王妍 魏松紅 王小皙 李帥 王海寧 項宗敬

摘要：廣泛收集全國各稻區(qū)主栽水稻品種98份，于2018年在遼寧省沈陽市沈陽農(nóng)業(yè)大學水稻所試驗基地，通過分蘗期田間接種帶菌高粱粒和室內(nèi)菌餅離體接種的方法，對供試水稻品種進行抗紋枯病種質(zhì)資源的篩選。田間調(diào)查采用病株率以及病情指數(shù);離體接種鑒定采用相對病斑面積進行病害分級。鑒定結(jié)果表明，離體葉片在接種紋枯菌后24～36 h內(nèi)，病斑開始出現(xiàn)差異，田間鑒定結(jié)果，水稻品種間對紋枯病的抗性有顯著差異，綜合田間接種和離體接種的結(jié)果，篩選出9份具有抗性水平的品種。

關鍵詞：種質(zhì)資源篩選;水稻;紋枯病;抗性鑒定

中圖分類號： S435.111.4+2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2020）13-0125-04

收稿日期：2019-08-15

基金項目：國家重點研發(fā)計劃（編號：2018YFD0200202）;現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設專項資金（編號：CARS-01）。

作者簡介：王妍（1988—），女，山東濟寧人，博士，講師，從事植物病原真菌學研究。E-mail：8806wy@163.com。

通信作者：魏松紅，博士，教授，從事植物病原真菌學研究。E-mail：songhongw125@163.com。紋枯病是危害水稻最嚴重的真菌性病害之一，紋枯病在我國各水稻主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，嚴重時可造成糧食減產(chǎn)達60%～70%[1-2]。隨著矮稈、多蘗品種的種植和栽培密度的增加，水稻紋枯病的危害逐漸加重，并已成為水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的嚴重障礙[3-5]。

近年來，在水稻生產(chǎn)上由于缺乏免疫和高抗的水稻品種，加之不合理的栽培模式和適宜發(fā)病的氣候條件，全國稻區(qū)紋枯病存在著大發(fā)生的可能，并且該病發(fā)生面積廣、流行頻率高，致使產(chǎn)量損失甚至超過稻瘟病。因此，需加強對水稻紋枯病抗病遺傳育種研究，提高水稻抗病性，降低發(fā)病帶來的危害。本試驗在遼寧省沈陽市對國內(nèi)部分水稻主推品種進行田間接種和離體接種，以期篩選抗病品種，為水稻遺傳育種提供良好的抗源和理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試品種及來源

抗性鑒定試驗于2018年在沈陽農(nóng)業(yè)大學水稻所試驗基地進行。供試品種由沈陽農(nóng)業(yè)大學提供，其中秈稻42份、粳稻56份，另設對照品種日本晴。

1.2紋枯病抗性鑒定方法

1.2.1水稻種植在沈陽農(nóng)業(yè)大學水稻所試驗基地設置抗病鑒定圃，供試品種插植3行，作為1個小區(qū)，每行10叢，行距為30 cm、株距為16 cm，2次重復。在水稻全生育期田間管理措施參照當?shù)厣a(chǎn)田的標準進行，保持適當水層和施用氮肥，不噴施殺菌劑。

將供試的種子置于培養(yǎng)皿中進行浸種發(fā)芽，第3天挑發(fā)芽的種子點播于后山溫室。在水稻分蘗時期，選取健壯長勢一致的葉片，剪取完全展開的倒2葉，接種紋枯病菌。

1.2.2活體接種方法接種體為立枯絲核菌 AG1-IA菌絲融合群，由沈陽農(nóng)業(yè)大學水稻病害研究室提供。將菌株移到PDA培養(yǎng)基的正中央，菌絲面朝上，蓋上皿，置于人工培養(yǎng)箱溫度為28 ℃條件下培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)好的病原菌，無菌條件下在菌落邊緣打孔，獲取直徑為5 mm的菌碟，為下一步接種做準備。將高粱粒浸泡24 h，沖洗干凈后裝入250 mL的三角瓶中，裝入的高粱粒占瓶體積的1/3，高壓滅菌，待冷卻后將5 mm的菌餅接種于裝有高粱粒的三角瓶中，在培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)7～10 d，搖動1～2/d，待高粱粒表面長滿菌絲后作為接種物備用。接種時間為水稻分蘗期。

接種時將水稻葉鞘輕輕扒開，使用鑷子將高粱粒送入扒開的葉鞘內(nèi)，之后輕纏1圈保鮮膜固定并保濕，接種后再將葉鞘復原。接種部位為稻株莖稈自上而下第3葉鞘內(nèi)側(cè)，每個稻株接種1個莖稈，每個品種接種10株，共3次重復。接種后3、7、11 d分別進行病情調(diào)查，調(diào)查標準為主莖稈病斑長度，抽穗后30 d進行病級調(diào)查。

1.2.3離體接種方法培養(yǎng)基中放入濾紙，加入0.5% 6-BA，剪取葉片的中間部分，4～5 cm，平鋪在培養(yǎng)基上，葉片背面緊貼濾紙。接種體為立枯絲核菌AG1-IA菌絲融合群。將菌株移到PDA培養(yǎng)基的正中央，菌絲面朝上，蓋上皿，置于人工培養(yǎng)箱28 ℃培養(yǎng)48 h。待菌絲長滿培養(yǎng)皿時，用已滅菌的打孔器在含紋枯菌的培養(yǎng)皿邊緣部分，制取直徑為5 mm帶菌絲的PDA瓊脂塊，將菌塊置于離體葉片中間部位，帶菌絲的一面緊貼葉片正面，置溫度為28 ℃條件下培養(yǎng)。每個培養(yǎng)皿作為1個接種重復，試驗重復3次，每次重復取3個相同品種的離體葉片組織，接種3個帶菌瓊脂塊。無菌瓊脂塊接種相同水稻材料，作為對照。接種時期為水稻分蘗期的葉片，調(diào)查從侵染初期（一般接種后24～36 h）開始，當感病對照品種剛出現(xiàn)病斑時，每隔12 h記錄1次品種的病斑數(shù)和病斑的長度（十字交叉法），最后1次調(diào)查時間為接種后4 d。

1.3病害調(diào)查方法

1.3.1田間接種調(diào)查水稻紋枯病調(diào)查方法及病情分級參照《水稻抗紋枯病鑒定技術(shù)規(guī)范》（NY/T 2720—2015）。根據(jù)病情癥狀，記載單株病情級別，計算病株率和病情指數(shù)（DI）。

1.3.2離體接種調(diào)查嚴重度分級標準的方法，按照相對病斑面積，作為衡量病害嚴重程度的評價指標。計算公式為：相對病斑面積=病斑面積/葉片面積。分級標準具體如下：

0級：無病;

1級：病斑面積占葉片面積的1/8以下;

2級：病斑面積占葉片面積的1/8～1/4（不包括1/4）;

3級：病斑面積占葉片面積的1/4～1/2（不包括1/2）;

4級：病斑面積占葉片面積的1/2～3/4（不包括3/4）;

5級：病斑面積占葉片面積的3/4及以上。

1.4抗性評價

田間成株期水稻材料3次重復的病情指數(shù)（DI）的平均值確定其抗病性水平，劃分標準參照國家行業(yè)標準《水稻抗紋枯病鑒定技術(shù)規(guī)范》（NYT 2720—2015）。

2結(jié)果與分析

2.1不同水稻品種田間的紋枯病抗性鑒定

2018年，對全國98份水稻品種資源進行了紋枯病抗性田間接種鑒定，并且通過病情指數(shù)和病株率來評價品種的紋枯病抗性，部分品種的抗病性鑒定結(jié)果見表1，綜合評價結(jié)果表明，對紋枯病表現(xiàn)高抗水平的有2個，占供試品種的2%，這2個品種為中日萬優(yōu)8號、深兩優(yōu)5814;表現(xiàn)抗病的有8個，占供試品種的8.2%，代表品種有鐵粳20等;表現(xiàn)中抗水平的品種有5個，占供試品種的5.1%，代表品種有宜香優(yōu)2115等;在上述鑒定的主栽品種中，表現(xiàn)感病的品種數(shù)目較多，占供試品種的84.7%。

2.2不同水稻品種離體葉片對紋枯病室內(nèi)抗性鑒定

為了檢測98份水稻品種對紋枯病菌的抗感程度，剪取分蘗期水稻植株長勢一致的葉片組織，背面朝上緊貼在水瓊脂上，分別接種含有紋枯病菌株Y-36的PDA瓊脂塊，于溫度為28 ℃條件下恒溫箱中培養(yǎng)。在接種后24 h開始觀察，每12 h觀察1次，根據(jù)不同品種的葉片出現(xiàn)面積大小不等的紋枯病病斑進行分級（表2）。在接種4 d觀察，不同品種的葉片出現(xiàn)面積大小不等的紋枯病病斑。抗病品種葉片大部分保持青綠色，病斑面積較小;感病品種的葉色發(fā)黃，病斑蔓延葉片1/2以上。鑒定結(jié)果顯示，接種24 h時，有9份材料病級表現(xiàn)0級，36份材料表現(xiàn)為1級，42份材料表現(xiàn)為2級，11份材料表現(xiàn)為3級;接種36 h時，有7份材料表現(xiàn)1級，55份材料表現(xiàn)為2級，26份材料表現(xiàn)為3級，10份表現(xiàn)為4級;接種48 h時，有2份材料表現(xiàn)為1級，有9份材料表現(xiàn)為2級，23份材料表現(xiàn)為3級，48份材料為4級，16份材料為5級;接種后96 h，有9份材料表現(xiàn)為2級，分別為中日萬優(yōu)8號、深兩優(yōu)5814、甬優(yōu)538、甬優(yōu)1540、鐵粳20、甬優(yōu)9號、云粳39、龍粳28、川谷優(yōu)208。

3結(jié)論與討論

3.1水稻對紋枯病的抗性鑒定方法

水稻對紋枯病的抗性屬于典型的數(shù)量性狀，完善水稻紋枯病的抗性鑒定體系，對于培育抗病品種，開展抗病遺傳育種研究至關重要。目前已報道的鑒定方法有離體葉片接種法[6]、田間接種法[7]、苗期微室接種法[8]、 苗期快速鑒定[9]等方法。采用田間接種與離體接種相結(jié)合的方法，篩選表現(xiàn)抗性一致的品種， 試驗結(jié)果具有重復性和可靠性。本試驗在接種方法上進行了優(yōu)化，接種時期選取的水稻分蘗盛期，根據(jù)前期報道的牙簽接種法[10]，本試驗在進行田間接種時選擇將帶菌的高粱粒嵌于水稻葉鞘內(nèi)部，通過纏繞保鮮膜加以固定保濕，從而保證了發(fā)病所需的條件。該方法接種率高，發(fā)病重，為當?shù)厮炯y枯病的接種抗性鑒定提供了研究基礎。

3.2水稻紋枯病的抗源篩選

前人的研究表明，水稻紋枯病的發(fā)生受株高、種植密度的影響[11]，品種間普遍抗性差異大[12]，因此挖掘抗源對水稻紋枯病的防治十分重要。由于紋枯病菌寄主范圍廣，腐生性強，篩選高抗品種具有一定的難度。黃雯雯等采用溫室苗期接種技術(shù)對安徽省87個水稻品種（組合）進行了紋枯病抗性鑒定。結(jié)果表明，僅有3個組合表現(xiàn)抗病[13]。蘭波等在322份江西水稻種質(zhì)資源中篩選出8個品種對紋枯病表型抗病[14]。2001—2005年，對江蘇省808份水稻區(qū)試和預試品種（系）進行稻瘟病、白葉枯病和紋枯病的抗性鑒定結(jié)果表明，大部分水稻品種（系）對紋枯病的抗性較差[15]。左示敏等從299份水稻品種中篩選到7份抗病新品種[16]，張舒等選用88份湖北省主栽水稻品種，在自然誘發(fā)條件下篩選抗紋枯病品種13份[17]。

本研究2018年的田間抗性鑒定結(jié)果，在全國收集的98份水稻種質(zhì)資源中，15個水稻品種對紋枯病表現(xiàn)抗性，占15.3%。離體接種鑒定結(jié)果表明，在16份抗病材料中，有9個品種接種4 d后仍然較抗病，這品種分別為中日萬優(yōu)8號、深兩優(yōu)5814、甬優(yōu)538、甬優(yōu)1540、鐵粳20、甬優(yōu)9號、云粳39、龍粳28、川谷優(yōu)208。參試的絕大多數(shù)品種對紋枯病表現(xiàn)為感病或者中度感病，說明其對水稻紋枯病的抗性普遍較差。對紋枯病表現(xiàn)高感或者感病的，適宜在紋枯病發(fā)病較輕的地區(qū)推廣種植，對紋枯病表現(xiàn)中抗的，根據(jù)當?shù)厍闆r適量地在紋枯病發(fā)病較輕的地區(qū)推廣種植。本研究為以上品種在生產(chǎn)種植時的合理布局提供了參考依據(jù)。參考文獻：

[1]張優(yōu)，魏松紅，王海寧，等. 東北地區(qū)水稻紋枯病菌遺傳多樣性和致病性分析[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學學報，2017，48（1）：9-14.

[2]左示敏，殷躍軍，張麗，等. 水稻抗紋枯病QTL qSB-11的育種價值及其進一步定位[J]. 中國水稻科學，2007，21（2）：136-142.

[3]Fleet N L. Rice sheath blight：a major rice disease[J]. Plant Disease，1983，67（7）：829-832.

[4]Zheng A P，Lin R M，Zhang D H，et al. The evolution and pathogenic mechanisms of the rice sheath blight pathogen[J]. Nature Communications，2013，4（1）：1424.

[5]張強，劉祥臣，余貴龍，等. 不同濃度阿泰靈對再生稻兩優(yōu)6326秧苗素質(zhì)和紋枯病抗性及產(chǎn)量的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2019，47（15）：130-133.

[6]馬晨燕，袁正杰，楊海河，等. 水稻離體葉片抗紋枯病接種方法的研究[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學報，2016，28（10）：1730-1737.

[7]左示敏，張亞芳，殷躍軍，等. 田間水稻紋枯病抗性鑒定體系的確立與完善[J]. 揚州大學學報（農(nóng)業(yè)與生命科學版），2006，27（4）：57-61.

[8]徐國娟，袁正杰，左示敏，等. 水稻苗期紋枯病抗性鑒定微室接種技術(shù)的改良[J]. 中國水稻科學，2015，29（1）：97-105.

[9]王子斌，左示敏，李剛，等. 水稻抗紋枯病苗期快速鑒定技術(shù)研究[J]. 植物病理學報，2009，39（2）：174-182.

[10]潘學彪，陳宗祥，徐敬友，等. 不同接種調(diào)查方法對抗水稻紋枯病遺傳研究的影響[J]. 江蘇農(nóng)學院學報，1997，18（3）：28-33.

[11]朱永生，謝鴻光，陳錦文，等. 水稻紋枯病鑒定方法改良與品種抗性評價[J]. 植物保護學報，2009，36（6）：567-568.

[12]劉永峰，陳志誼，吉健安，等. 江蘇省水稻主栽及區(qū)試品種對水稻紋枯病的抗性分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2006（1）：27-28，41.

[13]黃雯雯，王玲，劉連盟，等. 安徽省部分水稻品種（組合）對紋枯病的苗期抗性評價[J]. 中國稻米，2011，17（1）：21-24.

[14]蘭波，李湘民，王政逸，等. 江西省水稻種質(zhì)資源對紋枯病的抗性評價[J]. 中國稻米，2011，17（3）：9-10.

[15]陳志誼，劉永鋒，吉健安，等. 2001—2005年江蘇省水稻區(qū)試品種（系）抗病性鑒定和評價[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報，2006，22（4）：384-387.

[16]左示敏，陳天曉，鄒杰，等. 水稻不同類群品種間的紋枯病抗性評價和抗病新種質(zhì)篩選[J]. 植物病理學報，2014，44（6）：658-670.

[17]張舒，陳其志，呂亮，等. 自然誘發(fā)條件下湖北省水稻主栽品種對稻瘟病、紋枯病的抗性鑒定[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學學報，2006，25（3）：236-240.朱新偉，李建偉，劉寶平，等. 新型農(nóng)藥減施技術(shù)對水稻病蟲害防控效果及效益分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2020，48（13）：129-133.doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2020.13.026