孔令鋒，王鐵軍，郭漢文，李成森，孫苓苓，王歡

(1.遼寧省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，遼寧 沈陽(yáng) 110036； 2.丹東市藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，遼寧 丹東 118000；3.山東泓潤(rùn)健康科技有限公司，山東 濟(jì)南 250022)

骨折挫傷膠囊收載于《中國(guó)藥典》2015年版(一部)，該處方主要由豬骨(制)、黃瓜子(炒)、土鱉蟲、自然銅(煅)、乳香(制)、沒藥(制)、血竭、紅花、大黃、當(dāng)歸組成。具有舒筋活絡(luò)，消腫散瘀，接骨止痛之功效。其療效確切，為跌打損傷首選藥物之一[1-3]，該品種為2016年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)品種，全國(guó)共有生產(chǎn)企業(yè)13家，批準(zhǔn)文號(hào)13個(gè)。

本次共抽取112批次樣品，涉及生產(chǎn)企業(yè)8家、批準(zhǔn)文號(hào)8個(gè)，按國(guó)評(píng)工作方案，進(jìn)行了法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)。基于法定檢驗(yàn)結(jié)果，以問題為導(dǎo)向，結(jié)合該品種處方含貴細(xì)藥、礦物藥、動(dòng)物藥等特點(diǎn)，參考相關(guān)文獻(xiàn)[4-10]從藥品安全性、有效性、穩(wěn)定性方面進(jìn)行了探索性研究，綜合法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)與探索性研究的結(jié)果，對(duì)骨折挫傷膠囊質(zhì)量情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，為藥品監(jiān)管及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent Technologies 1260series高效液相色譜儀，包括G1311C四元梯度泵，G1329B自動(dòng)進(jìn)樣器，G4212B二極管陣列檢測(cè)器，Agilent Ezchromn色譜工作站；HU10260B型超聲波清洗器；Sartorius CP225D電子天平；普析通用TU-1950型紫外可見分光光度計(jì)；PerkinElmer PinAAcle 900T原子吸收光譜儀；CEM-MARS 微波消解儀。

1.2 試藥 血竭素高氯酸鹽對(duì)照品(批號(hào)：110811-201506，純度98.6%)、羥基紅花黃色素A對(duì)照品(批號(hào)：111637-201106，純度92.5%)、大黃酚對(duì)照品(批號(hào)：110796-201319，純度99.6%)、11-羰基-β-乙酰乳香酸對(duì)照品(批號(hào)：111760-201502，純度99.3%)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；鉛元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(批號(hào)：GSB 04-1742-2004)、鎘元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(批號(hào)：GSB 04-1721-2004)、砷元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(批號(hào)：GSB 04-1714-2004)、汞元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(批號(hào)：GSB 04-1729-2004)、銅元素標(biāo)準(zhǔn)溶液(批號(hào)：GSB 04-1725-2004)均購(gòu)自國(guó)家有色金屬及電子材料分析測(cè)試中心，乙醇、乙腈為色譜純，硝酸及鹽酸為優(yōu)級(jí)純，水為重蒸水。骨折挫傷膠囊共112批次，均來自國(guó)家評(píng)價(jià)性抽樣樣品，共8家生產(chǎn)企業(yè)(A～H)。

2 法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)

2.1 標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)結(jié)果 骨折挫傷膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為《中國(guó)藥典》2015年版(一部)，檢驗(yàn)項(xiàng)目包括性狀、顯微鑒別、大黃和紅花的薄層鑒別、常規(guī)檢查項(xiàng)和血竭素HPLC含量測(cè)定。對(duì)112批樣品按法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)均符合規(guī)定，合格率100%。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià) 對(duì)骨折挫傷膠囊現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分析， 認(rèn)為現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置不夠全面，因血竭素高氯酸鹽穩(wěn)定性差，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)限度值有待商榷，未對(duì)紅花、大黃、乳香等藥材進(jìn)行控制，導(dǎo)致必要的檢驗(yàn)項(xiàng)目缺失。該品種為生藥原粉制劑，可能存在染色、摻偽、重金屬超標(biāo)等隱患，無法對(duì)產(chǎn)品的安全性、有效性進(jìn)行控制。

3 探索性研究

從藥品安全性、有效性、穩(wěn)定性等方面對(duì)65批樣品(去除重復(fù)批號(hào)后)進(jìn)行探索性研究，達(dá)到全面評(píng)價(jià)該品種整體質(zhì)量的目的。

3.1 藥品安全性研究

3.1.1 非法染色 骨折挫傷膠囊為全原粉制劑，處方中有紅花、血竭藥材，針對(duì)可能存在的摻偽染色問題，采用薄層色譜方法對(duì)蘇丹Ⅰ、蘇丹Ⅳ、808猩紅、酸性紅73、金橙Ⅱ、檸檬黃、胭脂紅、金胺、新品紅、赤蘚紅等10種色素進(jìn)行了篩查，結(jié)果65批樣品均未發(fā)現(xiàn)染色問題。

3.1.2 松香酸摻偽 骨折挫傷膠囊處方中含有醋乳香、醋沒藥、血竭三味樹脂類藥材，針對(duì)可能存在松香摻偽問題，采用HPLC法對(duì)松香酸進(jìn)行篩查，結(jié)果65批樣品均未檢出松香酸。

3.1.3 重金屬檢測(cè) 骨折挫傷膠囊處方中含有礦物藥自然銅，可能產(chǎn)生內(nèi)源性的重金屬積蓄，處方中的土鱉蟲，也容易導(dǎo)致重金屬超標(biāo)。因此采用仿人工胃液對(duì)制劑進(jìn)行樣品前處理 ,用ICP-MS法測(cè)定20批樣品中鉛、鎘、砷、汞、銅含量。參照WHO推薦的每日最高攝入量限度(以體重60 kg計(jì))，鉛為214 μg、鎘為60 μg、砷為128 μg、汞為43 μg、銅為30 mg。按每日服用量折算各元素值，鉛(Pb)的每日最大攝入量為65 μg，鎘(Cd)的每日最大攝入量為1.45 μg，砷(As)的每日最大攝入量為34 μg，汞(Hg)的每日最大攝入量為8 μg，合格率45%，銅(Cu)的每日最大攝入量為0.2 mg，均未超出WHO的推薦值。

3.2 藥物有效性研究

3.2.1 當(dāng)歸的薄層色譜鑒別 參考《中國(guó)藥典》2015年版(一部)中當(dāng)歸的薄層鑒別方法并進(jìn)行優(yōu)化，建立骨折挫傷膠囊中當(dāng)歸的薄層鑒別方法。對(duì)65批樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果63批樣品可清晰檢出當(dāng)歸，2批樣品未檢出當(dāng)歸，涉嫌所用藥材質(zhì)量較差或制劑工藝可能存在問題。典型色譜圖見圖1。

3.2.2 血竭、乳香的薄層色譜鑒別 參考《中國(guó)藥典》2015年版(一部)中血竭、乳香及天麻頭痛片的薄層鑒別方法，以血竭對(duì)照藥材、乳香對(duì)照藥材做對(duì)照，對(duì)處方中的血竭、乳香進(jìn)行共薄層鑒別。結(jié)果65批樣品均可清晰檢出血竭、乳香，合格率100%。典型色譜圖見圖2。

在農(nóng)業(yè)科技飛速發(fā)展的大背景下，玉米種植實(shí)現(xiàn)全程機(jī)械化生產(chǎn)已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中的又一重要課題。我單位是云南省陸良縣召夸鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，在當(dāng)?shù)赜衩兹虣C(jī)械化方面進(jìn)行了積極嘗試，為地區(qū)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)化發(fā)展做出了突出貢獻(xiàn)。但“發(fā)展始終在路上”，陸良縣玉米全程機(jī)械化仍存在一些實(shí)際困難，針對(duì)這一情況提出了幾點(diǎn)解決建議，希望能夠給廣大同行以有益的啟示。

3.2.3 紅花、大黃的含量測(cè)定 現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)僅有血竭素含量測(cè)定項(xiàng)，無法有效控制制劑的整體質(zhì)量。探索性研究建立了同時(shí)測(cè)定紅花、大黃含量的HPLC方法，對(duì)8個(gè)企業(yè)的65批樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果不同生產(chǎn)企業(yè)的各有效成分含量差異較大，同一生產(chǎn)企業(yè)不同批次之間各有效成分含量差異明顯。

3.2.3.1 色譜條件 色譜柱： Agilent Zorbax Bonus-RP C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)-0.2%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～13 min，18%A→25%A；13～14 min，25%A→80%A；14～25 min，80%A)；流速1.0 mL·min-1；羥基紅花黃色素A和大黃酚檢測(cè)波長(zhǎng)為428 nm；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

3.2.3.2 溶液的制備 混合對(duì)照品溶液 取羥基紅花黃色素A對(duì)照品、大黃酚對(duì)照品適量，精密稱定，加乙醇制成混合對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅰ，每1 mL含羥基紅花黃色素A 29.82 μg、大黃酚5.214 μg，精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液Ⅰ 5 mL置25 mL量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，得混合對(duì)照品溶液Ⅱ，每1 mL含羥基紅花黃色素A 5.964 μg、大黃酚1.043 μg，備用。

3.2.3.3 供試品溶液 取骨折挫傷膠囊10粒的內(nèi)容物0.4 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率200 W，頻率50 kHz)30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.2.3.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液各10 μL，進(jìn)樣分析，結(jié)果各待測(cè)成分與前后峰分離良好，分離度均大于1.5；理論板數(shù)以羥基紅花黃色素A、大黃酚峰計(jì)算均不低于4 000。

3.2.3.5 線性關(guān)系考察 分別精密吸取羥基紅花黃色素A、大黃酚混合對(duì)照品溶液及儲(chǔ)備液注入液相色譜儀，測(cè)定，以對(duì)照品的進(jìn)樣量(X，μg)為橫坐標(biāo)，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果表明，在線性范圍內(nèi)上述3種有效成分的進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。詳見表1。

表1 骨折挫傷膠囊中3種成分的回歸方程和線性范圍

3.2.3.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液Ⅱ 10 μL，進(jìn)樣分析，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定2種成分的色譜峰面積，結(jié)果羥基紅花黃色素A、大黃酚峰面積的RSD值分別為0.1%、0.8%(n=6)。結(jié)果表明儀器精密度良好。

3.2.3.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液(企業(yè)B，批號(hào)：160301)10 μL，分別于配制后0、2、4、8、12、18和24 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果羥基紅花黃色素A、大黃酚峰面積的RSD值分別為0.3%、0.5%(n=6)，結(jié)果表明，供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.2.3.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批號(hào)的樣品(企業(yè)B，批號(hào)：160301)6份，各0.2 g，分別制成供試品溶液，按相應(yīng)色譜條件測(cè)定。結(jié)果羥基紅花黃色素A、大黃酚的含量平均值分別為1.138 6、0.250 6 mg·g-1，RSD分別為0.9%、0.4%(n=6)，表明重復(fù)性良好。

3.2.3.9 回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品(企業(yè)B，批號(hào)：160301)0.2 g，置具塞錐形瓶中，精密加入羥基紅花黃色素A、大黃酚合對(duì)照品溶液I 10 mL，制備回收率樣品溶液，進(jìn)樣分析，分別計(jì)算各成分的回收率及RSD值，羥基紅花黃色素A、大黃酚的平均加樣回收率分別為99.7%、98.7%，RSD分別為0.2%、0.8%(n=6)。

3.2.3.10 樣品測(cè)定 取8家生產(chǎn)廠家共65批樣品，制備供試品溶液，分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中羥基紅花黃色素A、大黃酚的含量，結(jié)果見表2。

表2 各生產(chǎn)廠家樣品測(cè)定結(jié)果統(tǒng)計(jì)

企業(yè)B生產(chǎn)的骨折挫傷膠囊中羥基紅花黃色素A和大黃酚的平均含量最高，且2種成分含量結(jié)果的分布均一性較好；企業(yè)A、E、G的樣品中部分成分平均含量較高，但含量結(jié)果的分布離散性較大，提示其生產(chǎn)原料或生產(chǎn)工藝穩(wěn)定性較差；企業(yè)C、F、H的樣品批數(shù)較少，數(shù)據(jù)量較少，趨勢(shì)不明。

3.3 藥物穩(wěn)定性研究

3.3.1 血竭素含量測(cè)定分析 現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定血竭素的含量不得少于40 μg/粒，對(duì)批次在6批以上的企業(yè)生產(chǎn)的產(chǎn)品進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，由圖4可見，各企業(yè)產(chǎn)品血竭素含量差異較大，同一企業(yè)生產(chǎn)日期較早的產(chǎn)品含量較低，對(duì)企業(yè)的函調(diào)也反饋血竭素含量不穩(wěn)定，隨貯存時(shí)間延長(zhǎng)血竭素含量出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，降解快，部分批次樣品測(cè)定結(jié)果接近限度值。測(cè)定方法重現(xiàn)性不好，存在標(biāo)準(zhǔn)不完善的問題。針對(duì)這一問題分析血竭素的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)血竭素屬于花青素類化合物(flavylium compounds)，其和報(bào)道過的花青素相類似，在溶液中不穩(wěn)定，隨著溫度、光照及溶液pH值的變化，發(fā)生一系列可逆復(fù)雜的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變[11-20]，因此根據(jù)制劑特點(diǎn)分別考察了提取溶液pH值、混料順序等因素對(duì)血竭素穩(wěn)定性的影響。

3.3.2 提取溶液pH值的影響 分別配制不同濃度的磷酸甲醇溶液作為提取溶劑，并按照現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)含量測(cè)定方法制備骨折挫傷膠囊供試品溶液，測(cè)定血竭素的含量，結(jié)果見圖5。由圖可見，供試品提取溶劑pH值越低，血竭素的含量測(cè)定結(jié)果的數(shù)值越大。

3.3.3 混料順序?qū)ρ吆繙y(cè)定的影響 除豬骨膠外，處方中的其他9味藥材均為原粉入藥，處方中含有大量動(dòng)物膠質(zhì)類、脂肪類、蛋白質(zhì)類、樹脂類等成分，考慮到處方藥味之間可能存在一定的相互影響作用，故分別考察血竭單獨(dú)混合粉碎和與各藥味分別粉碎對(duì)血竭含量測(cè)定結(jié)果的影響。

按處方量，分別取血竭與處方中任一味藥粉碎后，再與其他8味藥的混合細(xì)粉混勻。分別于血竭混合粉碎藥味順序?yàn)樨i骨膠(A1)、炒黃瓜子(A2)、醋乳香與醋沒藥(A3)、當(dāng)歸(A4)、紅花(A5)、土鱉蟲(A6)、煅自然銅(A7)、大黃混合后粉碎成細(xì)粉(A9)，另取血竭單獨(dú)粉碎后，再與其他9味藥的混合細(xì)粉混勻(A8-1和A8-2)。按照現(xiàn)行執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)《中國(guó)藥典》2015年版(一部)“骨折挫傷膠囊”【含量測(cè)定】項(xiàng)方法，分別測(cè)定血竭素含量，結(jié)果見圖6。

由圖可見，豬骨膠、當(dāng)歸、紅花、煅自然銅與血竭混粉對(duì)血竭素的含量測(cè)定結(jié)果影響較小；醋乳香、醋沒藥與血竭混粉和土鱉蟲與血竭混粉對(duì)血竭素的含量測(cè)定結(jié)果影響較大；血竭單粉后，測(cè)定前與其他藥味混合，含量測(cè)定結(jié)果的數(shù)值最高。分析原因：①醋乳香、醋沒藥與血竭均為樹脂類藥材，在粉碎過程中可能產(chǎn)生互相包裹，影響提取效率；②考慮到各藥味在處方中的占比，土鱉蟲對(duì)含量測(cè)定結(jié)果影響最大，這可能與不法商家為給土鱉蟲增重，喂食生石灰、水泥等堿性物質(zhì)有關(guān)，血竭素在堿性作用下會(huì)產(chǎn)生化學(xué)結(jié)構(gòu)變化，最終導(dǎo)致含量測(cè)定結(jié)果數(shù)值大幅下降。因此建議企業(yè)在制劑過程中血竭藥材采用單獨(dú)粉碎后再與其他藥味混料。

4 總結(jié)與討論

根據(jù)法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)和探索性研究結(jié)果，對(duì)骨折挫傷膠囊進(jìn)行較為全面的分析，從藥品安全性、有效性、穩(wěn)定性方面進(jìn)行研究，建立相關(guān)方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，整體評(píng)價(jià)骨折挫傷膠囊質(zhì)量較好，但存在檢測(cè)指標(biāo)穩(wěn)定性差、限度值有待商榷、同一企業(yè)批間差異較大、不同企業(yè)一致性不佳等問題。

針對(duì)發(fā)現(xiàn)的問題，提出以下建議：①加強(qiáng)生產(chǎn)全鏈條控制，嚴(yán)把藥材質(zhì)量，對(duì)生產(chǎn)工藝進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化，對(duì)上市后產(chǎn)品穩(wěn)定性進(jìn)行深入研究；②進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)提升，增加必要的安全性、有效性檢驗(yàn)項(xiàng)目，加強(qiáng)產(chǎn)品整體質(zhì)量控制，確保產(chǎn)品質(zhì)量。