曹永梅

上海旺旺食品集團(tuán)有限公司,上海 201103

食品安全是全球關(guān)注的重大問題。金黃色葡萄球菌[1]、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌以及沙門氏菌等食源性致病菌的檢出有賴于快速、高效、專一和靈敏的檢測方法[2-6]。筆者應(yīng)用自主研發(fā)的快檢試劑盒(溶液)檢測食源性致病菌。針對外部第三方客戶(以下簡稱A)使用該快速試劑盒過程中出現(xiàn)的問題，經(jīng)采用留存的同批次試劑盒和同批次樣本進(jìn)行了重復(fù)測試，得出了個(gè)別樣本和對照組出現(xiàn)的假陽性和假陰性問題的可能原因以及相應(yīng)采取的對策，從而為改進(jìn)檢測技術(shù)及試劑盒生產(chǎn)制備工藝優(yōu)化提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 材料

金黃色葡萄球菌和單核細(xì)胞增生李斯特氏菌快檢試劑盒(本實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)[7,8])。

菌種金黃色葡萄球菌CICC21600和單增李斯特菌CICC21635由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1菌種活化

1.2.1.1菌懸液制備

A根據(jù)菌種活化說明書，往菌粉中分別加入1支腦浸液，制成菌懸液，備用。本實(shí)驗(yàn)將菌種在37 ℃水浴中快速解凍，取一環(huán)菌液劃線接種平板，培養(yǎng)過夜。取已滅菌的含30%甘油營養(yǎng)肉湯10 mL于15 mL 離心管中，刮取平板上的細(xì)菌于離心管中，混勻分裝，4 ℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2接種

每種菌4個(gè)平板，每個(gè)平板接種200 μL，金黃色葡萄球菌于36 ℃、李斯特菌于30 ℃培養(yǎng)18 h～24 h，選取單個(gè)生長良好的菌落，備用。

1.2.2人工污染樣本制備

1.2.2.1培養(yǎng)基制備

液體培養(yǎng)基配制量如表1, 121 ℃ 15 min滅菌后備用。制備金黃色葡萄球菌Baird-Parker平板和血平板、李斯特氏菌顯色平板和PALCAM平板，冷藏備用。

表1 不同致病菌培養(yǎng)基種類及培養(yǎng)條件

1.2.2.2污染樣本基質(zhì)

人工染菌基質(zhì)是果凍、QQ糖、牛奶和小饅頭等四種食品, 每種所需的樣本量為5 g, 接種量見表2。

(1) 空白組不接種菌：直接將配制好的液體培養(yǎng)基分裝成4份，每份50 mL，依次加入裝有試驗(yàn)樣本的均質(zhì)袋中，拍擊混勻。

表2 不同菌的接種數(shù)

(2) 接種低濃度菌、高濃度菌：按表2將菌落分別接種到對應(yīng)培養(yǎng)基中，攪拌混勻后分裝，其余同(1)。

(3) 按表1的培養(yǎng)溫度分別培養(yǎng)18 h～24 h。

1.2.3檢測

國標(biāo)法，其中金黃色葡萄球菌按GB4789.10-2016[9]，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌按GB4789.30-2016[10]操作?？鞕z法[7,8]按照試劑盒說明書分別進(jìn)行核酸提取和擴(kuò)增檢測。陰性對照處理(kit-)呈橙色，為陰性結(jié)果，陽性對照處理(Kit+)呈熒光綠色，為陽性結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 金黃色葡萄球菌測試結(jié)果

2.1.1金黃色葡萄球菌國標(biāo)法

A實(shí)驗(yàn)中所有陰性樣本均未檢出，陽性樣本全部檢出。本實(shí)驗(yàn)陽性樣本全部檢出，但果凍I陰性對照樣本平板上長菌，其他正常，如表4國標(biāo)法。

2.1.2金黃色葡萄球菌快檢法

A實(shí)驗(yàn)的陰性樣本均未檢出，但發(fā)現(xiàn)陽性樣本只有QQ糖基質(zhì)檢出，果凍I和牛奶基質(zhì)均未檢出，重復(fù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)仍然只有QQ糖陽性樣本檢出，另兩種陽性樣本均未檢出(見表3)。

表3 A快檢法結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用快檢法的結(jié)果如表4快檢法和圖2所示，4種基質(zhì)的人工染菌陽性樣本均被檢出，QQ糖、牛奶和小饅頭基質(zhì)的陰性樣本均未檢出，然而果凍I陰性樣本(即未人工污染樣本)也被檢出，與上述國標(biāo)法檢測結(jié)果一致。

表4 金黃色葡萄球菌測試結(jié)果

2.1.3第二次重復(fù)測試

針對上述測試中，果凍I陰性對照樣本采用國標(biāo)法和快檢法同時(shí)出現(xiàn)陽性結(jié)果的問題，本實(shí)驗(yàn)對果凍I和II兩個(gè)批次果凍樣本進(jìn)行了重復(fù)測試。第二次國標(biāo)法和快檢法結(jié)果顯示，果凍I和II的陰性樣本均未檢出，陽性樣本均被檢出，如表5、圖3和圖4。

圖1 金黃色葡萄球菌國標(biāo)法結(jié)果

圖2 金黃色葡萄球菌快檢法結(jié)果

表5 金黃色葡萄球菌果凍基質(zhì)樣本重復(fù)測試結(jié)果

圖3 金黃色葡萄球菌果凍基質(zhì)樣本重復(fù)測試國標(biāo)法結(jié)果

圖4 金黃色葡萄球菌果凍基質(zhì)樣本重復(fù)測試快檢法結(jié)果

2.2 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌測試結(jié)果

2.2.1單增李斯特菌國標(biāo)法

實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表6和圖5，4種基質(zhì)所有陽性樣本均被檢出，PALCAM平板上呈小的圓形灰綠色菌落，周圍有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷[8]；李斯特顯色平板上有藍(lán)綠色菌落，菌落周圍有一不透明環(huán)。未接種陰性對照平板上不長菌，所有陰性樣本均未檢出。

表6 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌測試結(jié)果

2.2.2單增李斯特菌快檢法

A實(shí)驗(yàn)中果凍I基質(zhì)的陰性樣本和陽性樣本均被檢出，但經(jīng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)驗(yàn)證，結(jié)果顯示4種基質(zhì)所有陰性樣本均未檢出(圖6)，與上述國標(biāo)法結(jié)果一致。

圖5 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌國標(biāo)法結(jié)果

圖6 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌快檢法結(jié)果

3 討論與結(jié)論

3.1 金黃色葡萄球菌試劑盒測試果凍和牛奶陽性樣本中出現(xiàn)假陰性的原因分析

此前本實(shí)驗(yàn)室在牛奶和果凍兩種食品基質(zhì)中均曾測試成功，檢出靈敏度為1 CFU/25 g。本實(shí)驗(yàn)采用國標(biāo)法和快檢法對同批次試劑盒和同批次食品樣本的重復(fù)測試實(shí)驗(yàn)中，4種基質(zhì)陽性樣本均被檢出。

綜上，假陰性問題可能是試劑在運(yùn)輸、儲存以及實(shí)驗(yàn)過程中操作不當(dāng)造成活性降低所引起。針對試劑的運(yùn)輸和儲存環(huán)節(jié)，本實(shí)驗(yàn)室正在開展干粉化工藝優(yōu)化。針對實(shí)驗(yàn)操作中可能出現(xiàn)的問題，可以通過對試劑進(jìn)行小管分裝、干粉化等方式防止試劑活性降低。

需要注意的是，果凍I陰性樣本在本實(shí)驗(yàn)第一次測試中，國標(biāo)法和快檢法均呈陽性，但第二次重復(fù)驗(yàn)證兩批陰性樣本均未檢出。分析原因，可能是操作過程中引入了金黃色葡萄球菌，或者樣本中污染有分布不均的金黃色葡萄球菌(發(fā)生假陽性結(jié)果的樣本批次早于用于重復(fù)測試的樣本II)，可排除試劑盒本身的質(zhì)量問題。結(jié)果提示，檢測反應(yīng)體系的污染控制是非常關(guān)鍵的環(huán)節(jié)。另外，當(dāng)檢測到假陽性結(jié)果后，應(yīng)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，通過采用不同批次樣本、不同批次試劑的方式控制實(shí)驗(yàn)過程，確認(rèn)檢測結(jié)果。

3.2 單增李斯特菌試劑盒對果凍基質(zhì)陰性樣本測試時(shí)出現(xiàn)假陽性的原因分析

分析推測，假陽性可能是由于實(shí)驗(yàn)室空間內(nèi)的氣溶膠污染所造成的。

作為一種快檢方法，本方法靈敏度高，優(yōu)點(diǎn)是可快速篩選出高危樣本，盡可能避免陽性樣本被漏檢(假陰性)；與之對應(yīng)的缺點(diǎn)是，一旦實(shí)驗(yàn)室操作空間內(nèi)有微量的待測菌或者DNA，相比國標(biāo)培養(yǎng)法，更容易造成假陽性。這是所有PCR類核酸擴(kuò)增方法普遍存在的問題。同理，當(dāng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境中高靈敏度方法與低靈敏度方法共存，更容易造成假陽性問題。因此，出現(xiàn)陽性時(shí)，通過國標(biāo)法進(jìn)一步驗(yàn)證。

既要保留核酸擴(kuò)增反應(yīng)的快速、高靈敏度特性，又要規(guī)避污染問題，是目前本領(lǐng)域的挑戰(zhàn)之一。目前本實(shí)驗(yàn)室正就試劑盒生產(chǎn)工藝做改進(jìn)，通過避免開蓋、減少操作步驟等方式防范和減少污染，降低假陽性。

3.3 淀粉樣本出現(xiàn)的預(yù)處理問題

小饅頭基質(zhì)在沉淀加入核酸抽提試劑，100 ℃ 15 min，碎冰或冰盒中靜置10 min后會凝結(jié)成塊，離心無法得到上清液。這是由于小饅頭中含有大量淀粉，吸水性強(qiáng)，增菌液混入該介質(zhì)后很容易凝結(jié)成塊，發(fā)生上清液難以析出的問題。

本實(shí)驗(yàn)采用先將增菌液搖勻，略等基質(zhì)沉淀后再取增菌液，在兩種快檢試劑盒上都取得預(yù)期的檢測結(jié)果，即陰性樣本均未檢出，陽性樣本均被檢出。

因此，為避免類似基質(zhì)造成困擾，可以在說明書中增加相關(guān)描述，如“略等食品介質(zhì)沉淀后再取增菌液”。此外，還可以使用帶濾膜的均質(zhì)袋進(jìn)行增菌，或者多加一步增菌步驟。

在研發(fā)過程中，不同食品由于大分子含量、pH、鹽濃度等因素對于反應(yīng)體系的各個(gè)環(huán)節(jié)會有不同程度的影響，如何讓檢測體系適應(yīng)不同類型的檢測對象，也是本實(shí)驗(yàn)?zāi)壳把邪l(fā)工作的一個(gè)關(guān)注點(diǎn)。

3.4 檢出限(靈敏度)

需要特別指出的是，在對樣本進(jìn)行人工染菌的操作環(huán)節(jié)，A測試與本實(shí)驗(yàn)室此前的操作有所不同。外部實(shí)驗(yàn)是從培養(yǎng)基平板上挑取經(jīng)過純培養(yǎng)的若干個(gè)單菌落接種樣本；本實(shí)驗(yàn)室的方法是先將病原菌液體培養(yǎng)、計(jì)數(shù)、稀釋，然后分別將16、8、4、2、1和0.5 CFU/mL細(xì)菌接種到擬檢測的樣本中。從方法設(shè)計(jì)上可以看出，自主研發(fā)的技術(shù)體系靈敏度更高。

為了與外部測試結(jié)果進(jìn)行嚴(yán)格的比對，本次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)在人工染菌等環(huán)節(jié)，采用了與之相同的實(shí)驗(yàn)方法。

本文查明試劑盒初步測試結(jié)果出現(xiàn)假陰性和假陽性的原因，為下一步檢測技術(shù)及試劑盒生產(chǎn)制備工藝的優(yōu)化提供有益的參考。