楊世全 彭丹 費文杰 楊豐 屈高毅 唐威威 歐劍萍 鄧湘雯 周波

（中南林業(yè)科技大學生命科學與技術學院，長沙 410004）

杉木人工林已成為亞熱帶森林的重要組成部分，它具有可持續(xù)的自然更新能力，是決定杉木林群落演替方向和維持杉木林大面積存在的基礎［1］，杉木是我國南方重要的速生用材樹種，廣泛分布于我國17個省份［2］。由于杉木樹干通直，不翹不裂，材質優(yōu)良，是房屋建造和制作家具的上等木材。全國第八次森林資源清查結果表明，杉木林面積達1.096×107hm2，木材蓄積量為 7.260×108m3，分別占喬木林總面積和木材總蓄積量的 6.66%和4.91%［2］。杉木木材用量占我國木材總用量的 1/3左右［3-4］。

在我國杉木種植廣泛的地區(qū)，也是土壤中營養(yǎng)元素缺乏的地方，尤其是有效磷的含量。目前缺磷的現(xiàn)狀嚴重的已經嚴重影響了植物的生長發(fā)育［5］，植物缺乏磷時，導致植物葉綠素減少，植物變得矮小等。除此之外，磷元素也是影響木質素生物合成的因素，王艷麗等［6］發(fā)現(xiàn)，煙草木質素的含量和磷濃度顯著性相關，磷濃度越高木質素含量越高，說明磷影響了煙草纖維素和木質素含量的比例。于琳等［7］發(fā)現(xiàn)磷肥能夠使得亞麻莖桿增粗，促進纖維素細胞數(shù)量增加，有利于纖維素束的形成。在木本植物研究方面，磷元素與木質素生物合成的關系還比較少，Thomas等［8］研究發(fā)現(xiàn)，桉樹在磷元素缺乏的情況下，其木質素的生物合成受到嚴重了抑制。但是磷影響木質素生物合成的分子機制在很大程度上仍不清楚。

KptA/Tpt1是一類磷酸轉移酶［9］，是催化ADP-核糖基化ART超級家族中的H-H-h家族的成員［10］，通常存在于編碼該家族的生物體的單一個體中，KptA/Tpt1在真核細胞中有很強的保守序列，在細菌群中KptA/Tpt1可以修飾RNA以外的底物［11］。研究發(fā)現(xiàn)，在真核生物tRNA剪接過程中，KptA/Tpt1將tRNA 2'-磷酸轉移到NAD+上［12］，釋放出成熟的tRNA和形成ADP-核糖1'-2'環(huán)磷酸（Appr＞p）［13］。然而，KptA/Tpt1蛋白的功能具有生物差異性，因此不同生物的KptA/Tpt1蛋白調控的網絡機制需要進一步的挖掘。在杉木中，磷酸轉移酶KptA/Tpt1是否能調控木質素的合成尚未明晰，因此本論文克隆了杉木磷酸轉移酶ClKptA/Tpt1基因，解析杉木ClKptA/Tpt1基因的表達是否受磷調控，進而影響木質素的生物合成，為杉木育種以及合理施肥提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

一年生的杉木莖材料采自實驗室盆栽的杉木，大腸桿菌DH5α和BL21 star（DE3），原核表達載體pCold-TF均為本實驗室保存。限制性內切酶和T4DNA連接酶均購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及其逆轉錄 用Invitrogen公司的RNA提取試劑盒提取了杉木莖的總RNA，然后用（TaKaRa）公司的逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA。

1.2.2ClKptA/Tpt1基因克隆 根據杉木轉錄組測得的序列，采用 Primer 5.0引物設計軟件設計出擴增磷酸轉移酶基因ClKptA/Tpt1的全長CDS的引物序列，并在5'端和3'帶上BamH I和Hind III兩種酶的酶切位點。以上述逆轉錄后cDNA為模板，進行PCR擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。PCR反應體系為：10×PCR buffer 2 μL，ddH2O 14 μL，dNTPs 2 μL，上下游引物各0.5 μL，rTaq 聚合酶0.5 μL，cDNA 0.5 μL，總體積20 μL。PCR反應條件：94℃5 min；94℃ 30 s，66℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 5 min，4℃ 保存。

1.2.3 磷酸轉移酶基因ClKptA/Tpt1生物信息學分析 在NCBI中下載已報道物種KptA/Tpt1的氨基酸序列，應用MEGA5.0軟件構建了ClKptA/Tpt1與已報道物種KptA/Tpt1的系統(tǒng)進化樹。用GENEDOC軟件對已報道物種KptA/Tpt1和ClKptA/Tpt1的氨基酸序列進行對比分析。用TMHMM Server v.2.0在線分析軟件分析了ClKptA/Tpt1的跨膜結構。用SWISSMODEL工具預測了ClKptA/Tpt1蛋白的三級結構。

1.2.4 表達載體的構建 PCR產物經膠回收后用BamH I和Hind III兩種酶進行雙酶切，同時將pCold-TF載體用BamH I和Hind III兩種酶進行雙酶切，酶切后用天根生物技術有限公司（TIANGEN）的回收試劑盒純化，將純化得到的pCold載體和PCR產物用T4DNA連接酶4℃連接過夜。將連接產物通過熱激轉化的方法轉化到DH5α感受態(tài)中，在轉化后的產物中加入LB液體培養(yǎng)基在37℃震蕩培養(yǎng)箱中170 r/min搖45 min，6 000 r/min離心1 min后，倒掉上清液，取200 μL涂在含100 μg/mL氨芐固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。

1.2.5 磷酸轉移酶基因ClKptA/Tpt1原核表達工程菌的獲得 挑出陽性克隆菌斑，接種于含有100 μg/mL的氨芐液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，用天根（TIANGEN）質粒提取試劑盒提取質粒，將質粒轉化到宿主菌BL21 star（DE3）中，涂布于含有100 μg/mL氨芐青霉素LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置過夜培養(yǎng)，隨機挑選單菌落，進行菌落PCR鑒定。

1.2.6 目的蛋白的誘導表達 將陽性工程菌在含有（100 μg/mL）的氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600值達到0.6左右時，加入終濃度為0.1 mol/L ITPG，在15℃誘導24 h，超聲處理后取上清液進行SDS-PAGE電泳鑒定表達情況。

IPTG濃度的優(yōu)化 選定誘導時間為24 h，溫度為15℃。加入使終濃度分別為0、0.4、0.6、0.8 mmol/L IPTG誘導表達，SDS-PAGE電泳鑒定表達情況。

1.2.7 磷酸轉移酶基因ClKptA/Tpt1表達模式研究 用Invitrogen公司的RNA提取試劑盒分別提取一年生杉木根、莖、葉、花、果的總RNA，然后用TaKaRa公司的逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA，以上述不同的cDNA為模板做RT-PCR，反應體系為：SYBR premis E×Taq（2%）5 μL，上下游引物各0.2 μL，cDNA 0.8 μL，ddH2O 3.8 μL，總體積為10 μL。反應程序：95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min；95℃ 15 s。

分別以不同濃度的磷處理一年生杉木苗，處理濃度分別為：0.067 mmol/L、0.133 mmol/L、0.20 mmol/L，處理時間間隔為60 d，提取不同濃度磷處理后的杉木RNA，逆轉錄成cDNA做RT-qPCR，反應體系同上。

1.2.8 木質素的提取 用Klason法測木質素含量，切取一年生杉木的下面主莖，烘干后研磨成均勻粉末，過篩（40-60 μm）。甲醇提取后，烘干，取約200 mg樣品，用72% H2SO430℃抽提1 h，加入112 mL H2O沸煮1 h，注意保持總體積恒定，該混合液經（40-60 μm）篩過濾，并用500 mL熱水沖洗，烘干后稱重。木質素含量以最后獲得木質素占原始樣品重量的百分數(shù)計算［14］。

2 結果

2.1 ClKptA/Tpt1的克隆與生物信息學分析

提取一年生杉木莖的總RNA，逆轉錄成cDNA。以該cDNA為模板，經PCR擴增和電泳檢測，得到大小1 100 bp左右的特異性條帶（圖1-A），說明克隆得到了目的基因ClKptA/Tpt1。膠回收ClKptA/Tpt1的PCR產物，用BamHI和HindIII酶切ClKptA/Tpt1的PCR產物和pCold-TF載體，采用酶切連接的方式將PCR產物和pCold-TF載體連接成重組質粒，將重組質粒轉化大腸桿菌DH5α，涂布于含有氨芐青霉素（100 μg/mL）LB固體培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，對長出的菌斑進行菌液PCR，經瓊脂糖凝膠電泳檢測后，有1 100 bp左右的目的基因條帶，既為陽性克隆菌斑。挑選3個陽性克隆送去上海生工生物工程有限公司測序。測序結果顯示ClKptA/Tpt1的CDS長1 143 bp。將序列正確的ClKptA/Tpt1用primer primer 5.0翻譯成氨基酸序列，總共編碼380個氨基酸。用MEGA 5.0軟件構建ClKptA/Tpt1和已報道物種KptA/Tpt1氨基酸序列的系統(tǒng)進化樹，KptA/Tpt1進化樹分析表明，杉木的ClKptA/Tpt1氨基酸親緣性與荷花的KptA/Tpt1相似性最高，而與番茄的KptA/Tpt1相似性最低（圖1-B）。利用GENEDOC軟件對比ClKptA/Tpt1與已報道物種KptA/Tpt1 氨基酸序列，研究結果表明ClKptA/Tpt1的氨基酸序列與其它物種都有相同的保守序列NADAR domain（圖1-C）。蛋白的跨膜區(qū)分析結果分析得到ClKptA/Tpt1不存在跨膜氨基酸（圖1-D），利用SWISS-MODEL在線軟件對ClKptA/Tpt1蛋白三級結構進行預測。結果發(fā)現(xiàn)ClKptA/Tpt1主要由α鏈和β鏈組成，都含有配體，但是配體的數(shù)量不同（圖1-E）。

2.2 ClKptA/Tpt1/Tpt1的原核表達

圖1 ClKptA/Tpt1的克隆與生物信息學分析

將上述測序結果與之前已有序列進行比對分析完全相同，說明已經成功構建了杉木磷酸轉移酶ClKptA/Tpt1原核表達載體，對測序正確的菌株進行擴大培養(yǎng)，用質粒提取試劑盒提取質粒，轉化大腸桿菌BL 21 star（DE3）菌株的感受態(tài)細胞，涂布于含有氨芐青霉素（100 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，對長出的菌斑進行菌液PCR，能看到1 100 bp左右的目的條帶（圖2-B），說明重組質粒已經成功轉入了原核表達菌株BL 21 star（DE3）中。將陽性工程菌在含有（100 μg/mL）的氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600值達到0.6左右時，加入終濃度分別為0.0、0.4、0.6、0.8 mmol/L ITPG，在15℃誘導24 h，超聲處理后取上清液進行SDSPAGE電泳檢測。結果顯示，在超聲波破碎后的液體中含有大量的目的蛋白，與pCold-TF空載體相比，在大約100 kD處有大量的蛋白富集（圖2-C），圖2-C中箭頭標注的位置就是目的蛋白的富集區(qū)。

2.3 ClKptA/Tpt1基因的表達模式研究與分析

用Invitrogen公司的RNA提取試劑盒提取了杉木根、莖、葉、花、果的RNA，RT-qPCR結果顯示，ClKptA/Tpt1基因在杉木葉中的表達量最高，其次是果中的表達量，而在莖中的表達量最低（圖3）。

圖2 ClKptA/Tpt1的原核表達

圖3 ClKptA/Tpt1基因的表達模式檢測

2.4 磷調控了ClKptA/Tpt1基因的表達從而影響了杉木木質素的合成

分 別 用0.0、0.067、0.133、0.20 mmol/L不 同濃度的磷處理杉木，每組濃度設計3組平行組，提取不同磷濃度處理下的杉木葉片RNA，逆轉錄成cDNA，利用RT-qPCR技術分析磷處理下ClKptA/Tpt1基因的表達量。結果表明，在0.0-0.20 mmol/L濃度范圍內，ClKptA/Tpt1基因的表達量隨著磷濃度的增加而增加（圖4-A），說明磷在某種程度上調控了ClKptA/Tpt1基因的表達。通過Klason法測定木質素含量。結果表明，在0-0.20 mmol/L不同磷濃度處理下，杉木木質素的含量也出現(xiàn)了上升的趨勢（圖4-B）。綜上，說明磷調控了ClKptA/Tpt1基因的表達量，進而影響了杉木木質素的生物合成。

3 討論

從ART超級家族進化的歷程來看，KptA/Tpt1基因家族是一類獨特的RNA處理系統(tǒng)的組成部份，從原核到生物到真核生物普遍存在［15］。ART超級家族同時促進對ADP-核糖基化在分子水平上的了解。但是，隨著生物學的不斷發(fā)展進步，近幾年的研究已經提出了新的問題。首先，除了通過序列和結構分析確定新的ART家族成員之外，要挖掘ADP-核糖基化過程中蛋白識別的機制，以及激活相關信號通路中的下游事件。其次，KptA/Tpt1酶蛋白在不同物種中的功能差異性目前還不清楚。

圖4 ClKptA/Tpt1基因的表達與木質素合成的關系

蛋白質的空間結構決定蛋白的功能，因此，本論文通過原核表達的方法在大腸桿菌中對該基因進行了蛋白表達，其分子量為55.5 kD，該實驗表明IPTG誘導濃度對蛋白的表達有一定的影響，本實驗IPTG誘導的最適濃度為0.6 mmol/L。對蛋白序列進行了進化樹的構建和蛋白跨膜結構以及蛋白三級結構的預測，得到初步的結果表明該蛋白不具有跨膜氨基酸，三級結構主要以α-螺旋、β-折疊的方式存在。通過進化樹的比對，得到該基因氨基酸序列與荷花該基因的氨基酸序列親緣關系最近，與番茄該基因氨基酸序列的親緣關系最遠。蛋白序列對比分析發(fā)現(xiàn)ClKptA/Tpt1與其他物種的KptA/Tpt1都含有NADAR 結構域，這與原核生物大腸桿菌和病毒的該蛋白具有高度的相似性［16-17］，說明該基因在進化上的保守型。通過對該蛋的表達和分析為后續(xù)實驗奠定了理論基礎。

杉木作為重要的速生用材樹種［18-20］，解析木質素生物合成的分子機制具有重要的意義，但磷對杉木木質素的生物合成的分子機制目前仍不清楚。因此，本研究通過RT-qPCR分析了ClKptA/Tpt1基因表達模式。結果發(fā)現(xiàn)，ClKptA/Tpt1基因在杉木葉中的表達量最高，在莖中的表達量最低。用不同濃度的磷處理杉木苗，利用RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，磷處理后，ClKptA/Tpt1基因在杉木葉中的表達量隨著磷濃度的增加而增加，說明磷調控了該基因在杉木葉中的表達。通過測定木質素含量發(fā)現(xiàn)，隨著磷濃度的增加木質素的含量也增加，說明杉木木質素的生物合成與ClKptA/Tpt1基因有密切的關系。

ClKptA/Tpt1基因怎樣影響木質素的生物合成目前仍未完全明晰。但有關研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥KptA/Tpt1突變體在葉綠體磷酸三糖轉運體（TPT）中存在缺陷［21］，KptA/Tpt1基因的突變降低了磷酸三糖轉運蛋白的活性，導致淀粉含量的積累［21］。Kauder等［22］對具有反義抑制三磷酸轉運蛋白（KptA/Tpt1-plants）的轉基因馬鈴薯植株與野生型植株進行了比較，結果表明轉基因植物的淀粉含量高于野生型，但固定CO2含量不變，說明KptA/Tpt1基因的功能與馬鈴薯淀粉的轉運有關。此外，Englert等［23］發(fā)現(xiàn)KptA/Tpt1的N端含有葉綠體轉運信號肽，但尚不清楚是否在葉綠體和質體中，或KptA/Tpt1蛋白酶僅附著于線粒體外膜或被引入這些細胞器的基質中。在藻類中，三棱藻的KptA/Tpt1作為質體序列參與葉綠體基因的剪接編碼過程［24］。然而，碳水化合物與木質素生物合成呈負顯著性因素，碳水化合物的增加降低木質素的含量［25］。因此，ClKptA/Tpt1基因可能通過影響杉木葉綠體磷酸三糖轉運體蛋白的活性，進而影響了杉木莖中木質素的生物合成。

4 結論

本研究克隆了杉木磷酸轉移酶基因ClKptA/Tpt1，獲得了該基因的全長CDS序列。同時對該基因進行的原核表達，獲得了其體外誘導表達蛋白。表達模式分析發(fā)現(xiàn)該基因在杉木葉中的表達量最高。此外，在一定范圍內的磷處理下，ClKptA/Tpt1的表達量與磷濃度成正比，杉木莖中木質素的含量也隨著磷濃度的增加而增加，磷可調控該基因的表達進而影響杉木木質素的生物合成。