劉建國，趙紅樂，趙宇濤，馬亞玲，李姣姣，金保方

補腎活血方對環(huán)磷酰胺所致小鼠睪丸氧化應激損傷及生精損傷的影響

劉建國1，2，趙紅樂1，趙宇濤2，馬亞玲2，李姣姣2，金保方3

1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710003；2.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046；3.東南大學附屬中大醫(yī)院，江蘇 南京 210009

觀察補腎活血方對環(huán)磷酰胺所致小鼠睪丸氧化應激損傷及生精損傷的影響，探討其可能的作用機制。將50只8～9周齡雄性Balb/C小鼠隨機分為空白組、模型組和補腎活血方低、中、高劑量組，每組10只?？瞻捉M小鼠腹腔注射生理鹽水，其余各組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg造模。空白組和模型組給予蒸餾水灌胃，補腎活血方低、中、高劑量組給予相應濃度補腎活血方灌胃，每日1次，連續(xù)30 d。檢測各組小鼠體質(zhì)量、睪丸和附睪臟器指數(shù)、精子濃度和活力，睪丸組織勻漿檢測超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）活性及丙二醛（MDA）含量，RT-PCR和Western blot分別檢測小鼠睪丸組織Nrf2 mRNA和蛋白的表達。與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量、睪丸和附睪臟器指數(shù)、精子濃度和活力及睪丸組織SOD、CAT活性均顯著降低，MDA含量顯著升高，睪丸組織Nrf2 mRNA和蛋白表達均顯著降低；與模型組比較，補腎活血方組小鼠精子濃度和活力，睪丸組織SOD、CAT活性明顯增加，MDA水平顯著降低，睪丸組織Nrf2 mRNA和蛋白表達均顯著升高。補腎活血方可能通過激活Nrf2/ARE信號通路，改善環(huán)磷酰胺所致小鼠睪丸氧化應激損傷及生精損傷。

補腎活血方；環(huán)磷酰胺；Nrf2/ARE信號通路；睪丸；氧化應激損傷；生精損傷；小鼠

睪丸氧化應激損傷是不育男性的共同特征，它是引起男性不育的重要因素[1]。核因子-E2相關(guān)因子（Nrf2）/抗氧化反應元件（ARE）信號通路是抗氧化反應的中樞調(diào)節(jié)者[2]。環(huán)磷酰胺是一種抗腫瘤和免疫抑制類藥物，其在抑制腫瘤細胞增殖和誘導細胞凋亡的同時，也會影響人體正常細胞的增殖與分化。其中睪丸毒性是環(huán)磷酰胺的主要毒副作用之一，且氧化應激損傷可能是環(huán)磷酰胺引起睪丸生精障礙的主要原因之一[3]。補腎活血方由金保方教授養(yǎng)精膠囊加減化裁而成，有補腎填精、益氣活血之功。前期臨床研究表明，補腎活血方能顯著提高男性不育患者精子濃度、精子活力，且可提高精漿中超氧化物歧化酶（SOD）活性，降低過氧化產(chǎn)物丙二醛（MDA）水平[4]。表明補腎活血方改善精子質(zhì)量可能與其抗氧化作用相關(guān)，但其具體機制不清。因此，本研究通過腹腔注射環(huán)磷酰胺造成小鼠睪丸氧化應激損傷模型，觀察補腎活血方對模型小鼠睪丸氧化應激損傷、生精損傷及Nrf2/ARE信號通路的影響，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性Balb/C小鼠50只，8～9周齡，體質(zhì)量22～25 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物許可證號SCXK（京）2016-0006。動物分籠飼養(yǎng)在普通級動物房，溫度20～22 ℃、相對濕度50%～70%，光周期12 h/12 h，自由攝食飲水。

1.2 藥物及制備

補腎活血方（淫羊藿20 g，熟地黃10 g，制黃精10 g，紫河車10 g，沙苑子10 g，黃芪15 g，王不留行20 g，當歸15 g，制水蛭10 g，荔枝核10 g，煅牡蠣20 g），飲片由陜西省中醫(yī)醫(yī)院中藥房提供，常規(guī)煎煮，過濾，濃縮，臨用前配制成相應質(zhì)量濃度溶液。注射用環(huán)磷酰胺，0.2 g/瓶，江蘇盛迪醫(yī)藥有限公司，批號18032225。

1.3 主要試劑與儀器

SOD測定試劑盒（貨號A001-3-2）、過氧化氫酶（CAT）測定試劑盒（貨號A007-1-1）、MDA測定試劑盒（貨號A003-1-2），南京建成生物工程研究所；全蛋白提取試劑盒（貨號KGP2100）、BCA蛋白含量檢測試劑盒（貨號KGP902），江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；RNAiso plus（貨號AKA7101）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號RR036A）、實時熒光定量PCR試劑盒（貨號RR820B），大連寶生物工程有限公司；羊抗兔二抗（貨號EK020）、β-actin兔抗鼠多克隆抗體（貨號NC011），西安壯志生物科技有限公司；Nrf2兔抗鼠多克隆抗體（貨號16396-1-AP），美國Proteintech公司。電子分析天平，型號AL104，瑞士梅特勒托利多公司；高速低溫離心機，型號Thermo Fresco17，美國Thermo公司；多功能酶標儀，型號Fluostar-Omega，德國BMG LABTECH公司；微量分光光度計，型號Nanodrop ND-1000，美國Nanodrop公司；普通PCR儀，型號Thermo 2720，美國Thermo公司；實時熒光定量PCR儀，型號CFX Connect，美國Bio-Rad公司；UVP化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)，型號ChemiDoc-it，美國UVP公司。

1.4 造模、分組及給藥

將實驗小鼠隨機分為空白組、模型組和補腎活血方低、中、高劑量組，每組10只。參照文獻[5]方法造模，除空白組外，其余小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺50 mg/kg，連續(xù)7 d，空白組腹腔注射等量生理鹽水。造模后空白組、模型組常規(guī)喂養(yǎng)，給予蒸餾水10 mL/kg灌胃；根據(jù)預實驗，中藥給藥劑量按人和動物體表面積換算成臨床成人用藥的3.5、7、14倍，即補腎活血方低、中、高劑量組分別為7.5、15、30 g/kg，予相應劑量灌胃，給藥體積10 mL/kg。每日1次，連續(xù)30 d。

1.5 睪丸、附睪臟器指數(shù)檢測

末次給藥1 h后，稱重。脫臼法處死小鼠，摘取雙側(cè)睪丸、附睪，電子分析天平稱重，計算臟器指數(shù)，即雙側(cè)睪丸或附睪質(zhì)量平均值（mg）/體質(zhì)量（g）。取每只小鼠一側(cè)新鮮睪丸組織用冰鹽水清洗，放入-80 ℃冰箱凍存待用。每組各取5只小鼠用于睪丸組

織勻漿測定SOD、CAT活性及MDA含量，另5只小鼠，每只睪丸剪取約一半用于總RNA提取，另一半用于總蛋白提取。

1.6 精子參數(shù)檢測

一側(cè)附睪尾用眼科剪剪碎，置37 ℃預熱的1 mL生理鹽水中，37 ℃繼續(xù)孵育15 min至精子完全游出，以獲得精子懸液。取精子懸液混勻，滴到血細胞計數(shù)板上，進行精子濃度、活動率檢測。

1.7 睪丸組織超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性及丙二醛含量檢測

每組各取5只小鼠睪丸，準確稱量睪丸質(zhì)量，按體質(zhì)量（g）∶體積（mL）＝1∶9比例加入9倍體積生理鹽水，冰水浴條件下勻漿，制成10%組織勻漿，2500 r/min離心10 min，取上清液待測。按試劑盒說明書進行操作，測定小鼠睪丸組織勻漿SOD、CAT活性和MDA含量。

1.8 RT-PCR檢測小鼠睪丸組織核因子-E2相關(guān)因子mRNA表達

用RNAiso plus試劑提取睪丸樣品總RNA。反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA。cDNA被用作擴增模板，實時熒光定量PCR試劑盒定量分析靶基因的mRNA水平，Nrf2、β-actin引物由上海英駿合成，見表1。β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析。

1.9 Western blot檢測小鼠睪丸組織中核因子-E2相關(guān)因子蛋白表達

用全蛋白提取試劑盒提取睪丸組織總RNA，BCA法測定蛋白濃度，5%濃縮膠和12%分離膠進行蛋白電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜。用TBST配制5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗4 ℃過夜，Nrf2按1∶500稀釋，β-actin按1∶500稀釋，TBST洗膜10 min×3次，二抗室溫孵育2 h，TBST洗膜10 min×3次。避光配制ECL-plus顯影液，混勻后滴加放置平整的塑封膜，用Western曝光機檢測雜交信號。用Image J軟件測定各組目標條帶灰度值，進行分析。

表1 PCR各基因引物序列

基因名稱引物序列（5’～3’）產(chǎn)物長度/bp Nrf2F：ACTCCTGGACGGGACTATTG244 R：GGCCGTTCTGTTTGACACTT β-actinF：GCTACAGCTTCACCACCACAG300 R：GGTCTTTACGGATGTCAACGTC

1.10 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 補腎活血方對模型小鼠體質(zhì)量和睪丸、附睪質(zhì)量及臟器指數(shù)的影響

與空白組比較，模型組小鼠體質(zhì)量、睪丸和附睪質(zhì)量及臟器指數(shù)明顯降低（＜0.01）；與模型組比較，補腎活血方中、高劑量組小鼠體質(zhì)量、睪丸質(zhì)量顯著增加（＜0.01，＜0.05），補腎活血方中劑量組小鼠附睪質(zhì)量顯著增加（＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 各組小鼠體質(zhì)量和睪丸、附睪質(zhì)量及臟器指數(shù)比較（±s）

注：與空白組比較，**＜0.01；與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01

2.2 補腎活血方對模型小鼠精子濃度、活動率的影響

與空白組比較，模型組小鼠精子濃度、活動率顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，補腎活血方各劑量組小鼠精子濃度、活動率明顯增加（＜0.01）。結(jié)果見表3。

2.3 補腎活血方對模型小鼠睪丸組織超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性及丙二醛含量的影響

與空白組比較，模型組小鼠睪丸組織SOD、CAT活性顯著降低（＜0.01），MDA含量顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，補腎活血方各劑量組小鼠睪丸組織SOD、CAT活性顯著增加（＜0.01），補腎活血方中、高劑量組小鼠睪丸組織MDA含量顯著降低（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見表4。

表3 各組小鼠精子濃度、活動率比較（±s）

注：與空白組比較，**＜0.01；與模型組比較，##＜0.01

表4 各組小鼠睪丸組織SOD、CAT活性及MDA含量比較（±s）

注：與空白組比較，**＜0.01；與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01

2.4 補腎活血方對模型小鼠睪丸組織核因子-E2相關(guān)因子mRNA和蛋白表達的影響

與空白組比較，模型組小鼠睪丸組織Nrf2 mRNA和蛋白表達均顯著降低（＜0.05，＜0.01）；與模型組比較，補腎活血方各劑量組小鼠睪丸組織Nrf2 mRNA和蛋白表達均顯著升高（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見圖1、圖2。

注：與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

3 討論

男性生殖系統(tǒng)中少量活性氧的存在是調(diào)節(jié)正常精子功能所必需的，如精子獲能、頂體反應及精卵融合等[6]；但其過量產(chǎn)生則造成氧化應激損傷，引起精子損傷、睪酮合成障礙及生精細胞凋亡等，從而導致男性不育[7]。多項研究表明，環(huán)磷酰胺在造成生精損傷的同時，也可破壞睪丸組織內(nèi)氧化/抗氧化的平衡系統(tǒng)，降低抗氧化能力，促進自由基及其氧化產(chǎn)物過量產(chǎn)生，從而造成睪丸氧化應激損傷[8-10]。

SOD能清除超氧陰離子自由基（O2-），保護細胞免受損傷，對機體的氧化和抗氧化平衡起著至關(guān)重要的作用。CAT是機體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)中重要的催化過氧化氫分解的酶類。SOD、CAT活性可間接反映機體清除氧自由基的能力。MDA是自由基攻擊生物膜中多不飽和脂肪酸而引起的脂質(zhì)過氧化作用的最終分解產(chǎn)物之一，是常用的細胞脂質(zhì)過氧化指標。MDA水平可間接反映機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。因此，聯(lián)合檢測組織中SOD、CAT活性及MDA含量，能確切地反映組織抗氧化能力和氧化應激損傷程度。

“腎藏精，主生殖”是中醫(yī)傳統(tǒng)理論，對治療男性不育癥至關(guān)重要。精液/子乃生殖之精，是“腎精”的重要組成部分。精液/子的正常與否取決于腎的功能。因此，補腎填精法是改善生殖功能，治療男性不育的基本方法。補腎活血方正是基于“腎藏精，主生殖”理論，以補腎填精、益氣活血法組方。方中熟地黃甘溫質(zhì)潤入腎，善滋補腎陰、填精益髓，淫羊藿益腎助陽，兩者合用補腎填精、補陰益陽，共為君藥。黃精補腎健脾，先后天之精同補；紫河車系血肉有情之品，能補腎益精、養(yǎng)血益氣，沙苑子、煅牡蠣與黃芪共用補氣固精，恢復“腎藏精”的功能，當歸養(yǎng)血活血，取精血同源，養(yǎng)血填精之功，共為臣藥。荔枝核、王不留行、制水蛭行氣活血，改變久病多瘀的病理狀態(tài)，并能促進藥物吸收，共為佐藥。諸藥合用，補腎填精、益氣活血，則種子可成。有研究發(fā)現(xiàn)，補腎精單味中藥和復方具有抗氧化的作用，通過抑制活性氧活性，降低MDA含量，并增強對抗活性氧的酶清除系統(tǒng)的分泌，更好地清除氧自由基，從而改善精子發(fā)生的微環(huán)境[11-12]?，F(xiàn)代藥理研究表明，補腎活血方含多種多糖類及黃酮類植物藥，如地黃多糖、淫羊藿多糖、荔枝多糖、黃精多糖、當歸多糖、淫羊藿總黃酮等，均有明確的抗氧化應激損傷作用[5，13-15]。

本研究結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺可致小鼠體質(zhì)量和睪丸、附睪質(zhì)量減輕，精子濃度、活動率顯著下降，睪丸組織抗氧化酶SOD和CAT活性明顯降低，過氧化產(chǎn)物MDA含量明顯升高，說明環(huán)磷酰胺成功造成小鼠生精損傷及睪丸組織氧化應激損傷，這與之前的研究[9-10]相一致。給予補腎活血方干預后，小鼠體質(zhì)量和睪丸、附睪質(zhì)量，精子濃度、活動率顯著增加，睪丸組織中SOD、CAT活性明顯提高，MDA含量顯著降低，表明補腎活血方可明顯改善模型小鼠的生精損傷及睪丸氧化應激損傷。

Nrf2是調(diào)節(jié)細胞抗氧化應激的重要因子，正常情況下，Nrf2和細胞骨架相關(guān)蛋白Keap1結(jié)合成二聚體的形式存在于細胞漿中，從而使保護細胞的酶類和抗氧化物處于基礎表達水平，細胞處于穩(wěn)定狀態(tài)。在氧化應激等情況下Nrf2與Keap1解離被激活，Nrf2不穩(wěn)定性增加并轉(zhuǎn)入細胞核中與ARE啟動子部位結(jié)合，啟動Nrf2下游抗氧化蛋白靶基因的表達，例如血紅素加氧酶、SOD、CAT、谷胱甘肽過氧化物酶等，從而增強機體抗氧化能力[3]。由上可知，SOD、CAT等抗氧化物質(zhì)的增加與Nrf2/ARE信號通路的激活有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺可抑制Nrf2/ARE信號通路，降低Nrf2及其下游抗氧化酶類的表達，從而造成睪丸氧化損傷[16-17]，這與本研究結(jié)果相一致。給予補腎活血方干預后，小鼠睪丸組織Nrf2 mRNA和蛋白表達均顯著升高，提示補腎活血方提高睪丸組織SOD、CAT活性可能與其上調(diào)Nrf2的表達，激活Nrf2/ARE通路有關(guān)。

綜上，補腎活血方可改善環(huán)磷酰誘導的生精障礙模型小鼠精子參數(shù)，改善生精功能，減輕睪丸氧化應激損傷，其機制可能與補腎活血方上調(diào)Nrf2表達，激活Nrf2/ARE通路，促進睪丸內(nèi)抗氧化物質(zhì)的表達，提高抗氧化能力有關(guān)。

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Effects ofPrescription on Cyclophosphamide-induced Testicular Oxidative Stress Damage and Spermatogenic Injury in Mice

LIU Jianguo1,2, ZHAO Hongle1, ZHAO Yutao2, MA Yaling2, LI Jiaojiao2, JIN Baofang3

To investigate the effects ofPrescription on cyclophosphamide-induced testicular oxidative stress damage and spermatogenic injury in mice; To discuss its possible mechanism.Totally fifty 8-9 week old male Balb/C mice were randomly divided into blank group, model group andPrescription low-, medium-, and high-dosage groups, with 10 mice in each group. The mice in blank group were injected intraperitoneally with saline and the mice in the remaining groups were intraperitoneally injected with cyclophosphamide 50 mg/kg to induce model. Then the blank group and the model group were administrated with distilled water, andPrescription was administered to the corresponding concentrations ofPrescription groups once a day for 30 consecutive days. The body weight, and testicular and epididymal organ indexes sperm concentration and vitality of mice in each group were tested. Testis tissue homogenate were tested for SOD, CAT activity, and MDA content. RT-PCR and Western blot were used to detect the expression of Nrf2 mRNA and protein in mouse testis.Compared with the blank group, the body weight, testicular and epididymal index, sperm density and vitality, and SOD and CAT activity in the testis were significantly reduced, and MDA levels in the testis significantly increased in the model group. The expression of Nrf2 mRNA and protein in testis was significantly reduced. Compared with the model group, the body weight, testicular and epididymal index, sperm density and vitality, the activity of SOD and CAT in the testis increased significantly in thePrescription groups, and the level of MDA decreased significantly. The expressions of Nrf2 mRNA and protein in the testis tissues significantly increased in thePrescription groups.Prescription can improve cyclophosphamide-induced testicular oxidative stress damage and spermatogenic injury in mice through activating the Nrf2/ARE signaling pathway.

Prescription; cyclophosphamide; Nrf2/ARE signaling pathway; testis; oxidative damage; spermatogenic injury; mice

R285.5

A

1005-5304(2020)09-0068-05

10.3969/j.issn.1005-5304.202001195

國家自然科學基金（81603631）；陜西省自然科學基金（2016JQ8034）；陜西省中醫(yī)藥管理局項目（2015-JC012）

金保方，E-mail：hexiking@126.com

（2020-01-13）

（2020-02-17；編輯：華強）