黃宣運(yùn)，孔聰，史永富，張璇，黃冬梅，蔡友瓊*

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(上海)： 上海 200090； 3.上海海洋大學(xué) 農(nóng)業(yè)部魚類營(yíng)養(yǎng)與環(huán)境生態(tài)研究中心； 4.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心： 上海 201306)

食品安全一直是社會(huì)各界廣泛關(guān)注的焦點(diǎn)[1-3]，現(xiàn)有檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)對(duì)象、檢測(cè)方法的研究對(duì)象及政府的監(jiān)管對(duì)象大多為未經(jīng)烹飪加工的肌肉組織[4-7]，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估采用的藥物殘留暴露劑量也是以未經(jīng)烹飪加工肌肉中藥物殘留的含量作為計(jì)算數(shù)據(jù)[8-10]。然而，在中國(guó)，絕大部分的水產(chǎn)品是經(jīng)過烹飪后才被食用，烹飪可導(dǎo)致肌肉蛋白變性、水分流失以及脂肪含量和pH值改變[11-12]，也可導(dǎo)致肌肉中藥物殘留含量發(fā)生變化[13-14]。因此，開展烹飪加工方式對(duì)水產(chǎn)品藥物殘留影響研究，對(duì)水產(chǎn)品藥物殘留風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和提高食品安全信心具有重要意義。

恩諾沙星(enrofloxacin，ENR)是被批準(zhǔn)允許在水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中使用的抗菌類藥物，主要用于治療水產(chǎn)動(dòng)物的細(xì)菌性疾病，被廣泛應(yīng)用在水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病防治過程中[15]，其在水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)的殘留已成為影響中國(guó)水產(chǎn)品質(zhì)量安全的常見因素之一。為保障消費(fèi)者飲食安全，歐盟、美國(guó)和中國(guó)等地區(qū)和國(guó)家均制定了水產(chǎn)品中ENR的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)(100 μg/kg)[16-17]。然而，仍有少數(shù)養(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中未嚴(yán)格遵守用藥規(guī)范，導(dǎo)致水產(chǎn)品中恩諾沙星殘留超標(biāo)現(xiàn)象仍有發(fā)生[18]。

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)，俗稱小龍蝦，深受廣大消費(fèi)者的喜愛。據(jù)報(bào)道[19]2017年中國(guó)小龍蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量為112.97萬 t，需求總量約為190萬 t，小龍蝦消費(fèi)市場(chǎng)持續(xù)火爆，可見小龍蝦在人們的日常飲食生活中的地位正在逐步加深。目前，關(guān)于烹飪加工對(duì)肌肉中藥物殘留影響的研究主要集中在雞肉[20]、牛肉[21]及豬肉[22]等畜禽產(chǎn)品，水產(chǎn)領(lǐng)域的研究對(duì)象僅見草魚(Ctenopharyngodonidella)[23]、對(duì)蝦(Fenneropenaeuschinensis)[13]及鯉(Cyprinuscarpio)[14]等，主要研究藥物為孔雀石綠[14]、氯霉素[13, 23-24]、磺胺甲基異噁唑[24]和土霉素[24]等，尚未見烹飪方式對(duì)小龍蝦中恩諾沙星藥物殘留影響的研究報(bào)道。

本研究采用浸泡給藥方式，獲得小龍蝦實(shí)際陽性樣品并將其制成蝦丸，分別經(jīng)水煮、清蒸、油炸和微波4種烹飪方式加工，測(cè)定加工前、后蝦丸中恩諾沙星含量的變化，評(píng)價(jià)不同烹飪方式對(duì)小龍蝦中恩諾沙星殘留的影響，探討小龍蝦烹飪過程中恩諾沙星藥物殘留變化的主要影響因素。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小龍蝦購(gòu)于上海東方國(guó)際水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)，平均體質(zhì)量為(25±2)g。恩諾沙星(純度≧10%)購(gòu)于北京大北農(nóng)動(dòng)物保健科技有限公司。恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品(純度≧98.5%)購(gòu)于德國(guó)Dr公司。恩諾沙星同位素內(nèi)標(biāo)物(純度≧99.0%)購(gòu)于Witega公司。甲醇、乙腈、乙酸乙酯和正己烷均為色譜純，購(gòu)于美國(guó)J.T.Baker公司。甲酸(色譜純)購(gòu)于西格瑪奧德里奇(中國(guó))公司。濾膜(親水，PTFE，0.22 μm)購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)溶液及內(nèi)標(biāo)液配制：準(zhǔn)確稱取恩諾沙星10 mg，用甲醇定容至100 mL，配制成100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20 ℃保存。取1 mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋至100 mL，配制成1 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)中間液。準(zhǔn)確稱取氘代恩諾沙星5 mg，用甲醇定容至50 mL，配制成100 μg/mL 的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，-20 ℃保存。取0.1 mL內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋至10 mL，配制成1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)中間液。取適量的標(biāo)準(zhǔn)中間液和內(nèi)標(biāo)中間液用流動(dòng)相稀釋，配制成2、5、10、25、50和100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，其中內(nèi)標(biāo)溶液濃度為50 ng/mL。

藥浴溶液配制：準(zhǔn)確稱取0.05 g的恩諾沙星藥品(含量以10%計(jì)算)，用甲醇定容至100 mL，配制為50 mg/L的恩諾沙星溶液。取3 mL 50 mg/L的恩諾沙星溶液，采用倍比稀釋的方式，逐步加入30 L水中，配制濃度為5 mg/L恩諾沙星藥浴溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo TSQ Quantum Ultra高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)；Mili-Q 純水儀(法國(guó)Millipore公司)；CF16RXⅡ型離心機(jī)(日本 HITACHI公司)；FA1004電子天平(上海精天電子儀器廠)；Vortex Genius Ⅲ型渦旋混合器(德國(guó)IKA公司)；Rotavapor?R-100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)。

1.3 方法

1.3.1 給藥方法

小龍蝦放置于含5 mg/L恩諾沙星溶液的水族箱(76 cm×56 cm×40 cm)中藥浴1 h后移出，用清水沖洗小龍蝦3次，每次3min。

1.3.2 蝦丸制備

小龍蝦洗凈后，去頭、去尾、去腸、去殼，取其肌肉組織，制成蝦仁。將300 g蝦仁，放入攪拌機(jī)中，攪拌3 min，制成均勻的蝦泥。再準(zhǔn)確稱取(2.00±0.05)g蝦泥，制成大小均一的蝦丸，經(jīng)測(cè)定蝦丸中恩諾沙星的殘留量均值為(1 695.1±170.3)μg/kg。

1.3.3 加工方法

水煮：水加熱至100 ℃時(shí)，將9個(gè)蝦丸樣品放入水中，蓋上鍋蓋。在水煮2、5和10 min時(shí)，分別取出3個(gè)蝦丸樣品，冷卻后，放入50 mL的離心管中。

清蒸：水加熱至100 ℃時(shí)，將9個(gè)蝦丸樣品放入蒸格中，蓋上鍋蓋。在清蒸2、5和10 min時(shí)，分別取出3個(gè)蝦丸樣品，冷卻后，放入50 mL的離心管中。

油炸：油溫?zé)嶂?80 ℃時(shí)，將9個(gè)蝦丸樣品放入油中，在油炸2、3和4 min時(shí)，分別取出3個(gè)蝦丸樣品，冷卻后，放入50 mL的離心管中。

微波：將9個(gè)蝦丸樣品放入微波爐內(nèi)，中火微波，在微波1、2和3 min時(shí)，分別取出3個(gè)蝦丸樣品，冷卻后，放入50 mL的離心管中。

1.3.4 樣品測(cè)定

樣品測(cè)定方法參考農(nóng)業(yè)部1077號(hào)公告—1—2008《水產(chǎn)品中17種磺胺類及15種喹諾酮類藥物殘留量的測(cè)定 液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法》。

1.3.4.1 恩諾沙星分析色譜條件

C18色譜柱(MGII，100.0 mm×2.0 mm, 5μm)，流動(dòng)相A為0.1%甲酸水溶液(含2 mmol/L乙酸銨)，流動(dòng)相B為甲醇；進(jìn)樣量20 μL；柱溫40 ℃。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 The mobile phase gradient elution program

1.3.4.2 恩諾沙星分析質(zhì)譜條件

ESI+離子模式，電子傳輸毛細(xì)管溫度350 ℃，氣化室溫度300 ℃，鞘氣(N2) 2.4×105Pa，輔助氣(N2) 10 psi，碰撞氣(Ar)1.5 mTorr，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，碎片離子及碰撞能量見表2。

表2 反應(yīng)監(jiān)測(cè)的定性離子、定量離子與碰撞能量Tab.2 The qualitative ions, quantitative ions and collision energy used for selected reaction monitoring

1.3.4.3 恩諾沙星分析前處理方法

在裝入蝦丸的離心管中準(zhǔn)確加入50 μL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液(1.0 μg/mL)渦旋混合50 s，加入15 mL乙腈(含1%甲酸，V/V)，渦旋混合1 min，超聲提取10 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液于50 mL梨形瓶中。在殘?jiān)性偌尤?5 mL乙腈(含1%甲酸，V/V)，重復(fù)提取一次，合并兩次提取液，于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸至近干，分別加入1.0 mL甲醇溶液(20%，V/V)和2.0 mL正己烷渦旋混合30 s，轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，4 000 r/min 離心5 min，取下層溶液過0.22 μm水相濾膜，待液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2010對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。經(jīng)過不同烹飪處理后，蝦丸樣品中恩諾沙星的變化量，用公式(1)計(jì)算。

式(1)

式中：△T為蝦丸中恩諾沙星含量減少百分率(%)；C0為未加工蝦丸中的藥物殘留量初始濃度，(μg/kg)；Ct為加工處理后蝦丸中的藥物殘留量濃度，(μg/kg)。

利用Excel 2010中的單因素方差分析，對(duì)各組數(shù)據(jù)間差異進(jìn)行方差分析，當(dāng)P<0.05時(shí)為顯著差異，P<0.01時(shí)為極顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與線性范圍、最低檢出限

以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度作為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)物和其氘代內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值作為縱坐標(biāo)作ENR的標(biāo)準(zhǔn)曲線。ENR標(biāo)準(zhǔn)曲線在2.0 ～100.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程為：Y=0.107 5X+0.009 3，相關(guān)系數(shù)r≥0.999 2。經(jīng)加標(biāo)試驗(yàn)確定方法檢出限為1.0 μg/kg (S/N≥3)，定量限為2.0 μg/kg (S/N≥10)，滿足本試驗(yàn)小龍蝦中恩諾沙星的定量分析。

2.2 蝦丸陽性樣品均勻性測(cè)定

隨機(jī)抽取3個(gè)制備好的蝦丸樣品，測(cè)定其恩諾沙星的含量，結(jié)果(表3)顯示蝦丸樣品的檢出值在1 508.9～1 733.3 μg/kg之間，平均值為1 695.1 μg/kg，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為10.0 %，RSD≤15.0 %，符合檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)相關(guān)要求，說明蝦丸陽性樣品的均勻性良好，可以用于后續(xù)的烹飪模擬實(shí)驗(yàn)。

2.3 烹飪加工對(duì)蝦丸樣品中恩諾沙星殘留的影響

2.3.1 水煮

水煮不同時(shí)間后，蝦丸樣品中恩諾沙星含量測(cè)定結(jié)果見表4。水煮2、5和10 min后(自水沸騰起計(jì)時(shí))，蝦丸樣品中恩諾沙星濃度分別為1 153.4、1 130.6和1 047.4 μg/kg。與未加工蝦丸樣品相比，恩諾沙星含量分別減少了541.6、564.4和647.6 μg/kg。隨著水煮時(shí)間的延長(zhǎng)，蝦丸中恩諾沙星的含量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，水煮10 min時(shí)效果最好。按照1.2.5中公式進(jìn)行計(jì)算，水煮2、5和10 min，蝦丸樣品中恩諾沙星濃度分別減少了32.0%、33.3%和38.2%。王唯芳[24]的研究表明，水煮9 min后，氯霉素、磺胺甲基異噁唑和土霉素分別下降了96%、82%和75%。本研究中小龍蝦恩諾沙星下降效率小于其他藥物，可能是不同藥物在加熱條件下穩(wěn)定性不同所致[21]。

表3 蝦丸樣品均勻性測(cè)定結(jié)果Tab.3 The results of sample homogeneity of shrimp pellets n=3

2.3.2 清蒸

清蒸2、5和10 min后(自水沸騰起計(jì)時(shí))，蝦丸中恩諾沙星的含量如圖1所示，按照1.2.5中公式進(jìn)行計(jì)算，蝦丸樣品中恩諾沙星分別減少了8.6 %、20.2 %和22.0 %，判斷清蒸10 min能夠最大限度減少蝦丸中恩諾沙星的含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著清蒸時(shí)間的增加，蝦丸中恩諾沙星的含量逐漸減少，但減少速率明顯下降。在實(shí)際烹飪條件下，清蒸蝦丸也不會(huì)超過10 min。由此可以推斷，在實(shí)際生活中清蒸方式能夠降低蝦丸中恩諾沙星含量，但不能完全去除蝦丸中恩諾沙星的殘留。

表4 水煮加工處理后蝦丸樣品中恩諾沙星的殘留量Tab.4 The content of ENR residue in shrimp pellets after boiling n=3

2.3.3 油炸

油炸不同時(shí)間后，蝦丸樣品中恩諾沙星含量測(cè)定結(jié)果見表5。油炸2、3和4 min后，蝦丸樣品中恩諾沙星分別減少了40.6 %、44.6 %和55.4 %，油炸4 min能夠最大限度減少蝦丸中恩諾沙星的含量。黃和等[13]研究發(fā)現(xiàn)油炸4 min時(shí)，對(duì)蝦中3種氯霉素下降93.30 %～ 94.91 %，這與本研究結(jié)果相差較大，除藥物種類不同外，還可能是由于樣品給藥方式不同，藥物與肌肉結(jié)合力存在差異所致。本實(shí)驗(yàn)的小龍蝦陽性樣品為藥浴給藥獲得的實(shí)際陽性樣品，而黃和等[13]的對(duì)蝦陽性樣品是人工添加標(biāo)準(zhǔn)品制備而成。

表5 油炸加工處理后蝦丸樣品中恩諾沙星的殘留量Tab.5 The content of ENR residue in shrimp pellets after frying n=3

2.3.4 微波

微波處理不同時(shí)間后，蝦丸樣品中恩諾沙星含量測(cè)定結(jié)果見表6。微波1、2和3 min后，蝦丸樣品中恩諾沙星分別減少了22.1 %、41.6 %和74.9 %，推斷微波3 min能夠最大限度地減少蝦丸中恩諾沙星的含量。在不考慮烹飪時(shí)間的情況下，4種烹飪方式中，微波對(duì)小龍蝦中恩諾沙星的消除率最高，這與Mitrowska等[14]研究結(jié)果一致，其研究表明微波處理能夠最大限度的地降低鯉中孔雀石綠和無色孔雀石綠的殘留。微波對(duì)小龍蝦中恩諾沙星殘留的影響除了溫度因素外，還可能與微波輻射有關(guān)。

表6 微波加工處理后蝦丸樣品中恩諾沙星的殘留量Tab.6 The content of ENR residue in shrimp pellets after microwaving n=3

2.3.5 不同烹飪方式對(duì)小龍蝦中恩諾沙星消除效率的比較

經(jīng)不同烹飪方式處理2 min后，蝦丸中恩諾沙星的含量如圖2所示。微波和油炸加工條件對(duì)蝦丸中恩諾沙星的消除效率遠(yuǎn)高于水煮和清蒸方式，這可能與溫度上升的快慢有關(guān)。4種烹飪方式中，微波方式和油炸方式都能使小龍蝦樣品的溫度較快上升，而水煮和清蒸方式在短時(shí)間內(nèi)無法使得小龍蝦樣品溫度迅速上升，因此短時(shí)間內(nèi)，微波和油炸對(duì)降低小龍蝦中恩諾沙星殘留效果較水煮和清蒸更為明顯。這一結(jié)果，與黃和等[13]研究結(jié)果基本一致，其研究表明不同加工條件下，加工2 min后，微波和油炸均能使對(duì)蝦中氯霉素的含量顯著下降，其次是水煮，最后是清蒸。

經(jīng)不同烹飪方式處理后，蝦丸中恩諾沙星的消除率見表7。由表7可知，不同烹飪方式處理?xiàng)l件下，微波加工處理后的蝦丸樣品中恩諾沙星消除率最高，為74.9%；其次是油炸，為54.4%；再次是水煮，為38.2%；清蒸的消除率最低，為22.0%。出現(xiàn)這一結(jié)果的原因可能與加工方式和加熱的溫度有關(guān)。在這4種烹飪方式中，微波加熱是依靠分子間劇烈碰撞產(chǎn)生熱量，使物體均勻受熱，且使物體中心溫度迅速升高，因此對(duì)恩諾沙星的消除率最高。油炸溫度為180 ℃，高于水煮和清蒸的100 ℃，因此，油炸方式對(duì)消除小龍蝦中恩諾沙星的影響高于水煮和清蒸。水煮和清蒸的溫度均為100 ℃，而水煮條件下小龍蝦中恩諾沙星消除率高于清蒸，其原因可能是水煮條件下，蝦丸中的恩諾沙星轉(zhuǎn)移到加熱介質(zhì)水中含量高于轉(zhuǎn)移到蒸汽中，相比之下，水煮條件下蝦丸中恩諾沙星含量下降率更高。綜上，烹飪方式和溫度是影響蝦丸中恩諾沙星含量的主要因素。

表7 不同烹飪方式理后蝦丸樣品中恩諾沙星消除率比較Tab.7 Comparison of the elimination rates of ENR in shrimp pellets by different cooking methods n=3

3 結(jié)論

在日常生活中，水煮、清蒸、油炸和微波4種烹飪方式均能夠減少小龍蝦中恩諾沙星的殘留量，可降低其食用風(fēng)險(xiǎn)。在對(duì)小龍蝦中恩諾沙星的殘留進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí)，考慮到烹飪可改變藥物殘留含量這一因素，建議對(duì)膳食暴露劑量進(jìn)行修正。此外，4種烹飪方式中，微波加工對(duì)降低小龍蝦中恩諾沙星含量效果最為顯著，其次為油炸加工，再次為水煮，最后為清蒸，推斷烹飪方式和溫度是影響小龍蝦中恩諾沙星降解效率的主要因素。本研究選取的烹飪處理時(shí)間點(diǎn)是針對(duì)相應(yīng)的烹飪方式在日常中所用的時(shí)間進(jìn)行設(shè)置的，時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)影響蝦丸的食用品質(zhì)，且在實(shí)際應(yīng)用中不常見，故未對(duì)延長(zhǎng)加工時(shí)間對(duì)藥物殘留的影響做進(jìn)一步考察。本研究結(jié)果可為開展小龍蝦中恩諾沙星殘留風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和科普宣傳提供數(shù)據(jù)支撐。