周美琪 肖欣怡 楊卓一 白思益 陳會 袁運(yùn)生

（上海交通大學(xué)藥學(xué)院細(xì)胞工程及抗體藥物教育部研究工程中心，上海 200240）

骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）是一種分泌型磷酸化糖蛋白［1］，在蛋白水平上會進(jìn)行水解、磷酸化、糖基化等廣泛的翻譯后修飾。OPN分子量根據(jù)其翻譯后修飾的程度呈現(xiàn)為30 kD到100 kD不等［2］。OPN具有許多功能域，包括精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arginine-glycine-aspartic acid，RGD）細(xì)胞結(jié)合序列，肝素結(jié)合位點，凝血酶切割位點等（圖1）。RGD域位于OPN中心，該域可與細(xì)胞表面的整合素αvβ3、αvβ1和αvβ5結(jié)合［3］，介導(dǎo)細(xì)胞黏附。研究表明，乳腺癌、胃癌、肺癌及前列腺癌等多種惡性腫瘤的進(jìn)展或轉(zhuǎn)移與OPN的異常高表達(dá)相關(guān)［4-7］。由于 OPN 在大多數(shù)腫瘤中存在特異性表達(dá)且其體內(nèi)水平與腫瘤惡化程度呈高度相關(guān)，OPN已經(jīng)是腫瘤臨床研究中的重要生物標(biāo)記物之一［8］。

為研究OPN的體外結(jié)構(gòu)和生物學(xué)功能，已有研究從牛奶或尿液中分離出天然OPN，盡管此類制備方式所需來源豐富易得，但OPN在天然狀態(tài)下極易被凝血酶或基質(zhì)金屬蛋白酶裂解，存在不同大小的OPN裂解產(chǎn)物，因此生物來源的OPN片段的純化程序復(fù)雜，難以標(biāo)準(zhǔn)化，不易大規(guī)模生產(chǎn)［9-11］。在大腸桿菌中表達(dá)并用親和層析純化的谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（Glutathione S-transferase，GST）或6×His標(biāo)記的OPN已被用于廣泛研究［12］。對于分子大小和翻譯后修飾而言，OPN不同的生物學(xué)特性及活性與其翻譯后修飾程度有關(guān)［13］，而原核細(xì)胞缺乏相應(yīng)的酶，無法進(jìn)行翻譯后修飾。因此，利用真核表達(dá)系統(tǒng)開發(fā)一種制備近似天然重組OPN蛋白的新方法，以研究OPN的結(jié)構(gòu)、穩(wěn)定性和生物學(xué)功能十分必要。在這項研究中，我們利用聚醚酰亞胺（Polyetherimide，PEI）瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)，創(chuàng)建了一種在哺乳動物細(xì)胞中高效表達(dá)重組人骨橋蛋白（Recombinant human osteopontin，rhOPN）的策略，獲得純度為95%的具備良好生物學(xué)活性的rhOPN。由于蛋白質(zhì)的翻譯后修飾在調(diào)節(jié)生物學(xué)功能中起著至關(guān)重要的作用，rhOPN可用于體外研究OPN的翻譯后修飾機(jī)制［14］，包括磷酸化、乙酰化和糖基化等。該策略與從牛奶或尿液中純化OPN相比，簡單高效，更易大規(guī)模應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)。

圖1 人OPN結(jié)構(gòu)及功能域

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自Second Lab公司，HEK293E細(xì)胞株由本實驗室保存，HT29細(xì)胞株由本實驗室保存，H1299及HCC827細(xì)胞株由蘇州大學(xué)惠贈，pcDNA3.1-OPN質(zhì)粒由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提試劑盒購自美國Axygen公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，PEI購自美國Polysciences公司，遺傳霉素購自美國Invitrogen公司，鎳親和層析柱購自GE公司，TN1購自法國Organotechnie公司，蛋白Marker購自新賽美公司，CCK-8購自日本Dojindo公司，F(xiàn)reestyle培養(yǎng)基、SFM4 HEK293培養(yǎng)基與Mocoy’s 5A培養(yǎng)基均購自美國Gibco公司，BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天公司，鼠抗6×His單克隆抗體購自美國Sigma公司，兔抗OPN多克隆抗體、兔IgG抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG重鏈和輕鏈由實驗室保存，細(xì)胞計數(shù)儀購自上海Countstar公司，0.22 μm濾膜購自美國Corning Life Sciences公司，防細(xì)胞結(jié)團(tuán)劑Anti-Clumping Agent購自Invitrogen公司。

1.2 方法

利用pcDNA3.1/His A載體來構(gòu)建OPN基因真核表達(dá)載體，并通過PEI瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)，創(chuàng)建了一種在人類胚胎腎細(xì)胞（Human embryonic kidney 293E，HEK293E）中高效表達(dá)rhOPN的簡單高效策略（圖2），并獲得了高純度且具備生物學(xué)活性的rhOPN。真核表達(dá)系統(tǒng)可以在表達(dá)過程中進(jìn)行蛋白翻譯后加工，因此通過本策略可獲得接近天然活性的蛋白質(zhì)，有利于后期對蛋白的生物學(xué)活性研究。

圖2 rhOPN表達(dá)純化策略流程圖

1.2.1OPN基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建 人OPN基因表達(dá)載體構(gòu)建示意圖如圖3所示，根據(jù)NCBI基因庫NM_001040060.1合成人OPN基因序列，選用含BamHI與EcoR1酶切位點的pcDNA3.1/His A載體，所構(gòu)建的真核重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1-OPN。

圖3 OPN-pcDNA3.1表達(dá)載體圖譜

1.2.2 細(xì)胞的培養(yǎng) HEK 293E細(xì)胞懸浮培養(yǎng)在含2%胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)BS），100 μg/mL遺傳霉素（Geneticin 418，G418）的Freestyle 293與SFM4 HEK293（1∶1混合）培養(yǎng)基中。培養(yǎng)條件為37℃，5% CO2飽和濕度，轉(zhuǎn)速為125 r/min。細(xì)胞生長狀態(tài)和密度由細(xì)胞計數(shù)儀檢測。

結(jié)腸癌細(xì)胞HT29細(xì)胞培養(yǎng)在含有10% FBS 的Mocoy’s 5A培養(yǎng)基中。人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1299細(xì)胞培養(yǎng)在含有10% FBS 的DMEM培養(yǎng)基中。人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞HCC827細(xì)胞在含有10% FBS 的RPMI 1640培養(yǎng)基中。3種腫瘤細(xì)胞株均采用貼壁培養(yǎng)，均培養(yǎng)在37℃，5% CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。

1.2.3 PEI法瞬時轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min后，將細(xì)胞密度調(diào)整為6×106個/mL，使用分子量為25 kD的線性聚乙烯亞胺轉(zhuǎn)染300 μg pcDNA3.1-OPN質(zhì)粒至100 mL該密度的細(xì)胞培養(yǎng)液中。轉(zhuǎn)染4 h后，向錐形瓶中補(bǔ)加100 mL含有200 μg/mL的遺傳霉素及3 mmol/L丙戊酸的完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24 h后，加入1∶1 000的防細(xì)胞結(jié)團(tuán)劑Anti-Clumping Agent和2.5 mL 20%的胰蛋白胨N1。

1.2.4 Western Blot檢測rhOPN表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞培養(yǎng)液，將其離心后，細(xì)胞沉淀用相同體積的PBS重懸，分別向細(xì)胞上清液及沉淀中加入5×上樣緩沖液混勻，置于95℃煮10 min。取15 μL蛋白樣品加入至樣品孔進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后以恒定電流（200 mA，90 min）將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜中。5%脫脂奶粉封閉后加入1∶2 000稀釋的鼠抗6×His標(biāo)簽一抗，4℃孵育過夜。TBST洗滌后用辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG重鏈和輕鏈抗體（1∶20 000稀釋）室溫孵育1 h?；瘜W(xué)發(fā)光法進(jìn)行顯色，利用凝膠成像系統(tǒng)收集信號并拍攝圖像。

1.2.5 鎳柱純化rhOPN 將HEK293E細(xì)胞培養(yǎng)液離心并收集上清，上樣到鎳親和層析柱（規(guī)格1 mL）里。上樣前，用pH 7.2的20 mmol/L咪唑緩沖液預(yù)平衡層析柱，然后樣品以1 mL/min流速上樣，上樣結(jié)束后分別用含有40、60、80、100、200和300 mmol/L咪唑的蛋白洗脫液洗脫蛋白，每個咪唑濃度的洗脫液洗滌10 mL，收集各組分洗脫液。采用SDS-PAGE電泳分析各組分中的目的蛋白水平，用BCA蛋白定量試劑盒測定各組分中的總蛋白含量。純化出的rhOPN被0.22 μm的濾膜除菌后儲存于-80℃冰箱。

1.2.6 ELISA法檢測rhOPN與抗OPN抗體的結(jié)合活性 將純化的rhOPN蛋白以 2 μg/mL 的濃度包被于ELISA板中4℃放置過夜。棄去包被液后，用3%BSA室溫封閉1 h。將兔抗OPN多克隆抗體從20 μg/mL倍比稀釋至1 ng/mL。在陰性對照中，將兔IgG抗體從20 μg/mL倍比稀釋至1 ng/mL，室溫孵育1 h。然后加入1∶20 000稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG重鏈和輕鏈進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，37℃孵育1 h。最后加入3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺顯色液在室溫下避光反應(yīng)5 min，并用2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀下讀取450 nm吸光度。

1.2.7 CCK-8測定rhOPN促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞株增殖水平 為進(jìn)行細(xì)胞增殖測定，將HT29細(xì)胞以100 μL/孔接種到96孔板中，細(xì)胞最終密度為3×104個/mL，并生長過夜。然后用無血清HT29培養(yǎng)液處理細(xì)胞，其中含有不同濃度的rhOPN（80 μg/mL、53 μg/mL、36 μg/mL、24 μg/mL、10 μg/mL、7 μg/mL和2 μg/mL），每組有3個重復(fù)的孔。而在陰性對照中，PBS加入體積與80 μg/mL rhOPN體積一致。在37℃，5%CO2和飽和濕度下孵育48 h后，用CCK-8細(xì)胞計數(shù)試劑盒分析細(xì)胞活力，在450 nm波長下測定其吸光度。然后使用GraphPad Prism軟件對細(xì)胞存活率進(jìn)行分析。

1.2.8 CCK-8測定rhOPN促進(jìn)肺癌細(xì)胞株增殖水平 為進(jìn)行肺癌細(xì)胞增殖測定，用相應(yīng)的培養(yǎng)基分別將H1299與HCC827細(xì)胞重懸，使細(xì)胞最終密度為2.5×104個/mL。將重懸后的H1299及HCC827細(xì)胞培養(yǎng)液分別以100 μL/孔接種到96孔板中，并生長過夜。然后用對應(yīng)的無血清培養(yǎng)基處理細(xì)胞，處理組含有終濃度為20 μg/mL的rhOPN，而在陰性對照中，PBS加入體積與rhOPN體積一致，每組設(shè)有4個重復(fù)的孔。在37℃，5% CO2和飽和濕度下孵育48 h后，用CCK-8細(xì)胞計數(shù)試劑盒在450 nm波長下測定其吸光度，然后使用GraphPad Prism軟件分析細(xì)胞活力。

1.2.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用GraphPad統(tǒng)計軟件，組間比較采用t檢驗分析，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義，其中*代表P＜0.05，**代表P＜0.01。

2 結(jié)果

2.1 重組OPN蛋白在哺乳動物細(xì)胞中的表達(dá)

利用Western Blot檢測rhOPN蛋白在哺乳動物細(xì)胞HEK293E中的表達(dá)，結(jié)果如圖4所示，在細(xì)胞培養(yǎng)液的上清與沉淀中，均檢測出rhOPN蛋白的表達(dá)，且條帶大小與預(yù)期一致，表明成功利用聚醚酰亞胺瞬時轉(zhuǎn)染法將OPN融合6×His標(biāo)簽重組蛋白轉(zhuǎn)染到HEK293E細(xì)胞中，并表達(dá)獲得目的蛋白。

圖4 Western Blot檢測rhOPN表達(dá)產(chǎn)物

2.2 rhOPN蛋白的純化

rhOPN經(jīng)鎳親和層析柱純化后，各個濃度咪唑洗脫液的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖5所示，分別在40 mmol/L與60 mmol/L濃度咪唑洗脫液中獲得了目的蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖顯示在65 kD左右有特異性條帶，該條帶單一清晰，條帶大小符合預(yù)期，表明成功利用鎳親和層析柱純化獲得高純度rhOPN融合6×His標(biāo)簽重組蛋白。利用BCA蛋白定量試劑盒測定得蛋白產(chǎn)量為28 mg/L。

2.3 ELISA法對rhOPN進(jìn)行表征

利用兔抗OPN多克隆抗體對制備的rhOPN進(jìn)行抗體結(jié)合活性測定，結(jié)果如圖6所示，與對照組相比，制備的rhOPN與抗OPN抗體有顯著的結(jié)合活性，且結(jié)合活性的大小與抗體的劑量呈正相關(guān)。

2.4 rhOPN促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖

圖5 鎳親和層析柱純化獲得rhOPN

圖6 OPN重組蛋白與抗OPN抗體具有結(jié)合活性

CCK-8結(jié)果顯示，與對照組相比，細(xì)胞培養(yǎng)基中含有rhOPN時，48 h后的細(xì)胞數(shù)量顯著增多，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。如圖7及表1所示，rhOPN在36 μg/mL濃度時即可顯著促進(jìn)體外培養(yǎng)的HT29細(xì)胞增殖，這些數(shù)據(jù)表明根據(jù)我們的策略表達(dá)和純化的rhOPN具有體外生物活性，可顯著促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞HT29的增殖，為后續(xù)研究rhOPN在腫瘤增殖、遷移或侵襲中的生物學(xué)功能提供了重要實驗材料。

2.5 rhOPN促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖

體外腫瘤細(xì)胞增殖是測定重組蛋白生物學(xué)活性的良好模型。如圖8及表2所示，與對照組相比，細(xì)胞培養(yǎng)基中含有20 μg/mL rhOPN時，人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞H1299與HCC827的數(shù)量均顯著增多，并呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系。表明該策略制備的rhOPN具有良好的體外生物學(xué)活性，可顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞H1299及HCC827的增殖，為后續(xù)研究rhOPN在肺癌細(xì)胞增殖，轉(zhuǎn)移等生物學(xué)功能奠定了實驗基礎(chǔ)。

圖7 rhOPN促進(jìn)HT29細(xì)胞增殖的劑量反應(yīng)曲線

表1 CCK-8法檢測rhOPN對HT29增殖的影響

圖8 rhOPN促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖的劑量反應(yīng)曲線

表2 CCK-8法檢測rhOPN對肺癌細(xì)胞增殖的影響

3 討論

腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移高度依賴于細(xì)胞因子介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞與腫瘤基質(zhì)間的相互作用［15］。OPN與其受體整合素或細(xì)胞分化分類分子44（Cluster of differentiation molecular 44，CD44）結(jié)合后，可激活與腫瘤進(jìn)程相關(guān)的信號通路，從而對腫瘤進(jìn)展產(chǎn)生影響［16］。研究表明，OPN在腫瘤微環(huán)境中廣泛表達(dá)，可與腫瘤細(xì)胞中CD44s結(jié)合促進(jìn)腫瘤的生長與侵襲［17］。OPN現(xiàn)已成為腫瘤臨床研究中的重要生物標(biāo)記物之一。

本研究設(shè)計構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA3.1-OPN，并采用PEI瞬時轉(zhuǎn)染技術(shù)將該重組質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染至HEK 293E細(xì)胞中，最終通過鎳親和層析柱純化獲得rhOPN。這是一種利用瞬轉(zhuǎn)技術(shù)及鎳親和層析柱表達(dá)和純化rhOPN的簡單有效的策略。與常規(guī)方法相比，該策略非常新穎高效，可短時間大規(guī)模表達(dá)具有生物學(xué)活性的蛋白。

HEK293E細(xì)胞是常用的哺乳動物細(xì)胞［18］，并且哺乳動物表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)的蛋白無內(nèi)毒素污染，獲得蛋白的穩(wěn)定性好，產(chǎn)量高，目前技術(shù)已趨于成熟［19］。相比于原核表達(dá)系統(tǒng)，本研究中表達(dá)的蛋白可以進(jìn)行翻譯后修飾，具有類似天然的活性，便于后期對蛋白活性與作用機(jī)制進(jìn)行研究。本研究中僅進(jìn)行了一步純化，而在后期優(yōu)化實驗中，可進(jìn)行多步純化，也可以嘗試改變瞬時轉(zhuǎn)染過程的多種條件如細(xì)胞活性、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒數(shù)量及培養(yǎng)環(huán)境等來進(jìn)一步提高蛋白產(chǎn)量及質(zhì)量，利用最優(yōu)組合獲得大量高純度蛋白。

在人類結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄因子SP1（Transcription factor Sp1，SP1）介 導(dǎo) 了OPN表 達(dá)的調(diào)控。另外，已有研究證明T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子（T-cell factor/lymphoid enhancerbinding factor，TCF/LEF）誘導(dǎo)OPN在結(jié)腸癌中的表達(dá)，該轉(zhuǎn)錄因子是由果蠅同源無翅/整合（Wingless/Integrated，Wnt）通路激活的，從而推測Wnt信號通路是解釋OPN在結(jié)腸癌中上調(diào)的機(jī)制［20］。研究表明，抗OPN中和抗體可阻斷OPN-CD44信號通路，使果蠅Zeste基因增強(qiáng)子同源物2（Enhancer of zeste homolog 2，EZH2）轉(zhuǎn)錄水平下降，揭示了OPN與CD44的結(jié)合會上調(diào)EZH2的表達(dá)，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增值。OPN也可通過磷脂酰肌醇3-激酶（Phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-絲氨酸/蘇氨酸激酶AKT（Serine/threonine kinase AKT，AKT）這一核心信號通路參與對細(xì)胞增殖、運(yùn)動和侵襲等多種生物功能的調(diào)控［21］。

生物學(xué)活性對于重組蛋白非常重要。上述研究提示rhOPN可以促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞和非小細(xì)胞肺癌的增殖。因此，本研究表達(dá)和純化的rhOPN可以用來研究OPN與對腫瘤細(xì)胞生長的影響，深入探討OPN的調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。本研究同時也為評價rhOPN生物學(xué)活性提供了新的方法。結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系HCC827及H1299均可以用于評價rhOPN的生物學(xué)活性。本研究獲得的rhOPN也可用于免疫特異性抗OPN的抗體，用于開發(fā)靶向OPN蛋白的抗體藥物。此外，也為進(jìn)一步的去標(biāo)簽OPN的表達(dá)提供參考依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究報道了以天然形式表達(dá)與純化rhOPN的有效策略。該策略與從牛奶或尿液中純化OPN相比，更易于工業(yè)中大規(guī)模生產(chǎn)，具有簡單高效，制備周期短等優(yōu)勢。本研究制備的rhOPN產(chǎn)量高達(dá)28 mg/L，分子量為65 kD，具有類似天然表達(dá)蛋白的生物學(xué)活性。rhOPN與抗OPN抗體具有良好的結(jié)合活性，活性大小與抗體的劑量呈正相關(guān)。我們也證實了該策略表達(dá)的rhOPN在一定濃度下具有促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞系HT29、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系HCC827及H1299增殖的生物學(xué)活性，與對照組相比均具有顯著差異。