繆夢琦，石高峰，盧燕，王佩娟，張健

補腎方藥干預(yù)皮質(zhì)酮所致早發(fā)性卵巢功能不全大鼠比較研究

繆夢琦1，石高峰1，盧燕2，王佩娟2，張健3

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，江蘇 南京 210028；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，江蘇 南京 210028；3.江蘇省中醫(yī)藥研究院，江蘇 南京 210028

比較補腎活血方、左歸丸和右歸丸3種補腎方藥干預(yù)皮質(zhì)酮所致早發(fā)性卵巢功能不全效果。方法 50只雌性SD大鼠隨機分為正常組、模型組、補腎活血方組、左歸丸組、右歸丸組，每組10只。皮下注射皮質(zhì)酮建立早發(fā)性卵巢功能不全大鼠模型。各給藥組給予相應(yīng)藥物干預(yù)，3周后取大鼠卵巢組織，檢測血清雌二醇、卵泡刺激素、抗苗勒管激素濃度，評價卵巢功能。左側(cè)卵巢組織HE染色觀察卵巢形態(tài)，鏡下進行卵泡計數(shù)；Western blot檢測右側(cè)卵巢組織Angptl4和Np4蛋白表達。與正常組比較，模型組大鼠卵巢組織血清雌二醇、抗苗勒管激素濃度降低，卵泡刺激素濃度升高；卵巢顆粒細(xì)胞排列紊亂，閉鎖卵泡增多，其他各級卵泡減少，Angptl4和Np4蛋白表達升高。經(jīng)補腎方藥干預(yù)后上述情況均有不同程度改善，其中補腎活血方效果最優(yōu)。3種補腎方藥均能治療皮質(zhì)酮所致早發(fā)性卵巢功能不全，其機制可能與下調(diào)卵巢組織Angptl4和Np4的表達相關(guān)。

補腎方藥；皮質(zhì)酮；早發(fā)性卵巢功能不全；Angptl4；Np4；大鼠

早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是指40歲以前月經(jīng)紊亂（閉經(jīng)或月經(jīng)稀少）、血清促卵泡刺激素水平升高和血清雌二醇水平降低的一種臨床綜合征[1]。研究表明，POI可能會誘發(fā)心血管疾病、骨質(zhì)疏松、神經(jīng)認(rèn)知功能下降，甚至導(dǎo)致壽命縮短[2]。有學(xué)者認(rèn)為，POI發(fā)病原因以腎虛為本，治療原則是補腎[3]。補腎活血方、左歸丸和右歸丸均為補腎方藥，補腎活血方為江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院臨床經(jīng)驗方，側(cè)重于補腎活血。左歸丸和右歸丸均出自《景岳全書》，左歸丸可滋腎陰，右歸丸可補腎陽。研究表明，上述3種補腎代表方劑均可用于POI治療[4-6]，但效果是否有所不同迄今尚未見報道。因此，本實驗探究這3種補腎代表方劑干預(yù)皮質(zhì)酮所致POI的效果并進行比較。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雌性SD大鼠50只，上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，體質(zhì)量（200±20）g，動物許可證號SCXK（滬）2017-0005。飼養(yǎng)于（24±2）℃、相對濕度（60±10）%環(huán)境，12 h/12 h明暗交替，自由攝食飲水。

1.2 主要試劑與儀器

皮質(zhì)酮（CORT）試劑（批號E9ERR8XX），上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；大鼠CORT ELISA試劑盒（批號20190105）、雌二醇（E2）ELISA試劑盒（批號20190105）、卵泡刺激素（FSH）ELISA試劑盒（批號20190107）、抗苗勒管激素（AMH）ELISA試劑盒（批號20190107），武漢貝茵萊生物科技有限公司；Np4兔抗（批號Ab84598）、Angptl4兔抗（批號Ab87325），英國Abcam公司。熒光倒置顯微鏡（德國Carl Zeiss 公司），酶標(biāo)儀（美國Bio Tek公司）。

1.3 藥物及制備

補腎活血方（生地黃10 g，淫羊藿10 g，菟絲子10 g，川芎10 g，當(dāng)歸10 g，白芍10 g，柴胡6 g，黃柏10 g，知母10 g，牡丹皮10 g，鉤藤10 g），飲片購自江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房；左歸丸、右歸丸，北京同仁堂股份有限公司同仁堂制藥廠，批號分別為19060032、19070045。補腎活血方加10倍體積水，浸泡30 min，煎煮30 min，收集煎煮液，再加5倍體積水，煎煮30 min，收集煎煮液，將2次煎煮藥液混合，濃縮為含原藥材4.2 g/mL。左歸丸和右歸丸用蒸餾水配成混懸液。

1.4 分組、造模及給藥

實驗大鼠隨機分為正常組、模型組、補腎活血方組、左歸丸組和右歸丸組。皮下注射CORT建立POI大鼠模型，CORT溶于生理鹽水配制成4 mg/mL混懸液，按40 mg/（kg?d）劑量皮下注射。正常組注射等體積生理鹽水。注射體積為1 mL/100 g，每日1次，連續(xù)21 d。造模之日起，正常組、模型組予生理鹽水灌胃；補腎活血方組予補腎活血方水煎液（11.13 g/kg）灌胃，左歸丸組予左歸丸混懸液（1.89 g/kg）灌胃，右歸丸組予右歸丸混懸液（2.835 g/kg）灌胃。給藥量根據(jù)人臨床劑量和大鼠體表面積換算等效劑量比率表計算，大鼠灌胃體積為1 mL/100 g，每日1次，連續(xù)3周。末次給藥后禁食24 h，大鼠注射10%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，離心，取血清，4 ℃保存。取雙側(cè)卵巢組織。

1.5 血清皮質(zhì)酮、雌二醇、卵泡刺激素、抗苗勒管激素測定

ELISA試劑盒測定血清CORT、E2、FSH、AMH濃度，嚴(yán)格按試劑盒說明書進行操作。

1.6 病理觀察

取左側(cè)卵巢，室溫10%福爾馬林固定，石蠟包埋，切片（厚度約5 μm），HE染色，100倍鏡下觀察卵巢組織形態(tài)，400倍鏡下進行初級卵泡、竇前卵泡、竇狀卵泡、閉鎖卵泡計數(shù)。

1.7 Western blot檢測

大鼠卵巢組織置于RIPA緩沖液中溶解，獲得卵巢組織蛋白。按BCA試劑盒說明書操作，確定總蛋白含量。通過SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，然后將蛋白質(zhì)移至硝酸纖維素濾膜，室溫5%牛血清白蛋白封閉1 h。隨后將膜置于相應(yīng)一抗中，4 ℃孵育過夜。再置于二抗中，室溫孵育1 h。最后將膜置于Odyssey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)中掃描。以相同方式測量β-actin水平作為對照，使用Image J軟件分析條帶強度，計算蛋白相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 補腎方藥對模型大鼠血清皮質(zhì)酮、雌二醇、卵泡刺激素、抗苗勒管激素水平的影響

與正常組比較，模型組大鼠血清CORT、FSH水平顯著升高（＜0.05，＜0.01），AMH水平顯著降低（＜0.05），E2水平有下降趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清CORT水平顯著降低（＜0.05，＜0.01），補腎活血方組大鼠血清FSH水平顯著降低（＜0.05），AMH水平升高，右歸丸組AMH水平升高明顯（＜0.01），E2水平有上升趨勢，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（＞0.05）。結(jié)果見圖1。

2.2 病理觀察結(jié)果

模型組較正常組大鼠卵泡顆粒細(xì)胞層排列紊亂，且卵泡中卵母細(xì)胞消失，竇狀卵泡數(shù)減少，閉鎖卵泡顯著增多，但初級卵泡、竇前卵泡和成熟卵泡均明顯減少；各給藥組較模型組大鼠卵泡顆粒細(xì)胞排列較為規(guī)則，大多卵泡結(jié)構(gòu)完整，竇狀卵泡數(shù)增加，竇前卵泡和竇狀卵泡數(shù)增加，閉鎖卵泡數(shù)減少，其中補腎活血方作用最顯著。結(jié)果見圖2、表1。

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

圖2 各組大鼠卵巢組織形態(tài)（HE染色，×100）

表1 各組大鼠卵巢組織各級卵泡計數(shù)比較（±s，個）

注：與正常組比較，*＜0.05，**＜0.01；與模型組比較，#＜0.05，##＜0.01

2.3 補腎方藥對模型大鼠卵巢組織Angptl4和Np4蛋白表達的影響

與正常組比較，模型組大鼠Angptl4和Np4蛋白表達顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.001）；與模型組比較，各給藥組大鼠卵巢組織Angptl4和Np4蛋白表達均有下調(diào)，補腎活血方組Angptl4和Np4蛋白表達顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.001），左歸丸組Angptl4蛋白表達顯著下調(diào)，右歸丸組Np4蛋白表達顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（＜0.05）。結(jié)果見圖3。

注：與正常組比較，***P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05，###P＜0.001

3 討論

POI致病原因復(fù)雜，目前90%POI病例機制仍然未知[7]。隨著醫(yī)學(xué)模式向生物心理社會模式的轉(zhuǎn)變，以及家庭和社會壓力增加，環(huán)境、社會和心理因素壓力所造成的損害日益影響女性生殖內(nèi)分泌功能[8-9]。中醫(yī)認(rèn)為，長期惱怒成火，憂思過度，會引起經(jīng)血虧虛、血行不暢，經(jīng)血不下，從而促使POI的發(fā)生[10]。糖皮質(zhì)激素（嚙齒動物中主要為CORT）的分泌增加被認(rèn)為是應(yīng)激反應(yīng)的特定指標(biāo)，且血清中糖皮質(zhì)激素水平升高常被作為判斷機體是否處在應(yīng)激狀態(tài)的客觀指標(biāo)[11]。Whirledge等[12]認(rèn)為，糖皮質(zhì)激素引起應(yīng)激反應(yīng)會損害卵巢功能。杜小芳等[13]認(rèn)為，過量的糖皮質(zhì)激素引起應(yīng)激反應(yīng)后會導(dǎo)致卵巢衰老。本研究結(jié)果表明，大鼠皮下注射CORT可造成大鼠血清CORT濃度升高，E2濃度下降，F(xiàn)SH濃度升高，且AMH濃度下降。

POI根據(jù)臨床表現(xiàn)屬中醫(yī)學(xué)“閉經(jīng)”“不孕”“血枯”“無子”“續(xù)斷”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為該病與腎精虧虛、情志郁結(jié)等相關(guān)。因此，在卵巢衰老治療中常用補腎方藥[14]。本研究結(jié)果顯示，補腎方藥均可不同程度地改善CORT誘導(dǎo)的POI大鼠卵巢功能。其中左歸丸和右歸丸二者配方作用相似。左歸丸由熟地黃、山藥、枸杞子、山萸肉、菟絲子、鹿角膠、川牛膝、龜甲膠組成，右歸丸由熟地黃、山藥、枸杞子、山萸肉、菟絲子、鹿角膠、炒杜仲、當(dāng)歸、肉桂、炮附子組成。左歸丸和右歸丸對POI均具有改善作用可能是由于二者含有相同6味藥，但右歸丸相比左歸丸治療效果更好，可能是炒杜仲、當(dāng)歸、肉桂和炮附子的共同作用。具體機制需進一步拆方研究進行對比分析。綜合實驗數(shù)據(jù)表明，補腎活血方相比左歸丸和右歸丸其治療效果最優(yōu)。因此推測在治療POI時，從補腎活血的角度施治可能會取得更好的效果。其結(jié)果進一步表明POI主要的中醫(yī)病機可能為腎虛血瘀。

為了探究補腎活血方治療皮質(zhì)酮所致POI的機制，本課題組前期利用蛋白組學(xué)發(fā)現(xiàn)一些蛋白質(zhì)的變化，結(jié)果顯示，模型組較正常組大鼠卵巢組織Angptl4和Np4蛋白表達顯著上調(diào)，補腎活血方組較模型組Angptl4和Np4蛋白表達顯著下調(diào)。根據(jù)實驗結(jié)果推測，這2個蛋白與POI的發(fā)病及治療相關(guān)。因此，本研究比較3種補腎方劑治療POI的效果，并進一步對比三方對Angptl4和Np4蛋白表達的影響。Western blot結(jié)果表明，補腎方藥均可降低大鼠卵巢組織Angptl4和Np4蛋白表達，表明Angptl4和Np4上調(diào)可能是POI的重要環(huán)節(jié)，下調(diào)卵巢Angptl4和Np4的表達可能是治療該疾病的標(biāo)志信號，其中補腎活血方效果最優(yōu)。

綜上，本研究顯示，補腎活血方、左歸丸和右歸丸對皮質(zhì)酮誘導(dǎo)POI模型大鼠均有改善作用，但作用效果存在差異，其機制可能與下調(diào)卵巢組織Angptl4和Np4的表達相關(guān)，但Angptl4、Np4與POI之間的關(guān)系需今后進一步的實驗探索。

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Comparative Study on Effect of Tonifying Kidney Prescriptions on Corticosterone Induced Premature Ovarian Insufficiency Rats

MIAO Mengqi1, SHI Gaofeng1, LU Yan2, WANG Peijuan2, ZHANG Jian3

To compare the effects ofPrescription,Pills andPills on the treatment of corticosterone induced premature ovarian insufficiency.Totally fifty female SD rats were randomly divided into normal group, model group,Prescription group,Pills group andPills group, with 10 rats in each group. Premature ovarian insufficiency rat model was established by subcutaneous injection of corticosterone. Each administration group was given relevant medicine for intervention. Three weeks after modeling and administration, ovarian histological analysis and the concentrations of estradiol, follicle stimulating hormone, and anti-Mullerian hormone were used to evaluate ovarian function. The ovarian morphology and count follicles with HE staining microscopy on the left ovary tissue were observed. Western blot was used to detect the expression of Angptl4 and Np4 protein in the right ovarian tissue.Compared with the normal group, the concentration of estradiol and anti-Mullerian hormone decreased in the model group, and the follicle stimulating hormone concentration increased; the ovarian granulosa cells were disorderly arranged, the atretic follicles increased, the follicles at other levels decreased, and the expression of Angptl4 and Np4 protein increased. The above conditions were improved after the intervention of the three tonifying kidney prescriptions, and the effect ofPrescription was the best.The three prescriptions can treat corticosterone induced premature ovarian insufficiency. The mechanism may be related to the down-regulation of expressions of Angptl4 and Np4 in ovarian tissue.

tonifying kidney prescriptions; corticosterone; premature ovarian insufficiency; Angptl4; Np4; rats

R285.5

A

1005-5304(2020)08-0063-05

10.3969/j.issn.1005-5304.202002499

江蘇省社會發(fā)展重點項目（BE2019766）；江蘇省研究生科研創(chuàng)新計劃（KYCX19_1279）

張健，E-mail：zjwonderful@hotmail.com

（2020-02-26）

（2020-03-27；編輯：華強）