楊津， 吳飛飛， 高慶紅， 李小玉， MANABU Kato， 程然， 周紅梅

1. 口腔疾病研究國家重點實驗室國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院口腔黏膜病科，四川成都（610041）； 2. 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院口腔頜面外科，四川 成都（610041）； 3.口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院，四川 成都（610041）； 4. 三重大學(xué)醫(yī)院腎內(nèi)科，日本 三重縣（514-8507）； 5.口腔疾病研究國家重點實驗室 國家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院預(yù)防科，四川 成都（610041）

癌相關(guān)成纖維細胞（carcinoma associated fibroblasts，CAFs）是腫瘤微環(huán)境中最重要的間質(zhì)細胞，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演關(guān)鍵角色［1-2］。本課題組前期研究結(jié)果顯示：與正常成纖維細胞相比，口腔CAFs 無論在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長方式、分泌特性、染色體核型還是基因型等方面均發(fā)生了顯著變化，而正是這類生物學(xué)特性異?；钴S的CAFs 促進了口腔癌的發(fā)生發(fā)展［3-5］。被募集遷移至癌巢區(qū)域是CAFs 重要的生物學(xué)特性之一［6-7］，但有關(guān)口腔CAFs 是否發(fā)生遷移，目前僅有本課題組前期在二維培養(yǎng)條件下觀察到的初步結(jié)果［8］。因二維細胞模型較難準確模擬體內(nèi)環(huán)境［9］，因此，有必要建立三維細胞模型觀察CAFs 的遷移現(xiàn)象，為進一步研究轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）對CAFs 的遷移調(diào)控機制奠定實驗基礎(chǔ)，本研究擬通過二維和三維細胞共培養(yǎng)模型探討TGF-β1 對CAFs 遷移的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和材料

倒置熒光相差顯微鏡（Olympus 公司，日本）；青鏈霉素雙抗（HyClone，美國）；10%胎牛血清（Gibco，美國）；高糖型DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國）；胰蛋白酶（HyClone，美國）；波形蛋白（vimentin）兔抗人單克隆抗體（Abcam，英國）；成纖維細胞活化蛋白（fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）兔抗人多克隆抗體（Abcam，英國）；α-平滑肌肌動蛋白（αsmooth muscle actin，α-SMA）兔抗人單克隆抗體（Abcam，英國）；細胞角蛋白（cytokeratin）兔抗人多克隆抗體（Abcam，英國）；生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒（索萊寶，中國）；polybrene（漢恒生物）。

1.2 標本收集及口腔CAFs 原代細胞分離培養(yǎng)

經(jīng)患者知情同意，選取2014～2016 年在四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院頜面外科收集的新鮮口腔鱗狀細胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）組織塊。將組織置于含有青鏈霉素雙抗的PBS 緩沖液中備用。本實驗經(jīng)四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過。用青鏈霉素雙抗和PBS 沖洗組織塊，眼科剪剪切至1～3 mm3大小，均勻地排列在瓶底，相互距離約0.5 cm。10%胎牛血清高糖型DMEM 培養(yǎng)基注入培養(yǎng)瓶底部，置于37 ℃，5%CO2孵箱中培養(yǎng)。待組織塊周圍爬出的細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底90%時，胰蛋白酶消化。傳代2 次純化CAFs。用第3 代純化細胞做鑒定。具體方法參照本課題組前期建立的組織塊法［10］。

1.3 免疫細胞化學(xué)染色鑒定

細胞成單層鋪于蓋玻片上后，用4%多聚甲醛溶液固定細胞。PBS 漂洗后，用0.1%TritonX-100 處理細胞。采用生物素-鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒進行免疫細胞化學(xué)染色。一抗包括波形蛋白（vimentin）兔抗人單克隆抗體、成纖維細胞活化蛋白（fibroblast activation protein，F(xiàn)AP）兔抗人多克隆抗體、α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）兔抗人單克隆抗體和細胞角蛋白（cytokeratin）兔抗人多克隆抗體，PBS 作為陰性對照。于倒置相差顯微鏡下觀察，將胞質(zhì)中出現(xiàn)淡棕色或棕黃色顆粒判為陽性結(jié)果。

1.4 二維培養(yǎng)：細胞劃痕實驗和Transwell 小室實驗

1.4.1 分組 未經(jīng)處理的CAFs 細胞為對照組，以培養(yǎng)基中加入10 ng/mL TGF-β1 刺激的CAFs 為實驗組。

1.4.2 細胞劃痕實驗 6 孔板中接種1 × 106個CAFs 培養(yǎng)24 h 至鋪滿，饑餓24 h 后，用10 μL 的槍尖劃線3 條、沖洗；分別加入含10 ng/mL TGF-β1 的和不含TGF-β1 的無血清高糖型DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)；分別取0 h、24 h、48 h 后觀察、采圖。

1.4.3 Transwell 小室實驗 Transwell 小室實驗中，Transwell 下室加入500 μL 含0.5%胎牛血清的培養(yǎng)基，實驗組下室中加入外源性刺激因子10 ng/mL TGF-β1；上室加入200 μL 密度為2 × 105個/mL 的CAFs 細胞混懸液。培養(yǎng)24 h 后，取出小室，沖洗，4%多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，光鏡下觀察計數(shù)。

1.5 制備綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）（+）CAFs

CAFs 細胞計數(shù)1.5×106個后培養(yǎng)24 h，換1 mL新鮮培養(yǎng)基和5 μg 的polybrene。每瓶中加入4.5× 107IU 慢病毒溶液進行轉(zhuǎn)染，慢病毒質(zhì)粒中插入GFP 片段和平陽霉素抗性基因片段。培養(yǎng)24 h 后換為含10 ng/mL 平陽霉素的新鮮培養(yǎng)基，篩選穩(wěn)定表達GFP 的細胞，同時，向空白組的CAFs 中加入同等量的平陽霉素，隔天換液培養(yǎng)。待空白組的CAFs 全部死亡后，將GFP（+）細胞培養(yǎng)液換為無平陽霉素的含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。

1.6 三維細胞共培養(yǎng)模型的建立

借助GFP（+）CAFs 對現(xiàn)有的三維細胞遷移模型進行改進，建立了腫瘤細胞和CAFs 遷移的三維細胞培養(yǎng)模型（圖1），該模型中，基質(zhì)膠上方為口腔癌細胞株SCC25，基質(zhì)膠分為上下層，上層為GFP 標記的CAFs，下層為無標記的CAFs，以方便觀察上層CAFs 向下層的遷移。

Figure 1 Establishment of a three-dimensional culture model for the migration of CAFs and squamous carcinoma cells. Created with BioRender.com圖1 建立腫瘤細胞和CAFs 遷移的三維細胞培養(yǎng)模型

三維培養(yǎng)體系基質(zhì)成分按照表1 的比例混合，放于冰上備用，制備為組織基質(zhì)。吸取CAFs 與上述配制的基質(zhì)混勻，取100 μL（細胞數(shù)5 × 105個/mL）加入96 孔板中，置于37 ℃，5% CO2孵箱孵育0.5 h，待基質(zhì)凝固，制備為下層間質(zhì)組織；GFP（+）CAFs 與基質(zhì)混勻，取100 μL（細胞數(shù)5 × 105個/mL）加入96 孔板中基質(zhì)的上層，37 ℃，5%CO2孵箱孵育0.5 h 后，制備為上層間質(zhì)組織，加入100 μL培養(yǎng)基，再培養(yǎng)24 h。在制備好的間質(zhì)組織上種植腫瘤細胞，吸取SCC25 細胞混懸液100 μL（細胞數(shù)2×105個/mL）加入96 孔板中，培養(yǎng)24 h。

表1 三維培養(yǎng)體系基質(zhì)成分Table 1 Proportion of gel components

用I型膠原浸泡尼龍膜，置于孵箱中孵育30 min后，用含1%戊二醛的PBS 固定［11］，置于4 ℃冰箱中1 h 后PBS 和培養(yǎng)基交替沖洗，浸泡于培養(yǎng)基中，4 ℃儲存?zhèn)溆茫苽淠猃埬?。取?6 孔板中已凝結(jié)成組織塊的三維細胞培養(yǎng)模型放至培養(yǎng)皿尼龍膜上，浸泡含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 周。隔天換液。實驗組的培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基中加入外源性10 ng/mL TGF-β1，對照組中不加入TGF-β1，以比較TGF-β1 對口腔癌細胞和CAFs 細胞遷移的影響。培養(yǎng)1 周后4%多聚甲醛固定24 h，脫水機中脫水，液體蠟包埋后切片。組織切片行HE 染色：將組織切片放入二甲苯中脫蠟，然后置于梯度酒精中進行水化，于蘇木素染液中染色水洗，1%鹽酸酒精分色，置于伊紅染液中染色，梯度酒精脫水，置于二甲苯中透明，中性樹膠封片。分別置于普通光學(xué)顯微鏡、熒光顯微鏡下觀察采圖。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 軟件統(tǒng)計分析，采用非參數(shù)檢驗中的K-S 檢驗方法對兩組數(shù)據(jù)進行正態(tài)性檢驗，若數(shù)據(jù)資料服從正分布，則采用studentt檢驗；若數(shù)據(jù)資料不服從正態(tài)分布，則采用秩和檢驗。P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 CAFs 的原代培養(yǎng)和鑒定

原代培養(yǎng)的CAFs 5 d 可見組織塊周圍有少量細胞爬出，細胞呈長梭形。原代培養(yǎng)的3 株細胞的細胞角蛋白表達均呈陰性，波形蛋白表達均呈陽性，說明細胞來源于間質(zhì)，而非來源于上皮。

α-SMA 和FAP 常作為鑒定CAFs 的標志蛋白，染色陽性表達（圖2），說明培養(yǎng)的細胞為CAFs［12］。

Figure 2 Immunocytochemistry staining to identify CAFs ×40圖2 CAFs 免疫細胞化學(xué)陽性結(jié)果 ×40

2.2 二維培養(yǎng)培養(yǎng)條件下口腔CAFs 的遷移

2.2.1 細胞劃痕實驗結(jié)果 在對照組中，24 h 時可觀察到細胞的遷移，48 h 細胞遷移數(shù)增多，劃痕寬度變??；在實驗組中，24 h 時細胞遷移數(shù)較對照組多，48 h 時劃痕基本愈合（圖3a）；24 h（t=3.595，P=0.023）和48 h 時（t=19.24，P＜0.001，圖3b），兩組間的平均劃痕寬度的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2.2 Transwell 小室實驗結(jié)果 Transwell 小室實驗中觀察到了CAFs 的遷移現(xiàn)象，加入外源性TGFβ1 刺激因子24 h 后，實驗組中平均細胞遷移數(shù)達到122 個，而對照組平均細胞遷移數(shù)59.33 個，實驗組明顯較對照組增多（圖3c、3d）。兩組間的平均細胞遷移數(shù)的差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=8.132，P=0.001，圖3e）。

2.3 三維細胞培養(yǎng)條件下腫瘤細胞和CAFs 遷移的觀察

用慢病毒轉(zhuǎn)染制備的GFP（+）CAFs，慢病毒轉(zhuǎn)染率達到了90%以上。借助GFP（+）CAFs 建立了腫瘤細胞和CAFs 遷移的三維細胞培養(yǎng)模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，普通光鏡下可發(fā)現(xiàn)明顯的腫瘤上皮層和細胞間質(zhì)層，腫瘤上皮細胞向間質(zhì)明顯浸潤（圖4a）；在熒光顯微鏡觀察，可發(fā)現(xiàn)圖中GFP（+）的CAFs 分布在基質(zhì)膠的全層中，即整個間質(zhì)層中可觀察到GFP 標記的CAFs，提示GFP（+）的CAFs 向下層膠中發(fā)生了遷移（圖4b）。

Figure 3 Comparison of the two-dimensional cell culture model formigration between the two groups圖3 兩組間二維細胞培養(yǎng)遷移結(jié)果的比較

Figure 4 Observation of the three-dimensional culture model for migration圖4 三維細胞共培養(yǎng)模型的遷移結(jié)果觀察

在實驗組細胞培養(yǎng)基中加入TGF-β1，HE 染色后，進行比較（圖5a），結(jié)果示實驗組平均浸潤深度/三維細胞培養(yǎng)組織全層深度的比值約0.436，對照組約0.433，兩組間腫瘤細胞平均浸潤深度比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.03，P=0.977，圖5b）；熒光成像比較GFP（+）CAFs在間質(zhì)層的遷移，發(fā)現(xiàn)GFP（+）CAFs已遷移至未標記CAFs 細胞層（圖5c），且10 ng/mL TGF-β1對CAFs細胞遷移深度也無明顯影響。

3 討 論

Figure 5 Comparison of the three-dimensional cell culture model for migration between two groups圖5 兩組間三維細胞培養(yǎng)遷移結(jié)果的比較

目前CAFs 研究大多采用二維模型，即劃痕實驗和Transwell 小室實驗［5-6，13］。二維培養(yǎng)條件較難模擬體內(nèi)環(huán)境，缺乏與腫瘤細胞、細胞間基質(zhì)的相互作用，與體內(nèi)CAFs 真實生存環(huán)境有一定差異［14］。為了能更好地模擬體內(nèi)環(huán)境，研究者們模擬出三維共培養(yǎng)模型［15-16］，Horie 等［17］通過建立上皮細胞-CAFs 三維共培養(yǎng)模型，用以研究肺癌細胞與CAFs 間的作用，在組織培養(yǎng)5 d 后，組織切片后可看到上皮細胞的浸潤。Ham 等［9］通過三維基質(zhì)-三陰性乳腺癌細胞培養(yǎng)，方便地模擬CAFs 與三陰性乳腺癌細胞的相互作用，量化其對癌細胞信號傳導(dǎo)和耐藥的影響。Bertero 等［11］應(yīng)用了由成纖維細胞誘導(dǎo)的鱗狀細胞癌細胞集體侵襲的三維模型。Nakamura 等［18］利用三維培養(yǎng)模型發(fā)現(xiàn)平足蛋白（+）CAFs 對肺腺癌腫瘤細胞的促生長作用。三維模型與Transwell 小室等其他共培養(yǎng)體系相比較，實驗結(jié)果更加直觀，且更接近真實環(huán)境［19］。課題組對現(xiàn)有的三維共細胞遷移模型進行了改進，以更直觀地觀察口腔CAFs 的遷移現(xiàn)象。三維培養(yǎng)通過腫瘤上皮層和基質(zhì)層的建立，能模擬體內(nèi)的腫瘤微環(huán)境，研究腫瘤細胞與CAFs 間的相互作用。本實驗中通過對基質(zhì)分層、上層細胞標記后，可以更加直觀地觀察到CAFs 的遷移。

TGF-β1 作為腫瘤細胞和CAFs 之間相互作用的重要細胞因子［20-21］，既可促進腫瘤的發(fā)展［22］，也可加強CAFs 的遷移能力。在TGF-β1 調(diào)控下，結(jié)腸癌CAFs 中的連接蛋白claudin-11 表達上調(diào)，可促使CAFs 集中遷移［23］。旁分泌的TGF-β1 在CAFs 誘導(dǎo)的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和乳腺癌細胞轉(zhuǎn)移中起重要作用［22］。并且TGF-β1 的相互旁分泌作用可增強CAFs 誘導(dǎo)的癌細胞侵襲［6-7］。本實驗在二維培養(yǎng)條件下，通過細胞劃痕實驗、Transwell 小室實驗觀察到了CAFs 的遷移現(xiàn)象，并證實了TGF-β1 可促進CAFs 的遷移。但三維共培養(yǎng)模型中，未發(fā)現(xiàn)TGFβ1 對腫瘤細胞和CAFs 遷移的明顯影響。二維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)需要的TGF-β1 的濃度有差異，三維共培養(yǎng)模式下梯度滲透［16］后，細胞直接接觸的TGF-β1 濃度相較于二維培養(yǎng)接觸的濃度低，不同的培養(yǎng)方式提示TGF-β1 對細胞遷移的效應(yīng)呈濃度依賴性。本實驗結(jié)果也說明二維培養(yǎng)模擬體內(nèi)具有局限性，三維培養(yǎng)更接近于真實情況，TGF-β1在真實的腫瘤微環(huán)境中對CAFs 遷移是否起到作用，還有待進一步研究。

綜上所述，使用腫瘤細胞、CAFs 以及膠原建立的三維模型能良好地模擬體內(nèi)腫瘤微環(huán)境的組成、結(jié)構(gòu)和形態(tài)，可以更好地模擬腫瘤微環(huán)境，模擬體內(nèi)環(huán)境下CAFs 的遷移。三維模型為研究腫瘤微環(huán)境中各組分的相關(guān)關(guān)系［24］，模擬細胞遷移、細胞生物力學(xué)［25］、腫瘤細胞侵襲浸潤［26］、藥物干預(yù)等［27］提供了實驗條件。