龍 紅, 牛 熙, 黃世會(huì), 冉雪琴, 王嘉福

貴州大學(xué)農(nóng)業(yè)生物工程研究院/貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院， 貴州 貴陽(yáng) 550025

三磷酸腺苷(ATP)是由腺嘌呤、核糖及3個(gè)磷酸基團(tuán)連接組成，水解時(shí)釋放大量能量，是生物體內(nèi)最直接的能量來(lái)源。在產(chǎn)能代謝過(guò)程中，微生物可通過(guò)底物水平磷酸化和氧化磷酸化將有機(jī)物分解或無(wú)機(jī)物氧化過(guò)程中釋放的能量?jī)?chǔ)存在ATP分子中，用于DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和蛋白合成等生理過(guò)程[1]。當(dāng)胞內(nèi)的線粒體異常和氧化磷酸化途徑受損時(shí)，底物水平磷酸化可發(fā)揮其作用彌補(bǔ)ATP的合成。但生命活動(dòng)所需能量主要來(lái)源于氧化磷酸化，這種方式合成的ATP約占總數(shù)的95%。[2-4]。氧化磷酸化途徑由電子傳遞鏈(electron transport chain,ETC)和磷酸化兩部分構(gòu)成，電子通過(guò)ETC產(chǎn)生跨膜的質(zhì)子梯度即質(zhì)子動(dòng)勢(shì)，用于驅(qū)動(dòng)ATP合酶合成ATP[5]。

錳是生物體不可缺少的微量元素之一[6]。錳過(guò)氧化氫酶[7]、錳超氧化物歧化酶[8]以及磷酸化酶等都需要錳作為輔因子，參與細(xì)菌能量代謝和抗氧化等重要生理過(guò)程[9]。當(dāng)環(huán)境中的錳過(guò)量導(dǎo)致細(xì)菌胞內(nèi)錳過(guò)剩，則會(huì)引發(fā)錳毒害作用。研究表明錳脅迫時(shí)，可導(dǎo)致線粒體的能量代謝失活[10，11]，細(xì)胞內(nèi)的ATP水平降低，并證明能量不足是發(fā)生錳毒害的主要原因[12]。ATP合成酶在氧化磷酸化中起核心作用，細(xì)菌的ATP合成酶由膜內(nèi)的疏水結(jié)構(gòu)域F0和膜外可溶的親水頭部F1兩部分組成，F(xiàn)0具有質(zhì)子運(yùn)輸功能，將質(zhì)子傳遞給二磷酸腺苷(ADP)和無(wú)機(jī)磷酸鹽(Pi)在F1中合成ATP結(jié)合[13-15]。F1的α3、β3和γ亞基由atpA、atpD和atpG編碼[16]。α亞基是ATP合成酶的催化結(jié)構(gòu)域，敲除atpA基因使ATP生成量下降，抑制大腸桿菌的呼吸作用[17]。敲除M.smegmatis的atpD基因，不僅引起ATP合成量下降、呼吸減慢，同時(shí)生物膜減少[18]。分枝桿菌的蛋白組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，atpG對(duì)細(xì)胞存活起至關(guān)重要的作用[19]。細(xì)胞色素bc1氧化酶和細(xì)胞色素C氧化酶是電子傳遞鏈的兩個(gè)末端氧化酶，是電子傳遞鏈中的關(guān)鍵酶，細(xì)胞色素bc 1氧化酶亞單位由qcrB基因編碼，細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ由ctaD基因編碼[20，21]。這些基因控制著細(xì)菌的氧化磷酸化過(guò)程。

我們從錳礦土壤中分離到一株沙福芽孢桿菌S7，其耐錳能力高達(dá)2 200 mg/L[22]。本文選擇耐錳菌株S7，研究錳脅迫條件下，ATP合成酶和細(xì)胞色素亞基編碼基因的時(shí)序性變化，從能量代謝角度解析細(xì)菌對(duì)錳脅迫的應(yīng)答機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 菌株

該菌株S7是分離于貴州省松桃自治縣錳礦土壤，經(jīng)鑒定為沙福芽孢桿菌[21]。

1.2 培養(yǎng)基、試劑和培養(yǎng)條件

PYCM培養(yǎng)基：胰蛋白胨0.8 g，酵母粉0.2 g，K2HPO40.1 g，MgSO4.7H2O 0.2 g，NaNO30.2 g，CaCL20.1 g，(NH4)2CO30.1 g，蒸餾水1 L，調(diào)節(jié)pH為6.8～7.0，固體培養(yǎng)基加2%瓊脂粉。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 L，固體培養(yǎng)基加1.5%瓊脂粉。1×105Pa滅菌20 min。

MnCl2·4H2O溶于滅菌的三蒸水，配制濃度為505 mmol/L的溶液，以0.22 μm孔徑的微孔濾膜過(guò)濾除菌，4 ℃冰箱保存。將1 mol/L HEPES稀釋100倍，調(diào)節(jié)pH為8.0左右，以0.22 μm孔徑的微孔濾膜過(guò)濾除菌，-20 ℃冰箱存放。稱(chēng)取0.04 g LBB粉末溶解于250 μL冰乙酸中，再加水定容至100 mL，需避光保存于4 ℃冰箱。

S7菌株活化，涂布于PYCM固體平板，28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)，挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，以1%的接種量加入200 mL PYCM液體培養(yǎng)基。

1.3 液體中Mn(Ⅱ)氧化定量

KMnO4標(biāo)準(zhǔn)曲線法[23]可定量測(cè)定菌株的錳氧化活性，配制1 mmol/L的KMnO4母液，將其稀釋成12個(gè)等濃度梯度的溶液，分別取以上稀釋液50 μL于EP管中，再加入250 μL LBB試劑，均勻混合，避光反應(yīng)30 min。取200 μL反應(yīng)混合物于96孔板中，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD620的吸光值。以KMnO4濃度為橫坐標(biāo)，OD620值為縱坐標(biāo)制作KMnO4標(biāo)準(zhǔn)曲線，公式為y=5.404 2x+0.126 9。測(cè)待測(cè)樣品的OD620吸光值，在KMnO4標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算對(duì)應(yīng)的KMnO4濃度，該濃度值的2.5倍就是MnO2的濃度，再除以培養(yǎng)的時(shí)間最終得到該菌對(duì)Mn(Ⅱ)的氧化活性。

將沙福芽孢桿菌接種到250 mg/L Mn (II)的液體培養(yǎng)基中, 28 ℃，180 r/min，培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)基中出現(xiàn)棕褐色沉淀，取1 mL 菌液離心, 去上清,加入50μLHEPES懸浮菌液，再加入250 μL LBB試劑。將體系置于25 ℃暗處反應(yīng) 30 min，設(shè)置3個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.4 固體平板Mn(Ⅱ)氧化定性

在分別含Mn (II)濃度為0 mg/L和250 mg/L的PYCM固體培養(yǎng)基中均勻涂板，28 ℃倒置培養(yǎng)7 d，用LBB指示劑噴灑培養(yǎng)基表面，若為陽(yáng)性菌株則呈藍(lán)色，陰性菌株無(wú)色。

1.5 RT-qPCR

以沙福芽孢桿菌(BacillussafensisKTCC)的全基因組序列為模板，設(shè)計(jì)5個(gè)基因的特異性引物(表1)。提取細(xì)菌總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到目的基因片段，連接pGEM-T Easy載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，于50 mg/L氨芐青霉素的固體LB平板篩選陽(yáng)性克隆，提取測(cè)序正確的克隆菌株質(zhì)粒，以10倍梯度稀釋作為DNA模板，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算擴(kuò)增效率。RT-qPCR的擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性，15 min；95 ℃變性，10 s；63 ℃，30 s；40個(gè)循環(huán)數(shù)；溶解曲線的設(shè)置為95 ℃，15 s，55 ℃，15 s，95 ℃，0.5 s。以16S rRNA為內(nèi)參基因[24]，采用2-ΔΔCt方法[25]計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。為減少樣品之間的誤差，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次。

表1 RT-qPCR引物

2 結(jié)果

2.1 沙福芽孢桿菌的錳氧化活性及變化

在固體氧化測(cè)定中，經(jīng)過(guò)LBB試劑的顯色反應(yīng)，金色葡萄球菌的平板顯些許淡藍(lán)色，而沙福芽孢桿菌的平板則呈明顯深藍(lán)色(圖1)，說(shuō)明沙福芽孢桿菌較金色葡萄球菌具有強(qiáng)的錳氧化作用。為進(jìn)一步測(cè)定沙福芽孢桿菌的錳氧化活性，利用LBB試劑能特異性結(jié)合Mn(IV)和Mn(III)這一特點(diǎn)(圖2)，通過(guò)高錳酸鉀標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量測(cè)定，最后計(jì)算得到MnO2的濃度的平均值為23.25 μmol/L，該菌株的錳氧化活性約為7.75 μmol/(L·d)。為進(jìn)一步證實(shí)沙福芽孢桿菌的錳氧化特性，將無(wú)錳培養(yǎng)和有錳培養(yǎng)的沙福芽孢桿菌做掃描電鏡(SEM)，結(jié)果顯示無(wú)錳培養(yǎng)的沙福芽孢桿菌表面光滑，而有錳培養(yǎng)的沙福芽孢桿菌表面則附著明顯的錳氧化物(圖3)。經(jīng)過(guò)以上試驗(yàn)佐證，證實(shí)沙福芽孢桿菌確實(shí)為錳氧化細(xì)菌且具有錳氧化能力。錳氧化物的變化曲線則顯示沙福芽孢桿菌在0 h～4 h之間沒(méi)有發(fā)生錳氧化，4 h ～16 h之間發(fā)生劇烈的變化，8 h達(dá)到峰值，而之后下降，16 h后又回升(圖4)。說(shuō)明沙福芽孢桿菌的錳氧化(錳耐受)不是一個(gè)固定不變的進(jìn)程，而是具有時(shí)序性變化的。

1：LBB原液對(duì)照；2：沙福芽孢桿菌；3：沙福芽孢桿菌+Mn(Ⅱ)

圖4 錳氧化物含量變化

2.2 基因的擴(kuò)增及測(cè)序

以沙福芽孢桿菌cDNA為模板，經(jīng)擴(kuò)增，分別獲得123、133、113、150、108 bp基因片段，經(jīng)克隆測(cè)序，與BacillussafensisKCTC參考基因組比對(duì)，各基因測(cè)定序列與參考基因組序列的相似性均為100%。

2.3 克隆菌株的構(gòu)建與表達(dá)

提取qcrB、ctaD、atpA、atpD、atpG5和16S rRNA6個(gè)基因的陽(yáng)性克隆菌株的質(zhì)粒, 梯度稀釋8倍, 以質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)展，繪制6個(gè)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見(jiàn)表2, 6個(gè)基因的線性關(guān)系數(shù)(R2)范圍在0.992～0.998之間，具有較好的線性關(guān)系。擴(kuò)增效率均在90%～110%之間，符合RT-qPCR對(duì)擴(kuò)增效率要求，說(shuō)明6個(gè)基因的擴(kuò)增效率好，有利于進(jìn)行下一步上樣試驗(yàn)。

根據(jù)沙福芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線[26]，結(jié)合細(xì)菌20 min就能繁殖一代的生理習(xí)性。設(shè)置培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)為0.3 h、0.6 h、1 h、4 h、8 h、16 h和32 h，錳作用濃度設(shè)置為0 mg/L、250 mg/L、2200 mg/L，經(jīng)定量PCR檢測(cè)，5個(gè)基因的表達(dá)量4 h前維持在低水平，4 h之后開(kāi)始上升，8 h達(dá)到峰值，16 h表達(dá)量最低，atpA基因32 h時(shí)再次達(dá)到峰值，形成雙峰趨勢(shì)(圖5～圖9)。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增效率

圖5 atpA基因的表達(dá)變化

圖6 atpD基因的表達(dá)變化

圖7 atpG基因的表達(dá)變化

圖8 qcrB基因的表達(dá)變化

圖9 ctaD基因的表達(dá)變化

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)以16S rRNA為內(nèi)參基因，研究在不同培養(yǎng)時(shí)間、不同錳脅迫條件下，qcrB、ctaD、atpA、atpD和atpG5個(gè)基因的表達(dá)情況。依據(jù)q-PCR的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)沙福芽孢桿菌在低濃度或高濃度錳脅迫下均呈現(xiàn)相似的表達(dá)模式，即5個(gè)基因的表達(dá)量在4 h前維持低水平表達(dá)且穩(wěn)定，8 h到達(dá)峰值，但在4 h ～16 h之間發(fā)生表達(dá)量的劇烈變化。

生命體內(nèi)發(fā)生的各種生理活動(dòng)都需要ATP的支持[27]。近年來(lái)對(duì)生物體受到重金屬脅迫研究中發(fā)現(xiàn)，氧化磷酸化、碳同化和三羧酸循環(huán)途徑都參與到了細(xì)胞的抗毒害活動(dòng)中，通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞恢復(fù)能量產(chǎn)生和提高能量轉(zhuǎn)化效率來(lái)解毒，證實(shí)了能量衰竭可能是造成毒害的原因[28-30]，近年來(lái)的研究證明ATP合酶基因在抗脅迫中起作用。大腸桿菌DH5α中過(guò)表達(dá)atpA基因，在一定程度上改善了菌體的生長(zhǎng)[31]。在脅迫條件下，ATP合酶的亞基增多，意味需要更多的ATP合酶將質(zhì)子輸出到胞外，達(dá)到保護(hù)細(xì)菌的目的[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，atpA基因的表達(dá)在8 h和32 h有雙峰，32 h是沙福芽孢桿菌在2 200mg/L錳脅迫下的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期點(diǎn)，在大腸桿菌過(guò)表達(dá)atpA基因也是在對(duì)數(shù)期提高菌體數(shù)量，但沒(méi)有出現(xiàn)表達(dá)的雙峰模式。研究不同pH條件下，atpD基因在兩株乳桿菌(Lp9和Lp91)的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)Lp91顯現(xiàn)更強(qiáng)的耐酸性且atpD基因的表達(dá)量高于另一菌株，表明ATP合酶可能是胃內(nèi)益生菌在遇到胃內(nèi)強(qiáng)酸環(huán)境脅迫下的耐受性中起關(guān)鍵作用，而且在不同的酸性條件下，atpD基因的表達(dá)受到正調(diào)控[33]，這與我們的試驗(yàn)結(jié)果一致，在不同錳濃度脅迫下，atpD基因的表達(dá)受到正調(diào)控。atpG基因在不同時(shí)間的脫水脅迫條件下均有表達(dá)且具有明顯變化，可能參與了砂蘚的脫水脅迫應(yīng)答。將海洋藻類(lèi)和淡水藻類(lèi)的atpG基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)入海洋藻類(lèi)atpG基因的大腸桿菌耐鹽性高于另一組，說(shuō)明該基因參與了逆環(huán)境的脅迫應(yīng)答[34，35]。qcrB常作為結(jié)核分枝桿菌耐藥性研究的藥物靶點(diǎn)，通過(guò)抑制氧化磷酸化，消耗體內(nèi)ATP儲(chǔ)存來(lái)抑制結(jié)核分枝桿菌的生長(zhǎng)[36，37]。ΔctaD菌株呈現(xiàn)較差的生長(zhǎng)性，且ΔctaD中細(xì)胞色素bc1的表達(dá)水平均低于野生型[38]。目前關(guān)于氧化磷酸化與能量代謝關(guān)系的研究，主要集中在基因的功能性研究，缺乏對(duì)基因表達(dá)的時(shí)序性研究。

微生物和動(dòng)植物受外界環(huán)境脅迫會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激，產(chǎn)生的活性氧會(huì)抑制其生長(zhǎng)[39，40]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，錳脅迫條件下，超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性在10 h前維持低水平表達(dá)，10 h后開(kāi)始上升，14 h到達(dá)峰值之后逐漸減少，到34 h又開(kāi)始有上升趨勢(shì)[26]。推斷細(xì)菌在錳脅迫下，前8 h受到氧化應(yīng)激的抑制作用，而此時(shí)細(xì)菌內(nèi)超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性較低，不能抵消活性氧的毒害，增加ATP合成量，可能用于外排錳，以減少錳對(duì)細(xì)胞內(nèi)蛋白的毒害作用，5個(gè)基因在此階段表達(dá)上調(diào)。在10 h ～14 h，超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶的活性急劇提升大約3倍，降低了胞內(nèi)的氧自由基的毒害作用。此時(shí)細(xì)菌不需要更多的ATP來(lái)抵抗氧化應(yīng)激，對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)5個(gè)基因的表達(dá)急劇下降。研究結(jié)果表明，耐錳菌沙福芽孢桿菌S7的能量代謝水平隨著作用時(shí)間和濃度的提高而上升，以產(chǎn)生大量的ATP應(yīng)對(duì)錳毒害作用。