劉瑩，李啟艷，胡德福，于海英

(山東省食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東省中藥標(biāo)準(zhǔn)創(chuàng)新與質(zhì)量評(píng)價(jià)工程實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250101)

西洋參，為五加科植物西洋參(PanaxquinquefoliumL.)的干燥根，性涼、味甘、微苦，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清熱生津的功效，主治氣陰兩虛、陰虛津傷、內(nèi)熱、咳喘痰血、虛熱煩倦、消渴、口燥咽干[1]，是我國常用的名貴中藥材。西洋參的使用不僅用于醫(yī)藥領(lǐng)域，在食療保健方面應(yīng)用也非常廣泛，因此西洋參質(zhì)量安全越來越受到關(guān)注，而藥材中的農(nóng)藥殘留又是影響藥材質(zhì)量的重要因素之一[2]，尤其是根類藥材，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，農(nóng)藥易富集，更易受到農(nóng)藥的污染，所以研究西洋參中農(nóng)藥殘留是非常有必要的。

有機(jī)氯農(nóng)藥(organochlorine pesticides，OCPs)曾是農(nóng)藥史中使用量最大、使用歷史最長(zhǎng)的一大類含氯有機(jī)化合物農(nóng)藥[3]，具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、脂溶性大、半衰期長(zhǎng)等特性，易在脂肪體中蓄積， 造成慢性中毒， 嚴(yán)重危及人體健康。從 1983年起，我國禁止生產(chǎn)和使用有機(jī)氯農(nóng)藥[4]，但目前在食品、中藥材中仍可檢出，甚至常有樣品超出標(biāo)準(zhǔn)限量情況發(fā)生[5-7]。近年來，有不少關(guān)于西洋參有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的測(cè)定方法的報(bào)道[8-11]，《中國藥典》2015年版第一增補(bǔ)本也收載了西洋參中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量測(cè)定的方法。以上方法絕大部分是采用有機(jī)試劑比如丙酮、石油醚、正己烷、乙酸乙酯或混合有機(jī)試劑提取，磺酸法或固相萃取法凈化，氣相色譜-電子捕獲檢測(cè)器法檢測(cè)，該類方法操作步驟煩瑣，試劑消耗量大且測(cè)定過程中，干擾峰較多。本研究在優(yōu)化有機(jī)氯農(nóng)藥殘留提取、凈化方法和氣相色譜檢測(cè)條件基礎(chǔ)上，建立測(cè)定西洋參中17種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量的QuEChERS-氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法提取完全、靈敏度高，并有效地減少了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)，能更加準(zhǔn)確地對(duì)西洋參的質(zhì)量安全進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Thermo氣相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀；渦旋混勻儀；高速離心機(jī)；氮吹儀；Mettler Toledo電子天平(十萬分之一)；Milli-Q超純水儀；QuEChERS萃取鹽包(4 g MgSO4+1 g NaCl+1 g檸檬酸鈉+0.5 g檸檬酸氫二鈉)；QuEChERS凈化管15 mL(400 mg PSA+400 mg C18+1 200 mg MgSO4)。

1.2 試藥 22種混合有機(jī)氯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(含有α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC、pp′-DDE、pp′-DDD、op′-DDT、pp′-DDT、五氯硝基苯、六氯苯、七氯、順式環(huán)氧七氯、反式環(huán)氧七氯、艾試劑、氧化氯丹、順式氯丹、反式氯丹17種待測(cè)農(nóng)藥)，每種成分濃度為10 μg·mL-1，購自BePure；乙腈、乙酸乙酯、甲苯均為色譜純；試驗(yàn)用水均為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 儀器條件

2.1.1 色譜條件 色譜柱：DB-5毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm)，或相當(dāng)者；色譜柱溫度：90 ℃保持5 min，然后以25 ℃·min-1程序升溫至180 ℃，保持1 min再以5 ℃·min-1升溫至260 ℃，再以30 ℃·min-1升溫至300 ℃，保持10 min；載氣：氦氣，純度≥99.999%，流速1.2 mL·min-1；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電子轟擊源：70 eV；離子源溫度：300 ℃；傳輸線溫度：280 ℃；溶劑延遲：3 min；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，監(jiān)測(cè)離子及質(zhì)譜參數(shù)參見表1。

表1 17種有機(jī)氯農(nóng)藥的質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)

2.2 溶液配制

2.2.1 對(duì)照品溶液的配制 標(biāo)準(zhǔn)使用溶液：精密吸取混合有機(jī)氯農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品1 mL，用乙酸乙酯定容至5 mL容量瓶中，制成2.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液。標(biāo)準(zhǔn)系列溶液：精確吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)使用溶液，逐級(jí)用乙酸乙酯釋成質(zhì)量濃度為0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 將藥材粉碎后，稱取2.0 g樣品于50 mL具塞離心管中，加入10 mL水，渦旋混勻，加入10 mL乙腈，振搖混勻，加入QuEChERS萃取鹽包(4 g MgSO4+1 g NaCl+1 g檸檬酸鈉+0.5 g檸檬酸氫二鈉)，用力振搖1 min，4 000 r·min-1離心5 min；先用2 mL甲苯預(yù)飽和凈化管(400 mg PSA+400 mg C18+1 200 mg MgSO4)，振搖混勻凈化管，取6 mL乙腈層于凈化管中，渦旋混勻1 min，4 000 r·min-1離心5 min，取4 mL上清液于另一干凈的15 mL離心管中，40 ℃氮?dú)獯蹈?，? mL乙酸乙酯渦旋復(fù)溶，用0.22 μm濾膜過濾，上機(jī)測(cè)定。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化 西洋參藥材基質(zhì)較為復(fù)雜，氣相色譜法無法排除基質(zhì)中其他組分對(duì)待測(cè)組分的干擾，所以本研究選擇了氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法并對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。將配制好的17種有機(jī)氯農(nóng)藥的單標(biāo)溶液(1.0 μg·mL-1)注入儀器，進(jìn)行掃描，每種化合物分別選擇一對(duì)定量離子和一對(duì)定性離子，優(yōu)化得到的質(zhì)譜條件詳見表1，采集得到的MRM色譜圖見圖1。

2.4 樣品前處理方法的建立

2.4.1 提取溶劑的選擇 西洋參藥材一般采挖、洗凈、曬干或低溫干燥后出售，所以水分含量低，粉碎后如直接用有機(jī)溶劑去提取有機(jī)氯目標(biāo)化合物，由于有機(jī)溶劑對(duì)樣品的穿透性不強(qiáng)，回收率會(huì)偏低。所以本研究在樣品提取前，先用少量水潤(rùn)濕，然后用有機(jī)溶劑提取。農(nóng)藥殘留分析時(shí)常采用的提取溶劑主要有乙腈、丙酮、乙酸乙酷、石油醚及一些混合提取溶劑[12-13]。用丙酮和乙酸乙酯提取時(shí)，溶出的樣品雜質(zhì)、油脂較多；用乙腈提取對(duì)脂肪和色素的溶解能力最小，且滲透能力強(qiáng)[14]，所以選擇乙腈為提取溶劑。

2.4.2 前處理方法的選擇 QuEChERS是Michelangelo Anastassiades和Steven J Lehotay等人于2003年提出的一種樣品前處理方法，目前已廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)境水樣和土壤污染物檢測(cè)。QuEChERS法需要利用鹽析效應(yīng)促進(jìn)水和乙腈溶液分層而獲得乙腈提取液。目前最常用鹽析試劑組合是乙酸鈉和檸檬酸鈉兩種緩沖鹽體系，通過考察，本研究選擇了含有4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g檸檬酸鈉、0.5 g檸檬酸氫二鈉的緩沖鹽體系，其中無水硫酸鎂用于除去基質(zhì)中的水分，其余的緩沖鹽用于提供適宜的pH，用于保證一些對(duì)酸堿敏感農(nóng)藥可以有好的回收率。另外，由于中藥材基質(zhì)成分較復(fù)雜，主要成分有水、色素、氨基酸、有機(jī)酸、生物堿、留體化合物、萜類化合物等，QuEChERS法常用的吸附劑有PSA/C18/GCB等，PSA通過極性、陰離子交換作用力吸附除去糖類、脂肪酸、有機(jī)酸、多酚等極性較強(qiáng)的雜質(zhì)，C18清除脂類等強(qiáng)非極性物質(zhì)，GCB去除葉綠素、類胡蘿卜素及甾醇等色素。根據(jù)西洋參藥材可能存在的成分，本研究選擇了400 mg PSA+400 mg C18作為吸附劑。

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性范圍、檢出限和定量限 將配制好的0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，以各化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，定量離子對(duì)的峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算其線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，采用外標(biāo)法定量。結(jié)果顯示，17種待測(cè)物在0.005～0.5 μg·mL-1范圍內(nèi)，各待測(cè)物的濃度和峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。17種待測(cè)物的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限(信噪比S/N≥3)、定量限(信噪比S/N≥10)見表2。

表2 線性方程，相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.5.2 準(zhǔn)確度與精密度 以不含目標(biāo)組分的樣品作為加標(biāo)樣品，分別進(jìn)行低、中、高3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)濃度水平分別為0.02、0.1、0.5 mg·kg-1，每個(gè)水平6個(gè)樣本。17種待測(cè)物的回收率范圍為75.0%～120.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為1.8%～10.0%。17種待測(cè)物的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的數(shù)據(jù)詳見表3。

表3 17種待測(cè)物的回收率及精密度試驗(yàn)(n=6)

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定 本研究收集了西洋參藥材35批，采用本方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表4。根據(jù)《中國藥典》2015 年版(一部)西洋參項(xiàng)下的農(nóng)殘限度要求判定：五氯硝基苯不合格率為60%；六六六不合格率為8.6% ；六氯苯不合格率為8.6%；總滴滴涕殘留量不合格率為5.7%；其余農(nóng)藥均未檢出。由上可知，七氯、艾試劑、氯丹對(duì)西洋參的污染最輕，其次是六氯苯、總滴滴涕、總六六六，五氯硝基苯對(duì)西洋參的污染最為嚴(yán)重。本研究發(fā)現(xiàn)的這一結(jié)果與其他文獻(xiàn)[5]報(bào)道一致。

表4 樣品中有機(jī)氯農(nóng)藥的殘留狀況(n=35)

2.7 與藥典增補(bǔ)的方法比較 隨機(jī)選取5批西洋參樣品，分別按本文方法(a)和藥典增補(bǔ)西洋參有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量測(cè)定方法(b)進(jìn)行測(cè)定，比較所測(cè)得含量，結(jié)果見表5。由表5可見，本文方法結(jié)果比藥典方法測(cè)的結(jié)果偏低，藥典方法采用的氣相色譜法雖然使用了雙色譜柱進(jìn)行定性，但依然不能解決復(fù)雜基質(zhì)中共出峰干擾有機(jī)氯農(nóng)藥測(cè)定的問題，所以導(dǎo)致結(jié)果偏高。

表5 兩種方法測(cè)的結(jié)果比較(mg·kg-1)

3 結(jié)論

本研究采用乙腈直接提取，QuEChERS法對(duì)樣品進(jìn)行凈化，結(jié)合氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了西洋參藥材中17種有機(jī)氯農(nóng)藥的檢測(cè)方法，并對(duì)其進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。該方法簡(jiǎn)單可靠、經(jīng)濟(jì)環(huán)保、靈敏度高，滿足西洋參藥材中17種有機(jī)氯農(nóng)藥殘留檢測(cè)的定性定量要求。