劉艷艷 曹婷 劉興華 嚴(yán)國紅

摘要：為明確Pi-ta和Pi9稻瘟病抗性主效基因在32份粳稻骨干親本中的分布狀況，利用抗稻瘟病基因Pi-ta和Pi9的分子標(biāo)記對32份粳稻骨干親本進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，在32份骨干親本中，Pi-ta抗性基因檢出率為 46.88%，Pi9抗性基因檢出率為12.50%，同時(shí)檢測到Pi-ta和Pi9抗病基因，檢出率為3.12%，不含有Pi-ta和Pi9抗病基因的材料占比為43.75%。在骨干親本中，Pi-ta單個基因的檢出率較高，Pi9單個基因的檢出率較低，同時(shí)含有Pi-ta和Pi9抗病基因的材料較少，因此可見，多個抗稻瘟病基因的聚合育種是今后水稻抗病育種的重點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：水稻;稻瘟病;Pi-ta;Pi9;分子檢測;抗性基因

中圖分類號： S511.2+20.1;S435.111.4+1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2020）13-0069-03

收稿日期：2019-08-12

基金項(xiàng)目：江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所基金（編號：YHS201610）。

作者簡介：劉艷艷（1990—），女，山東日照人，碩士，助理研究員，主要從事水稻育種及抗病性研究。E-mail：1052233980@qq.com。

通信作者：嚴(yán)國紅，研究員，主要從事水稻遺傳育種研究。E-mail：2376308693@qq.com。水稻（Oryza sativa）作為世界上重要的糧食作物之一，為全球超過1/2的人口提供糧食來源[1]。由稻瘟病病菌（Magnaporthe grisea）引起的稻瘟病是水稻生產(chǎn)中最具有毀滅性的病害，在我國幾乎所有水稻栽培地區(qū)都有稻瘟病害的發(fā)生，尤其是在南方稻區(qū)，曾多次出現(xiàn)稻瘟病大面積暴發(fā)事件，對我國的糧食生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響[2-3]。病原菌的生理小種多、變異強(qiáng)，能夠在短時(shí)間內(nèi)適應(yīng)水稻抗病品種（系）的遺傳抗性，導(dǎo)致很多抗病水稻品種（系）無法持久抗病，推廣種植數(shù)年后就導(dǎo)致抗性減弱或完全喪失。因此，利用抗病基因選育稻瘟病抗性品種是防治稻瘟病的有效手段[4]。在傳統(tǒng)水稻育種中，主要通過雜交系選結(jié)合抗病表型鑒定最終選育含有目標(biāo)抗性的品種，依賴于育種者的育種經(jīng)驗(yàn)，往往容易造成誤差，導(dǎo)致抗性基因丟失，選擇效率低且周期長[5]。因此，利用分子生物學(xué)技術(shù)明確主栽品種和新選育品種的基因型，同時(shí)結(jié)合傳統(tǒng)育種手段，是抗病品種科學(xué)應(yīng)用的前提。

迄今，水稻所有染色體上至少有69個抗稻瘟病位點(diǎn)被報(bào)道，包含84個主效基因，其中30多個抗稻瘟病基因已經(jīng)被克隆[6]。許多與抗稻瘟病基因連鎖的分子標(biāo)記被開發(fā)，Pi-ta是最早被克隆出來的抗稻瘟病基因之一，位于水稻第12號染色體靠近著絲點(diǎn)附近的區(qū)域，包含2個外顯子和1個長度為 1 463 bp 的內(nèi)含子，編碼1個長度為928個氨基酸的細(xì)胞質(zhì)膜受體蛋白，其分子標(biāo)記也相繼被開發(fā)并廣泛應(yīng)用于水稻抗稻瘟病分子育種中[7]。水稻抗稻瘟病基因Pi9來源于小粒野生稻，Qu等克隆了Pi9抗稻瘟病基因，并將該基因定位在水稻第6號染色體上，結(jié)果表明，接種多個稻瘟病病菌生理小種后表現(xiàn)出較高的抗性[8]。華麗霞等利用PCR技術(shù)及電泳檢測技術(shù)成功研發(fā)了稻瘟病抗性基因Pi2、Pi9及Piz-t的分子標(biāo)記[9]。由此可見，利用水稻抗稻瘟病主效抗性基因Pi9的分子標(biāo)記，有助于改良水稻對稻瘟病的抗性[10]。

本研究利用Pi-ta和Pi9抗病基因功能性分子標(biāo)記，對32份粳稻育種骨干親本進(jìn)行抗稻瘟病基因型檢測，旨在明確骨干親本的抗病基因型，為下一步選育新的抗稻瘟病品種組合提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)地點(diǎn)與材料

供試材料于2017年春季播種于江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所南洋試驗(yàn)農(nóng)場（120°14′E，33°25′N）。供試材料為32份粳稻育種骨干親本，由江蘇沿海地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所提供，詳見表1，其中已經(jīng)審定的品種為科騰稻2號、泗稻2333、云粳稻1號、鹽稻9號、揚(yáng)育粳2號、蘇10-100、鹽稻1333和徐稻3號，其余材料為穩(wěn)定的水稻品系。

1.2稻瘟病抗性基因Pi-ta和Pi9的分子標(biāo)記

稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi9引物序列參照高利軍等的研究結(jié)果[11]，引物名稱、序列及其目的擴(kuò)增片段長度等信息見表2，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3稻瘟病抗性基因Pi-ta、Pi9的檢測

采用十二烷基三甲基溴化銨（CTAB）方法提取水稻基因組DNA。以基因組DNA為模板進(jìn)行基因片段擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系參照范方軍等的方法[12]。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，用溴化乙錠染色，隨后在紫外凝膠成像儀上觀察并照相。

2結(jié)果與分析

2.1抗性基因Pi-ta的分子檢測

用抗稻瘟病基因Pi-ta的特異性引物對32份供試粳稻材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增。圖1中的M為TaKaRa公司生產(chǎn)的DL2000 DNA marker，1～32對應(yīng)表1中的品種（品系）。由圖1可以看出，有15個水稻品種（品系）擴(kuò)增出1條稍大于1 000 bp的特異性條帶，分別是南粳5840、鎮(zhèn)稻449、科騰稻2號、淮粳1309、泗稻2333、淮780、云粳稻1號、皖墾粳218、鹽稻13180、揚(yáng)育粳2號、蘇10-100、寧3817、連粳15214、揚(yáng)輻粳5208、浙粳20，表明所用水稻品種（品系）中含有抗稻瘟病基因Pi-ta。攜帶Pi-ta抗性基因的水稻品種（品系）約占32份水稻品種（品系）的46.88%，說明Pi-ta抗性基因已經(jīng)在水稻骨干親本中廣泛存在。

2.2抗性基因Pi9的分子檢測

用抗稻瘟病基因Pi9特異性引物對32份供試粳稻材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，圖2中的M為TaKaRa公司生產(chǎn)的DL1000 DNA marker，1～32對應(yīng)表1中的品種（品系）。由圖2可以看出，只有4個水稻品種（品系）擴(kuò)增出大小為291 bp的特異性條帶，分別是江稻159、蘇10-100、鹽稻1333、徐稻3號。攜帶 Pi9 抗性基因的水稻品種（品系）占32份水稻品種（品系）的12.50%，說明Pi9抗性基因在水稻骨干親本中的應(yīng)用較少，應(yīng)該加大對抗性基因Pi9的利用。

2.3抗性基因Pi-ta和Pi9的分布

由表3可以看出，在32份骨干親本中，Pi-ta抗性基因的檢出率為46.88%，Pi9抗性基因的檢出率為12.50%，同時(shí)檢測到Pi-ta和Pi9抗病基因的比例為3.12%，沒有檢測到Pi-ta和Pi9抗病基因的比例為43.75%。在骨干親本中，Pi-ta單個基因的檢出率較高，Pi9單個基因的檢出率較低，同時(shí)含有Pi-ta和Pi9抗病基因的材料較少。因此，在以后的水稻抗病育種中，應(yīng)該加強(qiáng)多個抗稻瘟病基因的聚合利用。

3討論與結(jié)論

傳統(tǒng)的水稻抗病育種主要依靠水稻品種在田間的發(fā)病程度進(jìn)行篩選，這種育種方法耗時(shí)費(fèi)力，而且容易受到環(huán)境的影響。稻瘟病病菌具有多個生理小種，且變異速度較快，一些抗病水稻品種推廣 2～3年后表現(xiàn)出抗病性逐漸喪失的現(xiàn)象，因此，明確品種本身的抗性基因型對于品種的抗性改良尤為重要。隨著抗稻瘟病基因的克隆及分子標(biāo)記的開發(fā)，通過分子標(biāo)記輔助選擇檢測水稻是否含有抗病基因，合理選擇適宜在不同生態(tài)地區(qū)種植的抗性品種的方法，因具有準(zhǔn)確、快速且不受環(huán)境影響等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于育種實(shí)踐中。

近年來，國內(nèi)外學(xué)者相繼對水稻品種的抗瘟基因型開展了研究。張銀霞等利用Pi-ta、Pi-b、Pi9對寧夏水稻種質(zhì)資源進(jìn)行了檢測，為寧夏水稻分子標(biāo)記輔助育種奠定了基礎(chǔ)[13]。王軍等研究發(fā)現(xiàn)，Pi-ta和Pi-b基因的聯(lián)合效應(yīng)與穗頸瘟抗性呈正相關(guān)，并且這種相關(guān)性比2個基因單獨(dú)存在時(shí)與穗頸瘟抗性的相關(guān)性要緊密[14]。王生軒等研究發(fā)現(xiàn)，在河南地區(qū)，水稻稻瘟病抗病基因Pi9和Piz-t在育種中利用得較為廣泛，Pi-ta利用得較少，今后河南省在水稻育種工作中應(yīng)加強(qiáng)廣譜稻瘟病抗性基因的聚合育種和綜合利用[15]。馬繼瓊等研究發(fā)現(xiàn)，貴州禾通過長期的人工和自然選擇，Pi5和Pi-kh基因頻率相對較高，而Pi9和Pi2頻率較低[16]。范方軍等研究發(fā)現(xiàn)，Pi-ta、Pi-b、Pi54是水稻育種中重要的抗稻瘟病基因，表明抗稻瘟病基因Pi-ta和Pi-b與穗頸瘟抗性存在顯著相關(guān)性[12]。鄒德堂等研究發(fā)現(xiàn)，在黑龍江地區(qū)水稻抗稻瘟病基因Pi9具有很高應(yīng)用價(jià)值，含有Pi9基因的材料，苗期和分蘗期的平均發(fā)病級別均為2.4級，不含有Pi9基因的材料，苗期和分蘗期的平均發(fā)病級別分別為5.1級和5.4級[17]。在本研究中，Pi-ta檢出率為46.88%，Pi9的檢出率為12.50%，因此在今后的育種中，可以適當(dāng)加強(qiáng)對Pi9基因的利用。

本研究中，骨干親本廣譜抗病基因Pi9在供試材料中分布得較少，抗性資源沒有得到充分利用。因此，在以后的育種實(shí)踐中，可以利用遺傳多樣性的方法對稻瘟病進(jìn)行防治，將不同類型的抗稻瘟病品種種植在同一地區(qū)，這樣可以避免抗稻瘟病品種在種植2～3年后其抗性逐漸喪失的現(xiàn)象，從而延長抗性品種的使用年限。此外，在后續(xù)研究中，應(yīng)聚合不同抗性基因來提高抗性，避免單一抗病基因喪失。

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