仲雨晴 陳佳佳

（蘇州科技大學(xué)化學(xué)生物與材料工程學(xué)院，蘇州 215011）

水稻（Oryza sativa）作為重要的糧食作物，其經(jīng)濟(jì)性狀，尤其是對(duì)脅迫的耐受性受到密切關(guān)注。干旱、重金屬、鹽堿、冷害等非生物逆境脅迫對(duì)水稻的生長(zhǎng)、發(fā)育和結(jié)實(shí)有嚴(yán)重不良影響，是水稻減產(chǎn)的重要因素。由于過(guò)量使用含有重金屬的農(nóng)藥和抗真菌劑等人為活動(dòng)，耕種土壤和灌溉水中的重金屬污染已成為全球性的農(nóng)業(yè)問(wèn)題。重金屬對(duì)植物的毒性及其隨著食物鏈的積累可能對(duì)人體健康造成危害。銅（Cu）是植物必需的微量元素，對(duì)植物根系表現(xiàn)出高親和力，參與多種生物過(guò)程［1］，但過(guò)高濃度的Cu2+會(huì)產(chǎn)生毒性，特別是在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)、酶活性、光合作用和呼吸作用等方面［2-3］。因此，提高水稻的Cu2+脅迫耐受性對(duì)于保證糧食穩(wěn)定供應(yīng)和農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

稀土元素是一組具有相似物理化學(xué)性質(zhì)的三價(jià)金屬元素［4］。稀土在農(nóng)業(yè)上被廣泛用于促進(jìn)植物種子萌發(fā)、生長(zhǎng)發(fā)育和植物生物量的積累等過(guò)程［5］。與其他稀土元素相比，鑭（La）在環(huán)境和微肥中含量更高，常被用作稀土微肥的主要成分［6］。多項(xiàng)證據(jù)表明，一定濃度的La3+不僅可以保護(hù)植物免受環(huán)境污染，而且可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)發(fā)育。d’Aquino等［7］發(fā)現(xiàn)低濃度La3+有助于硬粒小麥種子的發(fā)芽和幼苗的生長(zhǎng)。La3+可以顯著提高水稻的光合作用，尤其是葉綠體的功能［8］，還可通過(guò)與活性氧直接反應(yīng)改善植物的防御系統(tǒng)來(lái)保護(hù)大豆免受UV-B輻射誘導(dǎo)的氧化脅迫［9］。這些研究均表明La3+對(duì)逆境脅迫下的植物具有良好的保護(hù)作用。

隨著高通量測(cè)序技術(shù)的高速發(fā)展，植物中基因表達(dá)水平的大規(guī)模、高速度鑒定得以實(shí)現(xiàn)。目前，在水稻中雖已有關(guān)于稀土緩解重金屬脅迫的研究，然而多集中于生理生化水平和單分子水平，且不同研究結(jié)果的重復(fù)性較低，稀土鑭對(duì)于銅脅迫下水稻的生物學(xué)功能也尚未明確，然而在轉(zhuǎn)錄組水平系統(tǒng)地分析La3+對(duì)Cu2+脅迫應(yīng)答中的調(diào)控特征更是鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究采用水培模擬法研究在Cu2+脅迫和不同濃度La3+處理下水稻mRNA的特征表達(dá)譜，篩選得到一系列La3+應(yīng)答mRNA，并對(duì)其功能及調(diào)控通路深入分析，在轉(zhuǎn)錄組水平研究La3+對(duì)Cu2+脅迫下水稻保護(hù)作用的分子調(diào)控模式，為水稻的抗逆育種提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

粳稻蘇香粳3號(hào)（Oryza sativaL. subsp.Japonicacv. Suxiang 3）來(lái)源于江蘇太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所。POD和CAT試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所，Trizol試劑購(gòu)于上海Sangon生物工程技術(shù)有限公司，ribo-zero rRNA試劑盒購(gòu)于上海歐易生物科技有限公司，DNaseⅠ購(gòu)于美國(guó)碧云天公司，TruSeq Stranded Total RNA試劑盒購(gòu)于美國(guó)Illumina公司，PCR marker購(gòu)于賽默飛世爾科技公司，AceQ? qPCR SYBR? Green Master Mix熒光試劑購(gòu)于美國(guó)ABI生物技術(shù)有限公司，凝膠回收試劑盒購(gòu)于Omega公司。

1.2 方法

1.2.1 水稻的培養(yǎng)與處理 粳稻蘇香粳3號(hào)種子于36℃催芽1 d露白后轉(zhuǎn)至光溫培養(yǎng)箱（16 h光照/8 h黑暗，溫度30℃，1∶1∶1∶100霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液）。CuSO4溶液（0、10、20、30、50和100 mg/L）模擬脅迫7 d齡幼苗5 d后取樣測(cè)試CuSO4的最佳脅迫濃度。用50 mg/L CuSO4和不同濃度La（NO3）3（0、10、20、30、40和50 mg/L）同時(shí)處理7 d齡幼苗5 d后取樣，測(cè)試La（NO3）3的最佳處理濃度，每組3個(gè)重復(fù)。

1.2.2 生理指標(biāo)測(cè)定 參照文獻(xiàn)［10］進(jìn)行超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）活性測(cè)定，運(yùn)用過(guò)氧化物酶（Peroxidase，POD）試劑盒A084-3和過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）試劑盒A007-1測(cè)定POD和CAT活性。

1.2.3 RNA提取和RNA-Seq分析 提取總RNA，經(jīng)DNase I處理后于1%瓊脂糖電泳評(píng)估RNA完整性，NanoDrop分光光度計(jì)分析RNA純度，使用TruSeq Stranded Total RNA試劑盒創(chuàng)建cDNA文庫(kù)，Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)檢合格后在Illumina Hiseq 4000平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，使用Trimmomatic軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)預(yù)處理，用htseq-count軟件獲取各樣本中比對(duì)到蛋白編碼基因上的序列數(shù)，cufflinks軟件計(jì)算FPKM值。

1.2.4 差異表達(dá)分析和功能注釋 利用DESeq軟件篩選差異表達(dá)基因，用負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，顯著表達(dá)基因篩選條件為：P＜ 0.05，差異倍數(shù)＞ 2，且FDR＜ 0.05。針對(duì)基因本體（Gene ontology，GO）和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)使用DAVID進(jìn)行基因功能注釋（FDR＜ 0.05）。

1.2.5 qRT-PCR分析 使用Trizol試劑提取總RNA，反 轉(zhuǎn) 錄 獲 得cDNA后 在AceQ? qPCR SYBR? Green Master Mix熒光試劑中，以cDNA為模板，以水稻肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參基因，分別擴(kuò)增目標(biāo)基因和內(nèi)參基因。在ABI 7500熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃ 5 min；95℃ 10 s，58℃ 30 s，40 cycles；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s；40℃ 5 min。采用2-ΔΔCT法計(jì)算各基因表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 最適Cu2+脅迫和La3+處理濃度

設(shè)置6個(gè)濃度梯度CuSO4溶液模擬銅脅迫，分別測(cè)定SOD、POD和CAT抗氧化酶活性（圖1）。當(dāng)Cu2+濃度為0-20 mg/L時(shí)，SOD、POD和CAT活性提高，Cu2+濃度升至50 mg/L以上時(shí)，脅迫強(qiáng)度的提高加劇膜脂過(guò)氧化，抗氧化酶活性顯著下降。因此，選擇50 mg/L Cu2+用于后續(xù)脅迫處理。

設(shè)置6個(gè)濃度梯度La（NO3）3處理經(jīng)50 mg/L Cu2+脅迫7日齡水稻幼苗，并測(cè)定SOD、POD和CAT活性（圖2），有La3+處理樣本的POD和CAT活性均低于單獨(dú)Cu2+脅迫組，且在20 mg/L時(shí)呈現(xiàn)最大降幅。因此，重金屬防護(hù)和緩解效應(yīng)最適La3+濃度為20 mg/L。

圖1 不同濃度CuSO4對(duì)水稻抗氧化酶活性的影響

2.2 La3+誘導(dǎo)差異表達(dá)基因的鑒定

利用RNA-Seq檢測(cè)20 mg/L La3++50 mg/L Cu2+處理下水稻葉片mRNA表達(dá)譜，50 mg/L Cu2+處理組水稻葉片作為對(duì)照。使用Illumina HiSeq 4000平臺(tái)共獲得5.764億原始讀取，去除低質(zhì)量和銜接子序列，共有564.11百萬(wàn)個(gè)原始序列（81.28 Gb），各樣品有效數(shù)據(jù)量分布在12.67-14.00 G之間，Q30堿基分布在93.94%-95.15%，平均GC含量46.18%。差異表達(dá)分析共鑒定獲得7 020個(gè)差異表達(dá)基因（圖3），其中3 222個(gè)（45.90%）上調(diào)，3 798個(gè)（54.10%）下調(diào)。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行非監(jiān)督層次聚類分析，結(jié)果如圖4所示，對(duì)照組和La3+處理組的樣品各自聚為一簇，驗(yàn)證了同組樣本間相關(guān)性，聚在同一個(gè)簇中的基因可能具有相似的生物學(xué)功能，在La3+誘導(dǎo)的Cu2+脅迫應(yīng)答中起重要作用。

圖2 不同濃度La（NO3）3對(duì)水稻葉片抗氧化酶活性的影響

圖3 La3+處理的水稻葉片中差異表達(dá)基因的MA圖

2.3 La3+誘導(dǎo)差異基因的功能和通路富集分析

圖4 La3+處理下水稻差異表達(dá)基因聚類圖

為進(jìn)一步挖掘La3+誘導(dǎo)的差異基因的生物學(xué)功能，對(duì)其進(jìn)行了GO富集和KEGG通路分析。采用超幾何分布檢驗(yàn)篩選FDR ＜ 0.05的顯著富集GO條目和KEGG通路。分別統(tǒng)計(jì)La3+誘導(dǎo)差異基因顯著富集的前5條生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分和分子功能（圖5）。KEGG通路富集結(jié)果表明，與單一Cu2+脅迫相比，La3+處理可特異性改變112條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，共涉及5 661個(gè)差異表達(dá)基因。其中富集最顯著的3條通路為苯丙烷生物合成、苯丙氨酸代謝和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，分別對(duì)應(yīng)47、46和71個(gè)差異表達(dá)基因。表1列出了La3+處理下按P值排序排名前10的KEGG通路。

2.4 差異mRNA的表達(dá)驗(yàn)證

為驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果，采用Trizol法提取水稻葉片總RNA（圖6-A）。選擇4個(gè)基因（CHIT13、Laccase、Expansin和GH3.4）進(jìn)行qRT-PCR（圖6-B），所設(shè)計(jì)引物均擴(kuò)增獲得清晰產(chǎn)物條帶。由表2可見(jiàn)，CHIT13、Laccase和GH3.4呈 明 顯 上 調(diào) 趨 勢(shì)，而Expansin表達(dá)水平顯著下調(diào)。分別統(tǒng)計(jì)La3+處理前后各基因相對(duì)表達(dá)量（圖6-C），發(fā)現(xiàn)測(cè)序和qRTPCR所有轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)趨勢(shì)均一致，表明測(cè)序結(jié)果的可靠性。

表1 La3+處理下顯著富集的KEGG通路

3 討論

圖5 水稻中差異表達(dá)基因的基因本體（GO）富集分析

表2 qRT-PCR驗(yàn)證差異表達(dá)基因

稀土元素對(duì)重金屬脅迫的緩解作用已被廣泛報(bào)道。在小麥、黃瓜等植物中已有關(guān)于稀土鑭緩解鎘脅迫的研究［11］；鑭還可通過(guò)調(diào)節(jié)AsA和GSH代謝減輕鎘誘導(dǎo)的氧化損傷，從而提高玉米對(duì)鎘的耐受性［12］。雖然稀土提高植物重金屬耐受性的機(jī)制研究已取得一定進(jìn)展，然而目前多局限于生理生化和單分子水平。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，迫切需要在全轉(zhuǎn)錄組水平系統(tǒng)地探究稀土元素在植物非生物脅迫應(yīng)答中的作用機(jī)制。目前，尚無(wú)關(guān)于稀土La3+誘導(dǎo)下水稻全基因組表達(dá)譜的研究報(bào)道，La3+調(diào)節(jié)水稻重金屬耐受性的確切生物功能和調(diào)控通路并不清楚。

水稻面臨Cu2+脅迫時(shí)，抗氧化機(jī)制被激活，SOD、CAT、POD等抗氧化酶活性提高，以降低活性氧基團(tuán)（ROS）對(duì)膜系統(tǒng)的傷害。低濃度的La3+處理可增強(qiáng)ROS清除系統(tǒng)的能力并抑制自由基形成，從而緩解Cu2+脅迫產(chǎn)生的應(yīng)激損傷，而高濃度的La3+比Cu2+更強(qiáng)烈地誘導(dǎo)ROS，高水平的ROS超出抗氧化劑系統(tǒng)的處理能力，無(wú)法及時(shí)從水稻細(xì)胞中排出，從而不斷積累引起細(xì)胞膜損傷，反而引起酶活上升。

圖6 測(cè)序結(jié)果的qRT-PCR驗(yàn)證

對(duì)Cu2+脅迫和La3+處理下的水稻轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行RNA-Seq測(cè)序共鑒定獲得7 020個(gè)La3+應(yīng)答mRNA。qRT-PCR方法驗(yàn)證了測(cè)序結(jié)果的可靠性，CHIT13、Laccase和GH3.4明顯上調(diào)，而Expansin明顯下調(diào)。此前報(bào)道的水稻重金屬脅迫應(yīng)答基因多為重金屬螯合或轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)的功能基因。本研究通過(guò)功能注釋發(fā)現(xiàn)，La3+調(diào)控水稻抵御Cu2+脅迫過(guò)程中的關(guān)鍵基因多富集于細(xì)胞壁中。通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證的4個(gè)La3+應(yīng)答基因均與植物細(xì)胞壁有關(guān)。細(xì)胞壁是植物暴露于重金屬的第一個(gè)結(jié)構(gòu)，為植物提供了保護(hù)作用和豐富的可再生物質(zhì)。大多數(shù)元素如Zn2+、Cd2+、Fe2+、Mn2+和Cu2+都以二價(jià)離子的形式進(jìn)入植物。因此，細(xì)胞壁可以通過(guò)改變化學(xué)組成來(lái)減少重金屬的吸收。CHIT13編碼的幾丁質(zhì)酶是植物防御系統(tǒng)中重要的酶，能水解幾丁質(zhì)并釋放寡聚體，引發(fā)一系列植物防御反應(yīng)［13］。過(guò)表達(dá)幾丁質(zhì)酶基因的花生對(duì)黃曲霉、晚葉斑病和銹病具有更好的抗性［14］，相同結(jié)果在番茄中也得到驗(yàn)證。本轉(zhuǎn)錄組分析表明，La3+處理強(qiáng)烈誘導(dǎo)幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)，通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞壁的組成，緩解Cu2+對(duì)水稻產(chǎn)生的損害。

Laccase編碼的漆酶催化生成的高級(jí)木質(zhì)素參與植物發(fā)育和脅迫響應(yīng)［15］。已知短柄草木質(zhì)化組織中至少存在兩種漆酶參與木質(zhì)素在細(xì)胞壁上沉積的過(guò)程［16］。本研究La3+處理大大增強(qiáng)了漆酶前體活性，漆酶分泌到植物細(xì)胞次生壁中，催化木質(zhì)素單體氧化聚合，有助于提高水稻對(duì)Cu2+脅迫的抗逆性。

此外，La3+處理后GH3.4編碼的吲哚乙酸-酰胺合成酶上調(diào)，同時(shí)Expansin編碼的擴(kuò)張蛋白表達(dá)水平降低，根據(jù)這種負(fù)相關(guān)表達(dá)模式推測(cè)GH3.4在擴(kuò)張蛋白Expansin表達(dá)中起負(fù)向調(diào)節(jié)作用。水稻GH3家族成員可編碼吲哚乙酸-酰胺合成酶，該酶在脅迫下顯著上調(diào)［17］，可催化植物激素吲哚乙酸（IAA）的酰胺化。擴(kuò)張蛋白為植物細(xì)胞壁糖蛋白，可誘導(dǎo)細(xì)胞壁伸展使之疏松，在植物生長(zhǎng)、發(fā)育和抗逆性中發(fā)揮重要作用［18］，而其表達(dá)取決于IAA水平。據(jù)此推測(cè)GH3.4可通過(guò)催化IAA的酰胺化，抑制由IAA誘導(dǎo)的擴(kuò)張蛋白表達(dá)，從而緩解植物細(xì)胞壁的疏松狀態(tài)，并抑制細(xì)胞攝取過(guò)量Cu2+引起的損傷，從而提高水稻對(duì)重金屬脅迫的抗性（圖7）。

圖7 La3+誘導(dǎo)的細(xì)胞壁防御分子機(jī)制

GO注釋發(fā)現(xiàn)La3+應(yīng)答基因顯著富集于95個(gè)生物過(guò)程、細(xì)胞組分及分子功能，其中富集最顯著的有脂質(zhì)代謝、細(xì)胞壁和質(zhì)膜等，這與干旱脅迫下云南割手密轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致［19］。KEGG通路富集結(jié)果表明5 661個(gè)差異基因富集在氨基酸代謝以及植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路，這與低溫脅迫下水稻的通路富集結(jié)果相似，同時(shí)印證了水稻在受到非生物脅迫時(shí)，調(diào)控代謝和形態(tài)的差異基因開始大量表達(dá)［20］。

在差異基因顯著富集的植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路（Osa04075）中，共有71個(gè)基因在La3+處理后差異表達(dá)，其中29個(gè)表達(dá)上調(diào)，42個(gè)表達(dá)下調(diào)，覆蓋了色氨酸代謝、玉米素生物合成、二萜類生物合成、類胡蘿卜素生物合成、半胱氨酸和蛋氨酸代謝、油菜素生物合成、α-亞麻酸代謝和苯丙氨酸代謝等8個(gè)激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)模塊。其中色氨酸代謝模塊涉及的多個(gè)生長(zhǎng)素合成途徑相關(guān)基因在La3+處理后表達(dá)均下調(diào)。例如，La3+處理能抑制生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（AUX1）和其下游生長(zhǎng)素響應(yīng)蛋白（TIR1）的表達(dá)，引起由泛素介導(dǎo)的生長(zhǎng)素活性誘導(dǎo)基因蛋白（AUX/IAA）水解并釋放出轉(zhuǎn)錄因子ARF。ARF介導(dǎo)生長(zhǎng)素反應(yīng)蛋白（SAUR）和GH3家族成員表達(dá)下調(diào)，從而負(fù)向調(diào)節(jié)水稻細(xì)胞擴(kuò)展生長(zhǎng)，減少重金屬離子的吸收。在苯丙氨酸代謝模塊中，與水楊酸合成相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白NPR1正向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子TGA和PR1表達(dá)上調(diào)，從而增加了水稻的抗逆性。上述基因的差異表達(dá)從通路層面為本研究提出的La3+誘導(dǎo)的重金屬防御模型提供了理論支持。

4 結(jié)論

一定濃度范圍內(nèi)的La3+能顯著提高水稻對(duì)Cu2+脅迫的耐受性，鑒定了一系列La3+響應(yīng)性mRNA和相關(guān)代謝通路，提出了La3+誘導(dǎo)的細(xì)胞壁防御新機(jī)制。