李鋒 黃庶識

（1. 黔南民族師范學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院，都勻 558000；2. 廣西科學(xué)院 廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530007）

隨著化石能源的過度消耗及環(huán)境污染的日益嚴(yán)重，尋求可再生、環(huán)境友好的替代品成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。植物每年通過光合作用生成資源豐富的木質(zhì)纖維素，其中木質(zhì)素是自然界中唯一可再生的芳香族聚合物。處理不當(dāng)會對環(huán)境造成污染，如我國每年的農(nóng)作物秸稈資源豐富，大部分以燃燒的方式進(jìn)行處理，從而加劇了大氣污染。此外，我國造紙工業(yè)產(chǎn)生的黑液廢水主要成分為木質(zhì)素，如果不進(jìn)行處理直接排放，會污染水源甚至可能會對人類健康帶來一定的威脅。因此，探索木質(zhì)素有效分解并轉(zhuǎn)化為高附加值化學(xué)品資源等方面的研究，對人類健康及環(huán)境可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。

自然界生物圈經(jīng)過長期的進(jìn)化和演變，存在著許多可以降解木質(zhì)素的系統(tǒng)，如細(xì)菌、真菌、食木昆蟲和食草動物等，它們都可以將木質(zhì)素進(jìn)行不同程度的分解。其中白蟻腸道消化系統(tǒng)被認(rèn)為是高效木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化反應(yīng)器。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，白蟻腸道內(nèi)寄居著大量形態(tài)和密度都不同的細(xì)菌，每只白蟻腸道中約可達(dá)106-108個［1］。通過高通量測序和分離培養(yǎng)的方法已經(jīng)對將近40多種白蟻進(jìn)行了腸道細(xì)菌多樣性分布研究。Lazuka等［2］在厭氧條件下對Nasutitermes ephratae腸道細(xì)菌進(jìn)行富集，富集后的菌群多樣性明顯發(fā)生變化，經(jīng)5次富集后得到菌群TWS培養(yǎng)12 d可以降解42%的麥稈，菌群TWS主要由擬桿菌屬（Bacteroides）和毛螺科菌（Lachnospiraceae）的細(xì)菌組成。此外，白蟻腸道共生細(xì)菌受物理環(huán)境等因素的影響，其多樣性分布情況存在較大差異。利用宏基因組對高等食木瓢白蟻（Bulbitermessp.）的前腸、中腸和后腸分別進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)前腸和中腸存在相似的多樣性，而后腸中細(xì)菌多樣性明顯比前兩者豐富。其中前腸和中腸優(yōu)勢菌為硬壁菌門的桿菌（Bacilli）、梭菌（Clostridia）和放線菌門的放線菌目細(xì)菌（Actinomycetales），而后腸主要為螺旋體門的螺旋體科細(xì)菌［3］。

在木質(zhì)素降解菌分離純培養(yǎng)方面，Zhou等［4］利用木質(zhì)素作為碳源，從黑胸散白蟻腸道中分離到腸桿菌PY12（Enterobacter hormaechei）和芽孢桿菌 MX5（Bacillus licheniformis），二者表現(xiàn)出較高木質(zhì)素過氧化物酶活力分別為278 U/L和256 U/L，對木質(zhì)素過氧化酶進(jìn)行異源表達(dá)，該酶表現(xiàn)出對多種染料有較強(qiáng)脫色能力。Suman等［5］從土白蟻（Odontotermes obesus）腸道中分離到一株特布爾希氏菌（Trabulsiellasp.），表現(xiàn)出較強(qiáng)木質(zhì)素降解能力，其木質(zhì)素降解產(chǎn)物檢測到許多芳香族化合物，如3-甲氧基苯甲酸、鄰苯二酚、鄰苯二甲酸等。Tsegaye等［6］以堿木質(zhì)素、羧甲基纖維素和木聚糖為碳源，從麻頭堆砂白蟻（Cryptotermes brevis）腸道分離到芽孢桿菌（Bacillussp.）BMP01和水稻蒼白桿菌（Ochrobactrum oryzae）BMP03，其中芽孢桿菌具有較強(qiáng)的纖維素和木聚糖水解的能力，水稻蒼白桿菌表現(xiàn)出較高的漆酶和木質(zhì)素過氧化酶酶活力。此外，以水稻秸稈為碳源培養(yǎng)14 d后，水稻蒼白桿菌可去除秸稈中53.74%木質(zhì)素［7］。

以上這些研究表明白蟻腸道是儲存木質(zhì)纖維素降解細(xì)菌的資源庫，具備挖掘新穎木質(zhì)素降解菌及酶資源的潛力。本研究以堿木質(zhì)素為唯一碳源，篩選分離白蟻腸道中潛在的木質(zhì)素降解菌，對其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并進(jìn)一步解析其木質(zhì)素的降解特性，旨在為木質(zhì)素生物降解轉(zhuǎn)化提供新穎微生物資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 高等白蟻采集于中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園次生雨林，經(jīng)兵蟻形態(tài)特征及COⅡ基因序列鑒定為巴基斯坦小白蟻（Microtermes pakistanicus）。

1.1.2 培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基（g/L）：K2HPO41，KH2PO41，（NH4）2SO42，MgSO40.2，CaCl20.1，F(xiàn)eSO40.05，MnSO40.02，CuSO40.001，ZnSO40.001，tryptone 0.05 瓊脂粉 15，堿木質(zhì)素1.0。

染 料 脫 色 固 體 培 養(yǎng) 基（g/L）：K2HPO41，KH2PO41，（NH4）2SO42，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl20.1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，MnSO4·H2O 0.02，CuSO4·5H2O 0.001，ZnSO4·7H2O 0.001，tryptone 0.05，瓊 脂 粉15，pH 7.2，滅菌后，再分別加入100 mg經(jīng)0.22 μm過濾滅菌的染料（苯胺藍(lán)和天青B）；

MSM液 體 培 養(yǎng) 基（g/L）：K2HPO41，KH2PO41，（NH4）2SO42，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl20.1，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.05，MnSO4·H2O 0.02，CuSO4·5H2O 0.001，ZnSO4·7H2O 0.001，tryptone 0.05，堿木質(zhì)素1.0，pH 7.0左右。

以上所述培養(yǎng)基均為115℃，滅菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離純化及鑒定 取巴基斯坦小白蟻的工蟻30頭，用75% 酒精對白蟻表面消毒后，在中性PBS緩沖液中漂洗2-3次。于無菌條件下，解剖白蟻腸道置于無菌0.9% 生理鹽水中，然后將其研磨成勻漿狀態(tài)。腸道勻漿液用無菌生理鹽水梯度稀釋后，取100 μL溶液涂布于分固體分離培養(yǎng)基的平板上，置于30℃，培養(yǎng)2-5 d。待有單菌落長出后，挑取單菌落，在液體LB培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，重新劃線于分離培養(yǎng)基平板中，進(jìn)行多次劃線分離培養(yǎng)，直至獲得純菌株。

將單克隆接種于LB培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)，取1 mL培養(yǎng)液于離心管中，12 000 r/min離心2 min后棄上清液，菌體經(jīng)無菌水漂洗后，用細(xì)菌基因組試劑盒進(jìn)行DNA提取。獲得細(xì)菌基因組后進(jìn)行16S rRNA 基因擴(kuò)增，具體擴(kuò)增條件參考文獻(xiàn)［8］。PCR產(chǎn)物經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托上海生工對細(xì)菌基因序列進(jìn)行雙向測序。將測序完成的16S rRNA 基因序列拼接后，提交至NCBI網(wǎng)站的GenBank數(shù)據(jù)庫，并進(jìn)行BLASTn（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）同源性相似度比對。下載比對序列同源性較高的菌株序列，利用MEGA 5.05 軟件計算序列相似度，同時用Neighbor-Joining 法構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹，確定物種的分類地位。

1.2.2 細(xì)菌胞外酶定性檢測 利用染料脫色來評價細(xì)菌是否能夠產(chǎn)胞外分泌酶的能力，通過檢驗(yàn)細(xì)菌對染料的脫色能力，達(dá)到對細(xì)菌進(jìn)一步復(fù)篩目的。挑取單克隆于LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后，接種環(huán)取菌液劃線于染料固體培養(yǎng)基上，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察菌株的生長情況以及是否有脫色圈產(chǎn)生。

1.2.3 細(xì)菌木質(zhì)素降解率測定 在有氧條件下，細(xì)菌接種于MSM液體培養(yǎng)基后，每隔24 h 取樣。細(xì)菌生長曲線按照如下步驟測定：取2 mL發(fā)酵液，經(jīng)10 000 r/min 離心5 min后，棄上清液，底物菌體用去離子水重懸后，在波長600 nm處測定吸光度OD值，去離子水為空白對照。培養(yǎng)基中堿木質(zhì)素濃度以溶液中化學(xué)需氧量（COD）為考察指標(biāo)，采用重鉻酸鉀法測定COD（GB11914-89），離心后的上清液經(jīng)一定倍數(shù)稀釋后，經(jīng)消解儀消解樣品后，利用5B-3B型多功能COD快速測定儀測定COD值。以上實(shí)驗(yàn)均為3個平行試驗(yàn)。

1.2.4 細(xì)菌木質(zhì)素降胞外酶活力測定 細(xì)菌降解木質(zhì)素胞外漆酶（Lac）、木質(zhì)素過氧化物酶（Lip）和錳過氧化物酶（MnP）測定具體操作步驟參考文獻(xiàn)［9］。

1.2.5 掃描電子顯微鏡觀察 未接菌的培養(yǎng)液作為對照試驗(yàn)組和經(jīng)細(xì)菌處理7 d后的一定量發(fā)酵液經(jīng)冷凍干燥后，取木質(zhì)素粉末經(jīng)乙醇洗滌去除殘留物，烘干后備用，分別取少量干燥木質(zhì)素樣品涂布于雙面導(dǎo)電膠上，經(jīng)噴金處理后，進(jìn)行JSM-7800F場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本電子株式會社）觀察和拍照。

1.2.6 傅里葉變換紅外光譜分析 木質(zhì)素紅外光譜（Nicolet nexus 470 傅里葉變換紅外光譜儀，美國尼高力儀器公司）采集采用溴化鉀壓片法，分別取一定量經(jīng)過干燥的接菌和未接菌的木質(zhì)素樣品，木質(zhì)素樣品和溴化鉀按質(zhì)量比為1∶100混合均勻后，將其研磨至成粉末，制備成厚度均勻薄片后，采集紅外圖譜，以純溴化鉀為背景，波長掃描范圍4 000至400 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.2.7 熱解特性分析 木質(zhì)素?zé)岱€(wěn)定分析采用TGA4000熱重分析儀（Thermo-gravimetric annlyzer，TGA，美國珀金埃爾默），取大約2 mg 未經(jīng)細(xì)菌處理和經(jīng)過細(xì)菌處理的木質(zhì)素樣品，分析放入樣品盤后，溫度從50℃開始升溫至800℃結(jié)束，升溫速度為20℃/min，氮?dú)饬魉贋?0 mL/min。每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 木質(zhì)素降解菌篩選分離與鑒定

2.1.1 木質(zhì)素降解菌篩選分離 待固體分離培養(yǎng)基上長出單菌落后，挑取單菌落繼續(xù)進(jìn)行劃線分離多次培養(yǎng)后，將單菌落接種于固體分離培養(yǎng)基，挑取生長速度快和菌落個體較大的細(xì)菌進(jìn)行編號并保藏。為了直觀評價細(xì)菌分泌胞外木質(zhì)素降解相關(guān)酶的能力，本研究采用較為常用的天青B和苯胺藍(lán)作為底物，對細(xì)菌脫色能力進(jìn)行評價。將菌株接種于染料培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)菌株MP-132能夠使天青B和苯胺藍(lán)脫色（圖1）。由圖1可知，菌株MP-132在染料誘導(dǎo)的情況下，可以分泌胞外酶將其脫色。染料脫色只能定性判斷產(chǎn)酶情況，但是，該菌分泌哪種類型的酶及其酶活大小還需進(jìn)一步分析。

圖1 菌株MP-132的染料脫色評價

2.1.2 木質(zhì)素降解菌的16S rRNA 基因序列分析 雙向測序獲得菌株MP-132的16S rRNA 基因序列，經(jīng)RNAMAN序列拼接后，提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫，序列登錄號為MF455198，同時在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行序列同源性比對，選取BLAST中相似度較高的細(xì)菌序列，并下載相關(guān)序列后，利用MEGA5.05計算細(xì)菌序列相似度，同時采用其中的Neighbor Joining法構(gòu)建細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹。如圖2所示，MP-132與Raoultella ornithinolyticastrain ATCC 31898在同一個分支上，序列相似性為99%。因此，將該菌株初步命名為Raoultella ornithinolyticaMP-132。

2.2 木質(zhì)素降解菌的生長及酶活力分析

2.2.1 木質(zhì)素降解菌的生長情況及降解率測定 為了解菌株MP-132在液體堿木質(zhì)素中的生長及木質(zhì)素降解情況，將細(xì)菌分別接種于以堿木質(zhì)素為唯一碳源的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，因堿木質(zhì)素是培養(yǎng)基中唯一提供的有機(jī)物質(zhì)，所以采用COD去除率作為指標(biāo)，評價堿木質(zhì)素降解率。由圖3可知，菌株MP-132前4 d菌體呈現(xiàn)迅速生長趨勢，第4天后菌體OD值達(dá)到0.87，隨后OD曲線呈現(xiàn)平緩增長趨勢，第6天OD值增長到0.913，OD數(shù)值變化不大。液體培養(yǎng)基中COD濃度變化曲線，前兩天降低速度緩慢，第2天開始繼續(xù)開始下降，可能是與細(xì)菌活性和濃度有關(guān)，直到第7天培養(yǎng)基中COD濃度為842.7 mg/L，降解率達(dá)到53.2%，后期COD去除率變化緩慢，由此表明降解產(chǎn)物的累積使菌體代謝活性受到影響。

圖2 菌株MP-132的16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹

圖3 菌株MP-132在堿木質(zhì)素培養(yǎng)基中的生長及COD去除率

2.2.2 木質(zhì)素降解菌的酶活力測定 由圖4可知，細(xì)菌在堿木質(zhì)素培養(yǎng)基生長過程中沒有檢測到錳過氧化物酶活力，只檢測到漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶。由木質(zhì)素過氧化物酶的增加速率趨勢分析發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)2 d后LiP增長速率放緩，第4天LiP達(dá)到最大值為105.6 U/L，隨著培養(yǎng)時間增加，其酶活力開始出現(xiàn)下降趨勢，可能是由于細(xì)菌衰老，其代謝活力降低，從而導(dǎo)致酶活力出現(xiàn)下降趨勢。在木質(zhì)素降解過程中，Lac酶活力在第2天達(dá)到27.53 U/L，即使隨著培養(yǎng)時間的增加，Lac酶活力在第3天達(dá)到最大值32 U/L。菌株MP-132所產(chǎn)LiP和Lac酶活力明顯低于以前報道的白腐菌和其他類細(xì)菌所產(chǎn)的酶活，可能是受發(fā)酵參數(shù)影響，如溫度、溶氧量和pH等，后續(xù)研究應(yīng)該對其發(fā)酵過程進(jìn)行條件優(yōu)化。

2.3 菌株MP-132的降解特性

圖4 木質(zhì)素降解過程中菌株MP-132酶活曲線

2.3.1 木質(zhì)素微觀結(jié)構(gòu)分析 菌株MP-132處理前后的堿木質(zhì)素形貌進(jìn)行掃描電鏡觀察分析比較。如圖5中所示，圖5-A為在放大倍數(shù)為1 000倍狀態(tài)下，未處理堿木質(zhì)素呈現(xiàn)的結(jié)構(gòu)狀態(tài)，其呈球形或者塊狀，且表面相對光滑，完整致密。圖5-B為細(xì)菌處理后的堿木質(zhì)素在放大倍數(shù)1 000倍狀態(tài)下，呈現(xiàn)的堿木質(zhì)素微觀結(jié)構(gòu)。經(jīng)過細(xì)菌降解后的堿木質(zhì)素已經(jīng)沒有規(guī)則的球形或者塊狀結(jié)構(gòu)，且呈現(xiàn)疏松多孔的表面，甚至出現(xiàn)許多片狀顆粒，它們的直徑都小于10 μm。經(jīng)對比木質(zhì)素降解前后微觀結(jié)構(gòu)變化情況，證實(shí)細(xì)菌都可以通過分泌胞外酶使堿木質(zhì)素微觀結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重的破壞。

圖5 木質(zhì)素降解前后的微觀結(jié)構(gòu)

2.3.2 木質(zhì)素的FTIR分析 由圖6可知，是經(jīng)菌株MP-132降解前后的堿木質(zhì)素的紅外光譜圖。由圖可知，經(jīng)過細(xì)菌降解的木質(zhì)素的特征峰強(qiáng)度減小或者發(fā)生漂移，木質(zhì)素特征峰變化也是主要集中于1 800 /cm-800/cm的指紋區(qū)。1 596 /cm和1 513/cm處吸收峰歸屬于芳香環(huán)骨架振動和C-H變形振動，1 456/cm和 1 424/cm處吸收峰是由于甲氧基的甲基C-H不對稱變形，1 374/cm處吸收峰歸屬于甲基和酚羥基的C-H的伸縮引起。此外還存在1 268/cm、1 217/cm處吸收峰是典型愈創(chuàng)木酚基結(jié)構(gòu)（G），1 126/cm處是典型紫丁香基（S）的吸收峰。1 082、1 033、967 和880/cm處吸收峰分別歸屬于Cβ和脂肪醚的C-O變形，以及苯環(huán)C-H面內(nèi)變形振動、苯環(huán)C-H面外伸縮振動和C-H變形振動。細(xì)菌降解后木質(zhì)素的多個吸收峰消失，如1 374、1 151、1 082、967、880、854和 816/cm， 以 及1 596、1 513、1 456、1 424、1 268和 1 033/cm處的幾個吸收峰相對吸收強(qiáng)度減小，上述多個吸收峰的變化表明菌株MP-132使堿木質(zhì)素的側(cè)鏈、C=O、C-O和芳香環(huán)骨架結(jié)構(gòu)遭到破壞。

圖6 木質(zhì)素降解前后的紅外光譜圖

2.3.3 木質(zhì)素的熱解特性分析 堿木質(zhì)素?zé)峤庑再|(zhì)與其芳香環(huán)骨架結(jié)構(gòu)及在不同溫度下化學(xué)鍵裂解所需要的鍵能有著密切的關(guān)系，可以作為評判木質(zhì)素結(jié)構(gòu)變化的考核參數(shù)。在升溫速度為20℃/min條件下，降解前后的木質(zhì)素樣品進(jìn)行熱重分析，得到TG曲線。由圖7中TG曲線可知，降解前后的木質(zhì)素的熱穩(wěn)定性存在較大差異，主要表現(xiàn)在熱分解反應(yīng)的起始和終止溫度、失重速率和失重峰值點(diǎn)等。細(xì)菌降解前后木質(zhì)素樣品均呈現(xiàn)兩個重量損失階段。第一階段發(fā)生在100-180℃范圍內(nèi)的重量損失；細(xì)菌處理堿木質(zhì)素第二階段重量損失從180℃開始，一直升溫至640℃終止，最終得到剩余殘渣質(zhì)量達(dá)到60%。而未處理堿木質(zhì)素在從200℃開始一直升溫至800℃，有明顯的重量損失，最終剩余殘渣為29.3%。

圖7 木質(zhì)素降解前后TG曲線

3 討論

木質(zhì)素由多種化學(xué)鍵構(gòu)成的大分子聚合物，在自然界中的儲量僅次于纖維素，如將其高值化利用對改善能源結(jié)構(gòu)具有重要的意義。細(xì)菌具有生長速度快，適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)和基因易操控等優(yōu)點(diǎn)，備受國內(nèi)外研究者的青睞。近年來，關(guān)于細(xì)菌降解木質(zhì)素研究逐漸增多，同時對木質(zhì)素降解機(jī)制也逐漸補(bǔ)充完善。如Zhu等［10］從南海深海海泥中篩選到一株嗜堿菌Bacillus ligniniphilusL1，通過基因組和蛋白組測序發(fā)現(xiàn)該菌擁有木質(zhì)素主要代謝途徑：苯甲酸代謝途徑、龍膽酸代謝途徑和β-酮己二酸代謝途徑。Higuchi等［11］從Sphingobiumsp. YK-6基因組中鑒定到兩個新穎基因編碼的酶，可以催化裂解芳基醇-β-芳醚結(jié)構(gòu)，并發(fā)現(xiàn)存在可以將木質(zhì)素轉(zhuǎn)化為高附加值化學(xué)品（2-吡喃酮-4，6二甲酸）的HPV代謝途徑。以上研究表明，挖掘自然界中木質(zhì)素降解細(xì)菌具有較大潛力。

Raoultella屬細(xì)菌是廣泛存在生態(tài)環(huán)境中的一類革蘭氏陰性細(xì)菌，具備降解多種有機(jī)污染物的能力［12-14］。本研究從高等食木白蟻腸道中分離得到一株可降解木質(zhì)素的菌株MP-132，經(jīng)分子生物學(xué)鑒定為解鳥氨酸拉烏爾菌。進(jìn)一步對其降解木質(zhì)素試驗(yàn)分析，培養(yǎng)7 d后其木質(zhì)素降解率可達(dá)53.2%，明顯高于已報道的Burkholderiasp. H1［15］，其降解率可能受環(huán)境條件，如溫度、溶氧量和pH等，后續(xù)需優(yōu)化培養(yǎng)條件提高木質(zhì)素降解率。在木質(zhì)素降解變化的化學(xué)官能團(tuán)方面：如1 374/cm處的吸收峰消失，表明降解后的木質(zhì)素可能是發(fā)生側(cè)鏈被氧化、脫去甲基以及芳香環(huán)骨架受到破壞［16］。在1 142/cm處消失的特征峰，其歸屬于醚鍵的伸縮振動，由此表明細(xì)菌在一定程度上對木質(zhì)素的主要化學(xué)鍵β-O-4造成了破壞。其次，木質(zhì)素降解前后熱解特性發(fā)生變化，表明樣品中化學(xué)鍵和官能團(tuán)含量經(jīng)過細(xì)菌處理以后發(fā)生改變。在200-350℃范圍內(nèi)，處理過的堿木質(zhì)素?fù)碛休^高的熱分解速率（與對照樣品相比），這一階段的熱分解主要是側(cè)鏈和一些鍵能低的化學(xué)鍵的斷裂，如側(cè)鏈的β-γ碳碳鍵、β或γ位的OH、β-O-4的C-O鍵等［17］。在350-400℃范圍內(nèi)，這一階段主要是側(cè)鏈被氧化，如脂肪羥基的羧基化或者羰基化和側(cè)鏈的脫羥基［18］。當(dāng)溫度高于400℃，木質(zhì)素?zé)岱纸庵饕獨(dú)w因于木質(zhì)素芳香環(huán)骨架的C-C鍵（主要是5-5'和 β-β'）的裂解以及脫甲氧基［19］。

此外，在木質(zhì)素降解過程中未發(fā)現(xiàn)錳過氧化物酶活力，可能是由其他種類同工酶發(fā)揮著MnP的作用。并且已有研究表明由于木質(zhì)素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其降解過程需要多種酶參與完成，如細(xì)胞色素P450單加氧酶、過氧化氫酶、多功能氧化酶、乙二醛氧化酶、芳醇氧化酶和葡萄糖氧化酶等［20-21］。木質(zhì)素結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其降解酶系不能只通過評價目前研究中所報道的3種酶，后期應(yīng)利用現(xiàn)有先進(jìn)技術(shù)手段（如分泌蛋白組學(xué)）對其降解酶系進(jìn)行宏觀性評價。鮑文英等［22］從土壤中分離得到一株Raoultella ornithinolyticaS12進(jìn)行基因組測序，其基因組中存在大量與木質(zhì)素降解相關(guān)酶類的編碼基因，如漆酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、兒茶酚-1，2-雙加氧酶和原兒茶酸-3，4-雙加氧酶等，這些基因在以堿木質(zhì)素為碳源的培養(yǎng)條件下的表達(dá)量，均高于以葡萄糖為碳源培養(yǎng)的。菌株MP-132與Raoultella ornithinolyticaS12屬于同一種細(xì)菌，其木質(zhì)素降解機(jī)制可能存在較大的相似性，但兩個細(xì)菌來源不同，其潛在的差異性還需進(jìn)一步利用先進(jìn)系統(tǒng)生物學(xué)和先進(jìn)化學(xué)分析手段進(jìn)行研究，為完善細(xì)菌降解木質(zhì)素機(jī)制提供科學(xué)理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究從白蟻腸道篩選分離到一株可降解木質(zhì)素的菌株MP-132，經(jīng)鑒定為解鳥氨酸拉烏爾菌（GenBank登錄號MF455198）。該菌能夠利用堿木質(zhì)素為唯一碳源生長，定性和定量檢測其可分泌胞外漆酶和木質(zhì)素過氧化物酶，并通過觀察木質(zhì)素降解前后的微觀形貌發(fā)生明顯變化。此外，細(xì)菌生物處理后木質(zhì)素的官能團(tuán)結(jié)構(gòu)和熱解特性也發(fā)現(xiàn)改變。在以堿木質(zhì)素為碳源培養(yǎng)過程中，在第7天時，其降解率可達(dá)53.2%，LiP和Lac酶活力分別達(dá)到最大值為105.6 U/L和 32 U/L。本研究系統(tǒng)研究了拉烏爾屬細(xì)菌降解木質(zhì)素的特性，該菌具備木質(zhì)素降解能力，為豐富木質(zhì)素降解微生物提供了優(yōu)良菌株資源。