(hào)的衰減過(guò)程并擬合或計(jì)算熒光壽命. 因此, 不管對(duì)于哪種類型的FLIM, 熒光壽命數(shù)據(jù)的處理都是非常關(guān)鍵的一環(huán). 例如, 時(shí)域法熒光壽命數(shù)據(jù)最常用的處理方法是非線性最小二乘(nonlinear least-squares, NL-LS)擬合法,即選擇一種衰減模型(單指數(shù)、雙指數(shù)或多指數(shù)衰減)對(duì)每個(gè)像素點(diǎn)的測(cè)量數(shù)據(jù)進(jìn)行曲線擬合, 然后分析出各衰減組分的熒光壽命值. 但是這種方法要求衰減模型的選擇要合適, 同時(shí)要求每個(gè)像素點(diǎn)要采集足夠多的光子數(shù)(通常 >1000)才能夠進(jìn)行有效擬合[5]. 這就使得基于這種數(shù)據(jù)處理方法的FLIM 技術(shù)在應(yīng)用上受到了相應(yīng)的限制. 例如,TCSPC-FLIM 通常需要在激發(fā)光較弱的情況下進(jìn)行成像, 以避免相鄰兩個(gè)脈沖之間檢測(cè)到的光子數(shù)多于1 而導(dǎo)致的光子堆積問(wèn)題, 因此要求每個(gè)像素點(diǎn)采集足夠多的光子數(shù)就需要延長(zhǎng)采集時(shí)間, 由此帶來(lái)的問(wèn)題就是獲得一幅熒光壽命圖像的時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng), 成像速度受限, 無(wú)法應(yīng)用于一些熒光壽命變化速度較快的場(chǎng)合.

因此, 針對(duì)這些問(wèn)題, 研究者們開發(fā)出了其他的算法, 例如相量分析(phasor analysis, PA)[6]、極大 似 然 估 計(jì) (maximum likelihood estimate,MLE)[7]、一階矩(the first moment, M1)[8]、貝葉斯 分 析(Bayesian analysis, BA)[9]、壓 縮 感 知(compressed sensing, CS)[10]等, 這些方法可通過(guò)降低壽命分析對(duì)光子數(shù)的要求從而間接地提高FLIM 技術(shù)的成像速度[11]. 其中, PA 法通過(guò)將時(shí)域信息變換到頻域, 可直接計(jì)算得到熒光壽命值,簡(jiǎn)單快速, 無(wú)需擬合, 且在低光子數(shù)情況下也能得到比較準(zhǔn)確的壽命值, 適合于快速FLIM 成像. 另一方面, PA 法生成的相量圖能將具有相似熒光衰減特性的熒光團(tuán)分子所對(duì)應(yīng)的像素點(diǎn)顯示在相鄰區(qū)域, 形成一定的簇狀分布, 這種特點(diǎn)使得利用該方法可以更方便地對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化和聚類分析,因此結(jié)合PA 法的FLIM 技術(shù)(phasor-FLIM)越來(lái)越受到科研人員的青睞, 在生命科學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用越來(lái)越廣泛.

本文首先詳細(xì)闡述phasor-FLIM 的基本原理及使用方法, 并在此基礎(chǔ)上介紹該技術(shù)應(yīng)用于細(xì)胞代謝狀態(tài)測(cè)量、蛋白質(zhì)相互作用研究、細(xì)胞微環(huán)境測(cè)量以及輔助病理診斷和提高超分辨成像分辨率等方面的最新研究進(jìn)展, 最后對(duì)其發(fā)展前景進(jìn)行展望.

2 Phasor-FLIM 的基本原理

如前所述, FLIM 技術(shù)中熒光壽命的測(cè)量通常分為頻域法和時(shí)域法[1,6]. 這兩種方法在數(shù)學(xué)意義上互為傅里葉變換, 但它們獲取熒光壽命信息的方式不同, 得到的數(shù)據(jù)內(nèi)容和形式不同, 從而數(shù)據(jù)處理方法一般也不同. 頻域法一般使用正弦調(diào)制的連續(xù)光激發(fā)樣品, 測(cè)量得到的是具有相同頻率的熒光信號(hào), 但由于熒光壽命的影響, 熒光信號(hào)的振幅和相位相比激發(fā)光均發(fā)生了變化, 因此通過(guò)計(jì)算熒光信號(hào)相對(duì)激發(fā)光的振幅調(diào)制度變化和相位延遲可計(jì)算得到熒光壽命. 而時(shí)域法則需要采用高重復(fù)頻率的飛秒脈沖激光激發(fā)樣品, 利用前面提到的門控技術(shù)、掃描相機(jī)或TCSPC 技術(shù)等直接或間接記錄脈沖過(guò)后的熒光衰減過(guò)程, 得到的是熒光強(qiáng)度(或光子數(shù))隨時(shí)間的變化關(guān)系, 因此一般可通過(guò)曲線擬合得到熒光壽命.

PA 法最先被用于處理頻域FLIM 技術(shù)得到的熒光壽命數(shù)據(jù), 其相量由頻域FLIM 測(cè)量得到的解調(diào)系數(shù)和相位延遲來(lái)構(gòu)建, 是原始數(shù)據(jù)的直接表達(dá)[12]. PA 法同樣適用于時(shí)域FLIM 數(shù)據(jù)的分析,但需要先將時(shí)域的熒光衰減變換到頻域. 由于時(shí)域FLIM 中的TCSPC-FLIM 目前應(yīng)用最為廣泛,因此PA 法在該技術(shù)中的應(yīng)用也是報(bào)道得最多的.以下分別介紹這兩類技術(shù)中PA 法分析熒光壽命的基本原理, 并結(jié)合熒光相量圖的特點(diǎn)闡述其典型的應(yīng)用思路.

2.1 頻域法FLIM 及其相量分析

在頻域FLIM 中, 激發(fā)光常采用正弦調(diào)制的連續(xù)光源, 如激光、氙燈、LED 燈等, 激發(fā)光強(qiáng)可描述為

其中E(0)和E(t)分別為起始時(shí)刻和t時(shí)刻的激發(fā)光強(qiáng)度,ME=a/A為激發(fā)光的強(qiáng)度調(diào)制度(a和A分別是激發(fā)光的振幅和平均強(qiáng)度, 如圖1(a)所示),w為調(diào)制的角頻率. 利用該激發(fā)光激發(fā)標(biāo)記有熒光團(tuán)的樣品后, 所檢測(cè)到的熒光也是正弦調(diào)制的, 且其頻率與激發(fā)光相同, 但強(qiáng)度調(diào)制度會(huì)降低,相位也有一定延遲. 如果熒光衰減符合單指數(shù)衰減規(guī)律, 則熒光光強(qiáng)可描述為

圖1 熒光壽命的測(cè)量方法及相量分析(PA)法示意圖 (a)頻域法測(cè)量原理示意圖; (b)單指數(shù)衰減的壽命相量示例圖; (c)雙指數(shù)衰減的壽命相量示例圖; (d)時(shí)間相關(guān)單光子計(jì)數(shù)(TCSPC)測(cè)量原理示意圖Fig. 1. Schematic diagram of fluorescence lifetime measurement and phasor analysis (PA): (a) Frequency domain method; (b) lifetime phasor of single-exponential decay; (c) lifetime phasor of bi-exponential decay; (d) time-correlated single photon counting (TCSPC) method.

相應(yīng)地,I(0)和I(t)分別為起始時(shí)刻和t時(shí)刻的熒光強(qiáng)度,MF=b/B為熒光的強(qiáng)度調(diào)制度(b和B分別是熒光的振幅和平均強(qiáng)度, 如圖1(a)所示),f為相位延遲或相移. 通過(guò)測(cè)量相移f和解調(diào)系數(shù)M=MF/ME, 即可計(jì)算出相應(yīng)的熒光壽命, 即:

可以證明[12,13], 當(dāng)熒光的衰減過(guò)程符合單指數(shù)衰減規(guī)律(即I(t) =I(0)e–t/t,t為壽命)時(shí), (3)式和(4)式算得的壽命tf和tm是相等的, 理論上只需要計(jì)算其中一個(gè)即可. 但假如熒光的衰減過(guò)程是兩個(gè)或多個(gè)單指數(shù)衰減過(guò)程的組合(即雙指數(shù)衰減或多指數(shù)衰減), 則情況更加復(fù)雜, 通常需要先在不同調(diào)制頻率wi下重復(fù)測(cè)量多組fi和Mi, 并通過(guò)以下公式先計(jì)算出等效相移和解調(diào)系數(shù)再求解壽命, 即:

其中fi為第i個(gè)調(diào)制頻率測(cè)得的光強(qiáng)占總光強(qiáng)的比例.

1984 年, Jameson 等[13]利用相量的概念對(duì)頻域法FLIM 得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行幾何表示, 他們利用單個(gè)像素點(diǎn)對(duì)應(yīng)的解調(diào)系數(shù)M和相移f來(lái)構(gòu)建一個(gè)相量, 即以M作為該相量的模, 以f作為該相量的輻角, 則可以認(rèn)為相量與像素點(diǎn)是一一對(duì)應(yīng)的, 相量圖上一個(gè)相量的端點(diǎn)就代表了一個(gè)像素點(diǎn)的全部熒光壽命信息(如圖1(b)所示). 該相量在實(shí)軸和虛軸的分量可用Weber 符號(hào)表示[14], 即:

對(duì)于單指數(shù)衰減情形, 由(3)式和(4)式可得到cosf=M, 因此可以得到:

即以坐標(biāo)(G,S)表示的相量端點(diǎn)被約束在圓心位于(0.5, 0)處、半徑為0.5 的半圓上. 半圓上的每個(gè)點(diǎn)表示不同的壽命, 壽命值從左到右遞減, 其中(1, 0)表示接近零的壽命, (0, 0)表示無(wú)限長(zhǎng)的壽命, 如圖1(b)所示.

幾何意義上, 多指數(shù)衰減過(guò)程對(duì)應(yīng)的相量端點(diǎn)應(yīng)位于其各個(gè)單指數(shù)衰減組分對(duì)應(yīng)的壽命相量端點(diǎn)連接組成的集合內(nèi). 如圖1(c)中, 雙指數(shù)衰減過(guò)程對(duì)應(yīng)的壽命相量端點(diǎn)(藍(lán)色)落在半圓以內(nèi), 位于兩個(gè)單指數(shù)衰減組分對(duì)應(yīng)的壽命相量端點(diǎn)(綠色)的連線上, 且與兩端點(diǎn)的距離(p1,p2)由兩個(gè)組分的占比(a1,a2)決定.

2.2 時(shí)域法FLIM 及其相量分析

PA 法同樣適用于時(shí)域法FLIM 數(shù)據(jù)的分析.這里以目前應(yīng)用最廣泛的TCSPC-FLIM 技術(shù)為例. 如圖1(d)所示, TCSPC 將每一次脈沖信號(hào)作為一個(gè)信號(hào)周期, 每個(gè)周期內(nèi)當(dāng)探測(cè)到第一個(gè)熒光光子時(shí)就在其到達(dá)時(shí)間對(duì)應(yīng)的時(shí)間通道中進(jìn)行計(jì)數(shù), 經(jīng)過(guò)多次累積即可建立一個(gè)反映熒光衰減過(guò)程的光子數(shù)-時(shí)間分布直方圖, 用于求解熒光壽命.

2008 年, Digman 等[16]將Weber[14]于1981年提出的熒光脈沖響應(yīng)的傅里葉分析方法用于TCSPC 技術(shù), 并使用以下關(guān)系式計(jì)算相量端點(diǎn)坐標(biāo), 也可以將每個(gè)像素的全部熒光衰減信息轉(zhuǎn)換為相量圖上的單個(gè)點(diǎn), 即:

其中G(w)和S(w)分別是熒光脈沖響應(yīng)傅里葉頻譜的實(shí)部和虛部, 這里用作壽命相量的兩個(gè)分量;I(t)是脈沖過(guò)后t時(shí)刻的熒光光強(qiáng),w是脈沖激光的角頻率,T是周期長(zhǎng)度(實(shí)際可取動(dòng)態(tài)范圍),n是諧波的階次, 一般情況下取基頻分量, 即n=1. 因?yàn)門CSPC 是在N個(gè)離散的時(shí)間通道tk中記錄熒光衰減分布直方圖的, 因此上述積分運(yùn)算可轉(zhuǎn)化為求和計(jì)算:

其中Ck是第k個(gè)時(shí)間通道記錄的光子數(shù),是所有時(shí)間通道記錄的總光子數(shù).

如果熒光脈沖響應(yīng)呈單指數(shù)衰減規(guī)律, 則代入(11)式可得G(w)和S(w)與熒光壽命t的關(guān)系為:

可以驗(yàn)證,G,S仍然滿足(8)式的關(guān)系, 即單指數(shù)衰減情形下以坐標(biāo)(G,S)表示的相量端點(diǎn)仍被約束在圓心位于(0.5, 0)處、半徑為0.5 的半圓上, 與頻域法得到的相量圖一致.

而如果熒光脈沖響應(yīng)是呈多指數(shù)衰減的, 則同樣根據(jù)線性疊加關(guān)系可知, 坐標(biāo)(G,S)表示的相量端點(diǎn)也位于半圓以內(nèi), 其中雙指數(shù)衰減過(guò)程對(duì)應(yīng)的相量端點(diǎn)也在其兩個(gè)單指數(shù)衰減組分對(duì)應(yīng)的相量端點(diǎn)連線上, 與頻域法得到的結(jié)論一致.

2.3 相量圖的特點(diǎn)及其典型應(yīng)用思路

如前所述, 對(duì)于滿足單指數(shù)衰減規(guī)律的情形,熒光壽命相量圖上以坐標(biāo)(G,S)表示的相量端點(diǎn)被約束在圓心位于(0.5, 0)處、半徑為0.5 的半圓上, 而多指數(shù)衰減過(guò)程的相量端點(diǎn)則位于半圓以內(nèi), 具體地說(shuō), 是位于各單指數(shù)衰減組分相量端點(diǎn)連接組成的集合內(nèi). 例如, 對(duì)于雙指數(shù)衰減情形,其壽命相量端點(diǎn)位于兩個(gè)單指數(shù)衰減組分相量端點(diǎn)的連線上, 且位置與兩個(gè)組分的占比有關(guān). 相量圖的這些特點(diǎn), 使得其在熒光壽命數(shù)據(jù)的定量分析、可視化和聚類分析方面有很大優(yōu)勢(shì).

如前所述, 熒光壽命反映的是熒光分子從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)的退激發(fā)速率, 因此當(dāng)處于激發(fā)態(tài)的熒光分子所處的微環(huán)境不同, 或者熒光分子與其他分子發(fā)生相互作用和能量轉(zhuǎn)移時(shí), 熒光壽命會(huì)發(fā)生靈敏的變化. 所以, 許多熒光團(tuán)存在兩個(gè)甚至兩個(gè)以上的衰減速率, 分別對(duì)應(yīng)于熒光團(tuán)的不同狀態(tài), 例如細(xì)胞內(nèi)的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH)處于自由態(tài)時(shí)(主要位于細(xì)胞質(zhì)中)的熒光壽命為幾百皮秒(t1), 與蛋白質(zhì)綁定后處于結(jié)合態(tài)時(shí)(主要位于線粒體中)的熒光壽命則達(dá)到幾納秒(t2)[6].2005 年Brid 等[17]利用干擾NADH/NAD+比例的代謝藥物氰化鉀(Potassium cyanide, KCN)阻斷細(xì)胞的呼吸作用, 證明了細(xì)胞中自由態(tài)和結(jié)合態(tài)NADH 的占比與NADH / NAD+比例有關(guān), 從而提出利用FLIM 測(cè)量自由態(tài)和結(jié)合態(tài)NADH 的比例, 來(lái)間接獲得活細(xì)胞內(nèi)的NADH/NAD+比例.NADH 與其氧化形式NAD+作為生物體內(nèi)許多氧化還原反應(yīng)的輔酶參與生命活動(dòng)并相互轉(zhuǎn)化, 它們之間的平衡反映了氧化磷酸化和糖酵解的比率, 因此NADH/NAD+比例及其變化可用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞代謝方式的變化. 對(duì)于細(xì)胞內(nèi)NADH/NAD+比例的探測(cè), 傳統(tǒng)的方法有酶循環(huán)法、毛細(xì)管電泳法、質(zhì)譜分析法等, 但這些方法只適用于對(duì)細(xì)胞提取物進(jìn)行檢測(cè). 直接對(duì)細(xì)胞內(nèi)NADH/NAD+比例進(jìn)行探測(cè)也可以采用熒光強(qiáng)度成像的方法, 這是因?yàn)镹ADH 發(fā)熒光而NAD+不發(fā)熒光. 但由于熒光團(tuán)濃度的不均一性以及自由態(tài)和結(jié)合態(tài)NADH 熒光量子產(chǎn)率的不同, 基于強(qiáng)度成像的NADH/NAD+測(cè)量結(jié)果通常存在較大誤差. Brid 等[17]的工作為定量監(jiān)測(cè)活細(xì)胞內(nèi)NADH/NAD+的比例提供了一種新的思路, 即通過(guò)FLIM 定量測(cè)量自由態(tài)和結(jié)合態(tài)NADH 的比例來(lái)間接獲得NADH/NAD+比例. 他們的研究還表明, 當(dāng)NADH/NAD+比例發(fā)生變化時(shí), 自由態(tài)和結(jié)合態(tài)NADH 的熒光壽命值(即t1和t2)幾乎保持恒定, 變化的是它們各自的占比(即a1和a2). 多指數(shù)衰減情形的壽命相量與其各個(gè)單指數(shù)衰減組分壽命相量之間的線性關(guān)系,使得采用了PA 法分析熒光壽命的phasor-FLIM 特別適合于在已知單指數(shù)衰減組分壽命的前提下, 對(duì)多組分尤其是雙組分中不同組分的占比進(jìn)行定量分析. 所以, phasor-FLIM 的典型應(yīng)用之一, 就是根據(jù)壽命相量端點(diǎn)的位置對(duì)NADH 兩種壽命組分的占比進(jìn)行定量分析, 從而用于細(xì)胞代謝狀態(tài)的測(cè)量[18?27].

此外, 在利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)對(duì)蛋白質(zhì)相互作用進(jìn)行研究的FLIM-FRET 實(shí)驗(yàn), 以及一些利用FLIM 研究細(xì)胞微環(huán)境參量變化的場(chǎng)合, 也會(huì)涉及到雙指數(shù)衰減甚至多指數(shù)衰減及其組分占比的變化, 因此phasor-FLIM 在這些應(yīng)用中的報(bào)道近幾年也多了起來(lái)[28?34].

其次, PA 法生成的相量圖中, 具有相似熒光衰減特征的像素點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的相量端點(diǎn)會(huì)顯示在相近的位置, 因而形成一定的簇狀分布(如圖2(a)和圖2(b)所示), 稱為“相量簇”. 同一個(gè)相量簇對(duì)應(yīng)于具有相似熒光衰減特性的多個(gè)像素點(diǎn), 但這些像素點(diǎn)在樣品中的分布可以是不連續(xù)的, 和它們的空間分布并沒有直接聯(lián)系. 利用該特點(diǎn), 可在相量圖上選取感興趣的相量簇, 并通過(guò)其對(duì)應(yīng)關(guān)系找到相量簇中各相量端點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的像素點(diǎn)在樣品上的位置, 就可以方便地將樣品中具有相似熒光壽命特征的區(qū)域標(biāo)記出來(lái)(如圖2(c)所示), 還可以進(jìn)一步對(duì)這些熒光壽命特征相似的區(qū)域進(jìn)行聚類分析, 從而為研究一些生物醫(yī)學(xué)問(wèn)題帶來(lái)極大的便利[18?20].倘若對(duì)不同的相量簇對(duì)應(yīng)的像素點(diǎn)賦以不同的偽彩色, 則利用該方法還可以方便地實(shí)現(xiàn)熒光壽命圖像的多色顯示(如圖2(d)所示), 從而起到輔助病理判斷等作用[35?37]. 最近, 這種利用PA 法對(duì)熒光壽命的分布進(jìn)行聚類分析的方法還被應(yīng)用于輔助提高基于受激輻射耗盡(stimulated emission depletion, STED)的超分辨成像的分辨率[38?40].

圖2 Phasor-FLIM 的應(yīng)用思路示意圖 (a)包含未處理壽命信息的熒光強(qiáng)度圖; (b)經(jīng)PA 法分析得到的壽命相量圖; (c)對(duì)壽命相量直接進(jìn)行分析; (d)通過(guò)相量聚類分析和偽彩色標(biāo)記得到的熒光壽命圖Fig. 2. Schematic diagram of phasor-FLIM application:(a) Fluorescence intensity image with untreated lifetime information; (b) lifetime phasor plot obtained by PA analysis;(c) direct analysis of lifetime phasors; (d) phasor-mapped FLIM image based on phasor clustering analysis and pseudo-color assignment.

綜上, 目前phasor-FLIM 的應(yīng)用可以用圖3來(lái)表示. 以下將舉例說(shuō)明phasor-FLIM 的應(yīng)用研究進(jìn)展.

圖3 Phasor-FLIM 的應(yīng)用分類示意圖Fig. 3. Application classification diagram of phasor-FLIM.

3 Phasor-FLIM 的應(yīng)用研究進(jìn)展

3.1 基于NADH 的細(xì)胞代謝應(yīng)用研究

細(xì)胞的能量主要來(lái)自細(xì)胞呼吸, 正常細(xì)胞或正常分化的細(xì)胞在有氧條件下采用糖酵解進(jìn)行代謝,缺氧條件下通過(guò)氧化磷酸化進(jìn)行代謝. 而高度增殖的細(xì)胞(如癌細(xì)胞或干細(xì)胞)即使在氧氣充足的條件下也多選擇糖酵解作為主要的產(chǎn)能方式, 這種現(xiàn)象被稱為“Warburg 效應(yīng)”[41]. 而這種細(xì)胞代謝方式的不同導(dǎo)致兩者所含NADH 的濃度和狀態(tài)存在差異. 因此基于前面提到的NADH 處于兩種不同狀態(tài)具有不同熒光壽命的特性, 以NADH 作為內(nèi)源熒光標(biāo)志物的雙光子FLIM 成像常被用于研究正常細(xì)胞、干細(xì)胞、癌細(xì)胞以及其他疾病發(fā)生時(shí)細(xì)胞的代謝差異, 而結(jié)合了PA 法的phasor-FLIM可方便地實(shí)現(xiàn)活組織中單細(xì)胞代謝表型的觀測(cè), 在細(xì)胞分化和增殖、疾病的機(jī)理研究和診斷等方面均具有很好的應(yīng)用前景, 目前也取得了一些重要的應(yīng)用研究進(jìn)展.

細(xì)胞分化和增殖過(guò)程會(huì)改變糖酵解和氧化磷酸化之間的平衡, 所以代謝變化可用于研究細(xì)胞分化和增殖狀態(tài). Stringari 等[18?20]通過(guò)對(duì)細(xì)胞內(nèi)包括NADH 在內(nèi)的各種內(nèi)源性熒光標(biāo)志物進(jìn)行FLIM 成像, 并利用PA 法對(duì)FLIM 圖像進(jìn)行分割,可以區(qū)分膠原蛋白、視黃醇、視黃酸, 以及處于自由態(tài)和結(jié)合態(tài)的NADH. 他們對(duì)小腸進(jìn)行雙光子FLIM 成像并對(duì)利用PA 法得到的壽命相量簇進(jìn)行聚類分析, 用來(lái)識(shí)別高度增殖的小腸干細(xì)胞, 通過(guò)代謝狀態(tài)對(duì)小腸干細(xì)胞和分化的后代進(jìn)行分類分析, 以監(jiān)測(cè)與代謝變化相關(guān)的生理(病理)過(guò)程.Lee 等[21]對(duì)白細(xì)胞和白血病細(xì)胞進(jìn)行FLIM 成像,因?yàn)榘籽〖?xì)胞快速增殖, 糖酵解占主導(dǎo)地位, 壽命相量簇向短壽命方向移動(dòng), 利用PA 法定量分析自由態(tài)和結(jié)合態(tài)NADH 比例的變化, 可從血液中快速篩選和分離白血病細(xì)胞. 與傳統(tǒng)的生物分子診斷技術(shù)相比, 這種基于phasor-FLIM 的單細(xì)胞篩查方法對(duì)細(xì)胞友好, 具有臨床篩選血液細(xì)胞的潛力. 細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix, ECM)是所有組織必不可少的動(dòng)態(tài)組成部分, 并通過(guò)提供機(jī)械和生化信號(hào)來(lái)直接影響細(xì)胞行為. ECM 的變化可以改變組織的動(dòng)態(tài)平衡, 從而潛在地促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)化和腫瘤的發(fā)生. Romero-Lopez 等[22]將正常細(xì)胞接種在提取自正常人結(jié)腸和轉(zhuǎn)移至肝臟的結(jié)腸腫瘤的ECM 中, 利用phasor-FLIM 技術(shù)定量分析了自由態(tài)和結(jié)合態(tài)NADH 的比例, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)接種在腫瘤ECM 中的細(xì)胞比接種在正常ECM 中的細(xì)胞具有更高的游離NADH 水平, 糖酵解速率較高, 表明ECM 在癌細(xì)胞及其相關(guān)脈管系統(tǒng)的生長(zhǎng)中起到了重要作用.

圖4 Phasor-FLIM 用于分析細(xì)胞在缺氧和線粒體毒性藥物氰化鉀刺激下NADH/NAD+比例的變化, 研究代謝狀態(tài)的轉(zhuǎn)變[27]Fig. 4. Phasor-FLIM was used to analyze the change of NADH/NAD+ ratio under the stimulation of hypoxia and mitochondrial toxic drug potassium cyanide, for studying the change of metabolic state of cells[27].

由于許多疾病的發(fā)病機(jī)制與細(xì)胞代謝也有著密切的關(guān)聯(lián), phasor-FLIM 在疾病的機(jī)理研究及診斷方面也有不少應(yīng)用實(shí)例. 例如, 亨廷頓病(Huntington’s disease, HD)是一種常染色體神經(jīng)退行性疾病, 能量代謝障礙是HD 的主要發(fā)病機(jī)制. Sameni 等[23]使用phasor-FLIM 來(lái)定量測(cè)量HD 中自由態(tài)和結(jié)合態(tài)NADH 的比例變化, 作為活細(xì)胞代謝變化的間接測(cè)量, 用以研究HD 發(fā)病機(jī)制, 結(jié)果表明HD 的代謝障礙為糖酵解增加, 導(dǎo)致氧化應(yīng)激和細(xì)胞死亡. 這種定量分析的方法可用于篩選HD 組織并進(jìn)行潛在的藥物篩選, 對(duì)診斷和治療疾病具有重要意義. 阿茲海默癥(Alzheimer’s disease, AD)是一種老年人多發(fā)的神經(jīng)退行性疾病, 與抗氧化保護(hù)降低和線粒體功能障礙有關(guān).Dong 等[24,25]使用雙光子激發(fā)FLIM 技術(shù)結(jié)合PA 法定量分析了老年小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元游離NADH 的水平, 結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增加, 游離的NADH 濃度降低, 氧化磷酸化占據(jù)主導(dǎo)地位,AD 進(jìn)一步惡化, 而還原性治療可恢復(fù)老年小鼠及AD 小鼠神經(jīng)元中游離NADH 的水平. Hato 等[26]則采用類似的方法對(duì)活體小鼠腎臟進(jìn)行雙光子FLIM 成像, 使用PA 法分析腎臟中的代謝變化,提供了一種研究腎臟疾病代謝的方法. Datta 等[27]通過(guò)雙光子FLIM 對(duì)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化的心肌 細(xì) 胞(human induced pluripotent stem cellderived cardiomyocytes, hiPS-CMs)進(jìn)行成像, 檢測(cè)缺氧和線粒體毒性藥物氰化鉀病理刺激下代謝狀態(tài)的變化. 如圖4 所示, 缺氧狀態(tài)下和用藥物刺激時(shí)hiPS-CMs 的壽命相量分布向自由態(tài)NADH的方向移動(dòng), 代謝方式轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒? 這種非侵入性成像技術(shù)有助于研究心臟病的發(fā)病機(jī)理和治療方法[27].

3.2 基于FLIM-FRET 的蛋白互作研究

當(dāng)一個(gè)熒光分子(供體)的熒光發(fā)射光譜與另一個(gè)熒光分子(受體)的激發(fā)光譜相重疊, 且兩者間的距離合適(一般為6—10 nm)時(shí), 供體的激發(fā)能誘發(fā)受體發(fā)出熒光, 同時(shí)其自身的熒光強(qiáng)度發(fā)生衰減, 稱為FRET 效應(yīng). 由于該效應(yīng)發(fā)生的程度(即FRET 效率)與供體和受體的距離緊密相關(guān),該效應(yīng)常被用于研究蛋白質(zhì)間的相互作用(簡(jiǎn)稱“蛋白互作”). 具體的做法是將供體熒光分子和受體熒光分子分別標(biāo)記于兩個(gè)蛋白質(zhì)分子上, 通過(guò)測(cè)量FRET 效率來(lái)反映兩個(gè)蛋白質(zhì)之間的距離, 從而反映其是否發(fā)生相互作用以及相互作用的程度.從熒光壽命的角度看, 當(dāng)FRET 效應(yīng)發(fā)生時(shí), 由于供體將能量轉(zhuǎn)移到受體上, 供體的熒光壽命將變短. 考慮到FLIM 測(cè)量不受光漂白等因素的影響,利用FLIM 進(jìn)行FRET 效率的測(cè)量比測(cè)量熒光強(qiáng)度變化的方法要更加準(zhǔn)確, 因此FLIM-FRET 已被廣泛應(yīng)用于蛋白互作的研究. 發(fā)生和不發(fā)生FRET(或者說(shuō)FRET 效率很高和很低)兩種狀態(tài)下供體的壽命可認(rèn)為是不變的, 相當(dāng)于兩個(gè)單指數(shù)衰減組分, 因此根據(jù)PA 法的分析, 兩種狀態(tài)下得到的壽命相量應(yīng)位于半圓上. 而當(dāng)部分供體發(fā)生FRET 時(shí), 總體的熒光衰減滿足雙指數(shù)衰減規(guī)律,壽命相量端點(diǎn)將位于上述兩個(gè)單組分壽命相量端點(diǎn)的連線上, 且到兩端的距離與兩種組分的占比有關(guān), 由此可方便地計(jì)算出FERT 效率. 2012 年和2013 年, Hinde 等[28,29]利 用 phasor-FLIM 和FRET 監(jiān)測(cè)了小G 蛋白與RBD 蛋白在溶血磷脂酸(lysophosphatidic acid, LPA)刺激下相互作用的變化, 結(jié)果表明, 在熒光強(qiáng)度圖像看不出明顯差異的情況下, FLIM 圖像和PA 定量分析均顯示小G 蛋白與RBD 蛋白的標(biāo)簽蛋白EPCF 和Critine在LPA 刺激下FRET 效率顯著增加(如圖5 所示). Lou 等[30]在 共 表 達(dá)H2B-eGFP 和H2BmCherryrry兩種熒光蛋白的Hela 細(xì)胞中利用phasor-FLIM 測(cè)得的FRET 效率對(duì)核小體的緊實(shí)度進(jìn)行了量化, 用于定量反應(yīng)DNA 的損傷情況.

圖5 Phasor-FLIM 用于定量測(cè)量RhoA-kRas 單鏈生物傳感器的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)效率, 研究蛋白互作[28]Fig. 5. Phasor-FLIM was used in quantitative FRET efficiency detection of a RhoA-kRas single chain biosensor, studying interaction between proteins[28].

3.3 基于敏感探針的細(xì)胞微環(huán)境參量測(cè)量

由于熒光壽命與熒光分子所處的微環(huán)境密切相關(guān), 因此采用一些對(duì)細(xì)胞中某種微環(huán)境參量(如溫度、pH 值、離子濃度、黏度等)特別敏感的熒光探針對(duì)這些微環(huán)境參量及其變化進(jìn)行定量測(cè)量是FLIM 的常規(guī)應(yīng)用. Chen 等[31]將PA 法應(yīng)用于溫度的FLIM 測(cè)量, 通過(guò)熒光分子羅丹明B 的壽命相量圖定量分析比較了Hela 細(xì)胞在8 種不同溫度下壽命相量簇的分布變化. Battisti 等[32]采用具有pH 依賴性的熒光團(tuán)E2GFP, 利用phasor-FLIM 將所有的實(shí)驗(yàn)圖像在同一個(gè)相量圖上進(jìn)行比較, 從而分析細(xì)胞在生理狀態(tài)和非生理狀態(tài)下pH 值的變化(如圖6 所示). 深圳大學(xué)Zhou 等[33]使用phasor-FLIM 分析監(jiān)測(cè)了pH 敏感的細(xì)胞間納米藥物的釋放. 他們合成聚合物納米顆粒PAHCit/DOX, 用于阿霉素(DOX)在癌細(xì)胞中的有效釋放, 并對(duì)其釋放過(guò)程進(jìn)行了監(jiān)測(cè). 具體來(lái)說(shuō), 這種PAH-Cit/DOX 納米顆粒在生理pH 下穩(wěn)定, 但在弱酸性條件下能夠有效釋放DOX. 同時(shí), 他們采用phasor-FLIM 對(duì)該納米粒子在癌細(xì)胞中釋放DOX 的熒光壽命進(jìn)行了監(jiān)測(cè), 從而提供了一種評(píng)估納米載體藥物釋放效率的方法. Ferri 等[34]則開發(fā)了一種基于BODIPY 的黏度敏感熒光分子BoMe, 將BoMe 與phasor-FLIM 相結(jié)合用于評(píng)估早衰綜合癥(Hutchinson-Gilford progeria syndrome,HGPS)細(xì)胞內(nèi)的黏度.

3.4 輔助病理診斷

圖6 Phasor-FLIM 用于分析細(xì)胞在正常(靜止)狀態(tài)和氧化應(yīng)激狀態(tài)下pH 值的變化[32]Fig. 6. Phasor-FLIM was used to analyze the changes of pH value of cells in normal state (at rest) and under oxidative stress[32].

非黑色素瘤皮膚癌(non-melanoma skin cancers, NMSC)是白種人群體中最常見的腫瘤疾病, 光化性角病(actinic keratosis, AK)、博文病(Bowen disease, BD)、基 底 細(xì) 胞 癌(basal cell carcinoma, BCC)和浸潤(rùn)性鱗狀細(xì)胞癌(invasive squamous cell carcinoma, SCC)都是其常見的亞型. 該類型皮膚疾病的臨床癥狀很不明顯, 因而采用活組織實(shí)現(xiàn)對(duì)NMSC 的診斷比較困難, 目前臨床上主要是通過(guò)對(duì)蘇木精和伊紅(hematoxylin and eosin, H&E)染色切片的形態(tài)學(xué)特征分析來(lái)進(jìn)行診斷. 但這種方法鑒別與診斷上述不同NMSC亞型的準(zhǔn)確性通常與病理學(xué)家的專業(yè)知識(shí)、技能和經(jīng)驗(yàn)有關(guān), 可能會(huì)導(dǎo)致不同人員鑒別與診斷的結(jié)果存在巨大差異, 主觀性大, 出錯(cuò)概率較高, 影響后續(xù)治療. 2017 年, 深圳大學(xué)的Luo 等[35]對(duì)H&E 染色的皮膚病理切片進(jìn)行了雙光子FLIM 成像, 并結(jié)合PA 法定量分析了AK, BD, BCC 這三種類型的皮膚腫瘤對(duì)應(yīng)的壽命相量簇分布情況, 結(jié)果表明不同皮膚腫瘤疾病的壽命相量簇其坐標(biāo)值、角斜率、相量面積分布均存在差異, 提示phasor-FLIM 技術(shù)可為鑒別診斷這些皮膚腫瘤疾病提供一種簡(jiǎn)便可行的組織病理學(xué)分析方法, 其準(zhǔn)確性和客觀性相對(duì)于明場(chǎng)H&E 診斷將有顯著提高. 此外,他們還采用PA 法對(duì)H&E 染色的BCC 細(xì)胞切片的熒光壽命數(shù)據(jù)進(jìn)行了半定量分析[36], 并通過(guò)聚類分析對(duì)不同的相量簇賦以不同的偽彩色, 從而使FLIM 圖像上的病理學(xué)特征更加明顯, 可進(jìn)一步輔助病理診斷和促進(jìn)細(xì)胞病變及發(fā)展機(jī)理方面的深入研究(如圖7 所示).

輸尿管的阻塞會(huì)增加腎小管的壓力, 降低腎小球的濾過(guò)率, 并通過(guò)腎臟激活許多血管活性激素和細(xì)胞因子, 導(dǎo)致纖維化. 臨床上常用Picrosirius 紅或Masson Trichrome 染色的組織切片, 依靠病理學(xué)家專業(yè)的知識(shí)來(lái)診斷間質(zhì)纖維化. Ranjit 等[37]利用phasor-FLIM 研究了小鼠腎臟單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)纖維化的發(fā)展過(guò)程, 根據(jù)相量分布的平均位置、形狀、角度和數(shù)目, 區(qū)分了健康組織和病變的纖維化組織,同時(shí)可以從FLIM 圖像定量得到纖維化程度, 可用于監(jiān)測(cè)疾病發(fā)展或治療效果.

3.5 提升超分辨成像分辨率

圖7 Phasor-FLIM 聚類分析和偽彩色標(biāo)記用于增強(qiáng)H&E 染色基底細(xì)胞癌(BCC)切片病理學(xué)特征的可視化, 可輔助病理診斷[36]Fig. 7. Phasor-FLIM clustering analysis and pseudo-color assignment was used to enhance visualization of pathological features of basal cell carcinoma (BCC) sections stained with H&E, assisting pathological diagnosis[36].

圖8 Phasor-FLIM 聚類分析用于濾除受激輻射耗盡(STED)成像中環(huán)形擦除光區(qū)域的光子, 可輔助提升超分辨成像分辨率[39]Fig. 8. Phasor-FLIM cluster analysis was used to filter out the photons in the annular depletion region in stimulated radiation depletion (STED) imaging, improving the resolution of super-resolution imaging[39].

STED 技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種超分辨顯微成像技術(shù), 在“突破”分辨率極限和相關(guān)應(yīng)用方面都取得了顯著成果[42]. 該技術(shù)使用高強(qiáng)度環(huán)形擦除光使衍射極限范圍內(nèi)除中心點(diǎn)以外的熒光分子發(fā)生受激輻射而不產(chǎn)生熒光(稱為“擦除”), 從而有效減小系統(tǒng)的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)獲得超分辨率. 提高擦除光功率可進(jìn)一步提高分辨率, 但代價(jià)是增加了光漂白、光毒性和反斯托克斯發(fā)射背景, 從而降低了信噪比, 并嚴(yán)重限制了STED 技術(shù)在活細(xì)胞成像中的應(yīng)用. STED 中擦除光的作用, 是使處于激發(fā)態(tài)的粒子發(fā)生受激輻射而迅速躍遷回基態(tài), 相當(dāng)于縮短了這部分熒光分子的壽命. 因此, 受到擦除光照射的熒光分子與未受到擦除光照射的熒光分子會(huì)分布在相量圖中的不同位置, 對(duì)壽命相量進(jìn)行聚類分析, 可將兩種狀態(tài)下的熒光分子分離. 2015年, Lanzanò等[38]利用該原理, 將phasor-FLIM與STED 結(jié)合, 在較低擦除光功率的條件下通過(guò)濾除掉環(huán)形區(qū)域的光子實(shí)現(xiàn)了與較高擦除功率相當(dāng)?shù)姆直媛? 2018 年, 深圳大學(xué)的Wang 等[39]也將phasor-FLIM 應(yīng)用于STED, 通過(guò)只選擇激發(fā)光斑中心未被擦除光照射的目標(biāo)光子進(jìn)行圖像重構(gòu), 從而在不增加擦除光能量的前提下成功將 光 子 進(jìn) 行 分 離, 將 分 辨 率 從150 nm 提 升到80 nm (如圖8 所示). 類似地, Tortarolo 等[40]也利用PA 法實(shí)現(xiàn)了光子分離, 提出了pSTEDSPLIT 方法, 在不增加擦除光功率的前提下可有效提高分辨率.

4 總結(jié)與展望

FLIM 技術(shù)通過(guò)采集熒光探針分子的壽命信息進(jìn)行成像, 具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、可定量測(cè)量的優(yōu)勢(shì), 常用于探測(cè)細(xì)胞微環(huán)境參量分布、能量代謝狀態(tài), 表征材料內(nèi)部結(jié)構(gòu)及性質(zhì)等方面, 因而在生物醫(yī)學(xué)、材料學(xué)等諸多領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用. 為了從采集到的大通量壽命數(shù)據(jù)中快速精準(zhǔn)地獲取樣品內(nèi)部的結(jié)構(gòu)與功能信息, 發(fā)展一種簡(jiǎn)單快速而且實(shí)用的壽命數(shù)據(jù)分析方法在實(shí)際生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有重要的意義. 近些年興起的PA 法在頻域計(jì)算壽命, 無(wú)需擬合, 分析簡(jiǎn)便, 對(duì)科研人員的專業(yè)知識(shí)背景要求不高, 因此發(fā)展和應(yīng)用均非常迅速.相比傳統(tǒng)的NL-LS 擬合, 該方法不僅分析速度快,相同壽命精度下要求的采集光子數(shù)少, 間接縮短了數(shù)據(jù)采集時(shí)間, 有利于發(fā)展快速FLIM 成像技術(shù),而且能將具有相似衰減特征的像素點(diǎn)以“相量簇”的形式呈現(xiàn), 具有強(qiáng)大的數(shù)據(jù)可視化功能, 也便于對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析等, 因而在基于NADH 的細(xì)胞代謝狀態(tài)測(cè)量、基于FLIM-FRET 的蛋白互作研究、基于敏感探針的細(xì)胞微環(huán)境參量測(cè)量和輔助病理診斷、提升超分辨成像分辨率等方面均取得了很好的應(yīng)用研究進(jìn)展. 基于此, 本文詳細(xì)闡述了PA 法的基本原理及其運(yùn)用方法, 并在此基礎(chǔ)上介紹了運(yùn)用PA 法的phasor-FLIM 在上述幾個(gè)方面的應(yīng)用實(shí)例, 著重討論了PA 法在這些FLIM 應(yīng)用實(shí)例中的優(yōu)勢(shì)所在, 為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供有益的參考.

然而, 盡管近年來(lái)phasor-FLIM 在實(shí)際應(yīng)用中已經(jīng)取得了許多重要的研究進(jìn)展, 但與此同時(shí)還存在一些局限性. 例如, 雖然PA 處理時(shí)對(duì)采集光子數(shù)的要求要比傳統(tǒng)擬合算法低很多, 但是在快速FLIM 成像時(shí)當(dāng)采集的光子數(shù)較少或信噪比較差時(shí), 其相量簇的分布就會(huì)比較雜散, 據(jù)此分析得到的結(jié)果可靠性往往不夠高. 為了解決這一問(wèn)題,目前已有報(bào)道將中值濾波、小波變換等圖像處理方法應(yīng)用于對(duì)低信噪比的壽命數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)降噪處理,以提高熒光壽命分析的精度. 此外, 為了獲取可靠的熒光壽命計(jì)算結(jié)果, PA 法處理前通常需要利用系統(tǒng)的儀器響應(yīng)函數(shù)加以校準(zhǔn), 相比無(wú)需校準(zhǔn)的衰減曲線尾部擬合的方法要多一個(gè)步驟, 對(duì)非專業(yè)人員而言有時(shí)候不夠便利. 但是即便如此, 相信隨著生命科學(xué)對(duì)快速定量成像需求的日益增加以及PA 法的進(jìn)一步發(fā)展完善, phasor-FLIM 一定會(huì)有越來(lái)越廣泛的應(yīng)用前景, 在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越重要的作用.