宣守松，羅志榮，李涵，趙恬田，牟芳芳，邵水金，國海東

淫羊藿苷聯(lián)合白藜蘆醇促進誘導性多能干細胞向心肌細胞分化的作用及機制研究

宣守松，羅志榮，李涵，趙恬田，牟芳芳，邵水金，國海東

上海中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院解剖教研室，上海 201203

研究淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合應用是否可進一步提高誘導性多能干細胞（iPS）向心肌細胞分化的作用，探討其可能的機制。CCK8法檢測淫羊藿苷和白藜蘆醇對iPS增殖的影響；分別加入不同濃度淫羊藿苷和白藜蘆醇誘導iPS向心肌細胞分化，RT-qPCR檢測TNNI3、Cx43、α-actinin心肌細胞標志物和Oct4干細胞標志物；在常規(guī)誘導基礎(chǔ)上，加入0.05 μmol/L淫羊藿苷和0.1 μmol/L白藜蘆醇聯(lián)合誘導iPS，Western blot檢測心肌肌鈣蛋白T（cTnT）的表達，RT-qPCR檢測miR-1和miR-133的表達。0.05 μmol/L淫羊藿苷對iPS增殖無明顯影響，0.1、1、10 μmol/L淫羊藿苷均能促進iPS增殖，各濃度白藜蘆醇均可抑制iPS增殖；不同濃度淫羊藿苷均可下調(diào)Oct4的表達，上調(diào)TNNI3、α-actinin和Cx43的表達；白藜蘆醇可下調(diào)Oct4的表達，上調(diào)TNNI3、α-actinin和Cx43的表達。與常規(guī)誘導方法比較，添加淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合處理可明顯上調(diào)α-actinin mRNA、cTnT蛋白和miR-1的表達，顯著下調(diào)miR-133的表達。淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合誘導可進一步促進iPS向心肌細胞的分化，其機制可能與調(diào)控miR-1和miR-133的表達有關(guān)。

淫羊藿苷；白藜蘆醇；誘導性多能干細胞；分化；miRNA

近年來，應用干細胞替代傳統(tǒng)手段治療心肌梗死逐漸受到重視。干細胞是具有多向分化潛能的原始細胞，在一定條件下可分化為多種功能細胞或組織器官。動物實驗和初期臨床試驗已證實干細胞移植是一種安全可行的治療方法，干細胞在一定程度上可修復壞死心肌，減少梗死面積，改善受損心臟功能[1-4]。誘導性多能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPS）是利用病毒載體將4個轉(zhuǎn)錄因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）的組合轉(zhuǎn)入分化的體細胞中，使其重編程為類似胚胎干細胞（embryonic stem cell，ESC）的一種干細胞類型。iPS具有與ESC類似的自我更新和多向分化潛能。因其取材容易、避免倫理問題、同體移植免疫排斥反應弱等諸多優(yōu)點逐漸成為心臟再生治療中備受關(guān)注的細胞來源。iPS在體外可被誘導為心肌細胞，移植iPS來源的心肌細胞（iPS derived cardiomyocytes，iPS-CMs）可改善心肌梗死后心功能，縮小梗死面積[5-6]。淫羊藿苷是淫羊藿的主要活性成分，不僅對心肌缺血具有保護作用[7]，還可促進ESC向心肌細胞分化[8-9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷能提高成纖維細胞重編程為心肌樣細胞的效率[10]。白藜蘆醇作為一種天然的多酚物質(zhì)，可抑制心肌細胞凋亡并改善心肌梗死后心功能[11]。此外，白藜蘆醇還能促進干細胞向心肌細胞的分化[12]。因此，本研究主要觀察淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合應用是否可進一步提高iPS向心肌分化的作用，探討其可能的機制，為解決iPS-CMs移植面臨的關(guān)鍵問題提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 藥物

淫羊藿苷和白藜蘆醇，批號17061221，購自上海同田生物技術(shù)公司，純度≥98%。

1.2 細胞

人iPS，購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫。

1.3 主要試劑與儀器

iPS培養(yǎng)基（貨號CA1014500）、iPS消化液（貨號CA3001500）和人心肌細胞分化培養(yǎng)基（貨號CA2004500），北京賽貝生物技術(shù)有限公司；心肌肌鈣蛋白T（cTnT，貨號ab8295），美國Abcam公司；qPCR Master Mix（貨號M3003S），美國NEB公司；miRcute miRNA提取分離試劑盒（貨號DP501）和miRcute增強型miRNA熒光定量檢測試劑盒（貨號FP411），天根生化科技（北京）有限公司；彩色預染蛋白質(zhì)分子量標準（貨號P0068）、CCK8（貨號C0038）和BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號P0012），上海碧云天生物技術(shù)有限公司；Trizol Reagent（貨號15596018），美國Invitrogen公司；ECL化學發(fā)光底物試劑盒（貨號32106），美國Pierce公司?；瘜W發(fā)光成像分析系統(tǒng)（Tanon 520，上海天能），多功能酶標儀（Synergy 2，BioTeck公司），電泳儀（Mini Gel Tank，美國Life Technologies公司），轉(zhuǎn)膜儀（小型轉(zhuǎn)印槽1703930，美國Bio-Rad公司），細胞培養(yǎng)箱（371，美國Thermo fisher Scientific），實時熒光定量PCR儀（StepOne，美國ABI公司）。

2 實驗方法

2.1 CCK8法檢測

將生長狀態(tài)良好的人iPS按1∶6比例傳代至96孔板，每孔加100 μL細胞懸浮液，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。于10 mg淫羊藿苷和10 mg白藜蘆醇粉末中加1 mL DMSO溶解，再加9 mL PBS稀釋，分別得到濃度為1×10-3mol/L和3×10-3mol/L的母液。然后用培養(yǎng)液將淫羊藿苷母液稀釋為0.05、0.1、1、10 μmol/L，將白藜蘆醇母液稀釋為10、25、50、100 μmol/L。將不同濃度含淫羊藿苷和白藜蘆醇的培養(yǎng)液加到對應標記的細胞中，每孔100 μL。分別于培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加10 μL CCK8溶液處理2 h，酶標儀檢測細胞活性，讀取450 nm波長處OD值。

2.2 淫羊藿苷和白藜蘆醇誘導分化實驗

將生長狀態(tài)良好的人iPS按1∶6比例傳代至12孔板，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當細胞密度達90%～98%時，開始誘導分化。同前配制不同濃度淫羊藿苷（0.01、0.05、0.1、1、10 μmol/L）和白藜蘆醇（0.01、0.1、1 μmol/L）溶液。將不同濃度淫羊藿苷和白藜蘆醇溶液加至相應孔中，每孔1 mL，連續(xù)誘導7 d，每日換液。正常組常規(guī)培養(yǎng)，不加誘導劑。

2.3 RT-qPCR檢測

Trizol法提取細胞總RNA，經(jīng)酶標儀測定RNA濃度。取1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA。采用SYBR Green qPCR Mix進行PCR檢測。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性10 s、55 ℃退火20 s、72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參對各基因表達校正并進行比較。引物序列由上海生工合成，見表1。

表1 PCR各基因引物序列

基因名稱引物序列（5’～3’）產(chǎn)物長度/bp TNNI3 上游：TGTGGACAAGGTGGATGAAG下游：TGCCTCGAAGGTCAAAGAT103 CX43上游：CAAAATCGAATGGGGCAGGC下游：GCTGGTCCACAATGGCTAGT135 α-actinin上游：CCTGGGTATGATCTGGACCATC下游：TCCAAGGCCATCTTTCCAGC165 Oct4上游：TCTGAGACATGATGCTCTTCCTT下游：TCACTCAAGTATCACCCCCAG102 GAPDH上游：GTCAAGGCTGAGAACGGGAA下游：AAATGAGCCCCAGCCTCCTC162

2.4 白藜蘆醇和淫羊藿苷聯(lián)合常規(guī)誘導分化實驗

選擇0.05 μmol/L淫羊藿苷和0.1 μmol/L白藜蘆醇用于后續(xù)的分化實驗。將生長狀態(tài)良好的細胞傳代至培養(yǎng)皿，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗分為正常組、淫羊藿苷組、白藜蘆醇組、淫白聯(lián)合組、常規(guī)誘導組、淫白聯(lián)合＋常規(guī)誘導組。正常組：只加正常培養(yǎng)液培養(yǎng)，不進行誘導。淫羊藿苷組：當細胞密度達90%～98%時，更換成0.05 μmol/L淫羊藿苷溶液進行誘導，每日換液，連續(xù)7 d。白藜蘆醇組：當細胞密度達90%～98%時，更換成0.1 μmol/L白藜蘆醇溶液進行誘導，每日換液，連續(xù)7 d。淫白聯(lián)合組：當細胞密度達90%～98%時，更換成含0.05 μmol/L淫羊藿苷和0.1 μmol/L白藜蘆醇的溶液進行誘導，每日換液，連續(xù)7 d。常規(guī)誘導組：當細胞密度達90%～98%時，使用人iPS分化培養(yǎng)基進行誘導分化。步驟：PBS洗2遍，每孔加2 mL誘導分化試劑Ⅰ，48 h后吸掉誘導分化試劑Ⅰ，PBS輕洗2遍；每孔加2 mL誘導分化試劑Ⅱ，48 h后吸掉誘導分化試劑Ⅱ，PBS輕洗2遍；每孔加2 mL誘導分化試劑Ⅲ，48 h后換新鮮的誘導分化試劑Ⅲ，之后液體變黃便更換新鮮誘導分化試劑Ⅲ，直至出現(xiàn)細胞跳動。淫白聯(lián)合＋常規(guī)誘導組：當細胞密度達90%～98%時，在常規(guī)誘導的基礎(chǔ)上，添加0.05 μmol/L淫羊藿苷和0.1 μmol/L白藜蘆醇溶液進行聯(lián)合誘導分化，連續(xù)7 d。

2.5 Western blot檢測

誘導7 d，用刮刀將細胞刮下，轉(zhuǎn)至15 mL離心管，1000 r/min離心5 min，吸掉上清液，加入500 μL含磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液RIPA，反復吹打，冰上靜置10 min。4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液，98 ℃變性5 min，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗，4 ℃搖床孵育過夜，0.01 mol/L PBST洗3次，加入對應的二抗，室溫孵育1 h。0.01 mol/L PBST洗3遍，ECL化學發(fā)光，對蛋白條帶拍照并對條帶灰度值進行統(tǒng)計分析。

2.6 miRNA表達檢測

經(jīng)miRcute miRNA提取分離試劑盒提取各樣本miRNA，通過miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒對1 μg miRNA行反轉(zhuǎn)錄。將2×miRcute Plus miRNA Premix、50×ROX Reference Dye和Reverse Primer冰上溶化，配制反應體系。按下述程序進行qPCR反應：95 ℃變性15 min；94 ℃、20 s，60 ℃、34 s，45個循環(huán)。

3 統(tǒng)計學方法

4 結(jié)果

4.1 淫羊藿苷和白藜蘆醇對誘導性多能干細胞增殖的影響

結(jié)果顯示，0.1 μmol/L淫羊藿苷在3個時間點均可促進iPS增殖，0.05 μmol/L淫羊藿苷對iPS增殖無明顯影響；1 μmol/L淫羊藿苷48、72 h可促進iPS增殖，10 μmol/L淫羊藿苷72 h有利于iPS增殖；25、50、100 μmol/L白藜蘆醇24、48、72 h均可降低iPS增殖。結(jié)果見圖1。

注：與正常組比較，*P＜0.05

4.2 淫羊藿苷和白藜蘆醇單獨誘導對誘導性多能干細胞向心肌細胞分化的影響

不同濃度淫羊藿苷和白藜蘆醇處理7 d，光鏡觀察和RT-qPCR檢測人iPS向心肌細胞的分化。鏡下可見，隨著淫羊藿苷和白藜蘆醇處理時間的增加，iPS發(fā)生明顯改變，由圓形逐漸變?yōu)殚L梭形，淫羊藿苷組較白藜蘆醇組形態(tài)發(fā)生改變更明顯，且時間更早，見圖2。RT-qPCR結(jié)果顯示，不同濃度淫羊藿苷處理后均可顯著下調(diào)干細胞標志物Oct4的表達，顯著上調(diào)心肌標志物TNNI3、α-actinin和Cx43的表達；白藜蘆醇可下調(diào)Oct4的表達，并上調(diào)TNNI3、α-actinin和Cx43的表達。見圖3。

4.3 淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合誘導對誘導性多能干細胞向心肌細胞分化的影響

根據(jù)“4.2”項下檢測結(jié)果可知，0.05 μmol/L淫羊藿苷未促進iPS增殖，且能顯著抑制Oct4的表達，上調(diào)TNNI3和α-actinin的表達；0.1 μmol/L白藜蘆醇顯著下調(diào)Oct4的表達，上調(diào)TNNI3和α-actinin的表達。因此，選擇0.05 μmol/L淫羊藿苷和0.1 μmol/L白藜蘆醇對iPS聯(lián)合誘導，光鏡觀察和RT-qPCR、Western blot檢測淫羊藿苷和白藜蘆醇誘導人iPS向心肌細胞分化的作用。與人iPS心肌細胞常規(guī)誘導方法比較，添加淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合誘導后iPS-CMs更易連接成片，有利于誘導后期的搏動；淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合誘導較淫羊藿苷和白藜蘆醇單獨誘導α-actinin mRNA表達升高；與常規(guī)誘導類似，淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合誘導可顯著降低Oct4的表達，且α-actinin mRNA和cTnT蛋白的表達顯著升高（＜0.05）。結(jié)果見圖4。

圖2 淫羊藿苷和白藜蘆醇誘導iPS向心肌細胞分化后形態(tài)（標尺＝100 μm）

注：與正常組比較，*P＜0.05

注：A.光鏡觀察（標尺=50 μm）；B、C. RT-qPCR；D、E. Western blot；與正常組比較，*P＜0.05；與淫白聯(lián)合組比較，#P＜0.05；與常規(guī)誘導組比較，△P＜0.05

4.4 淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合誘導對miR-1和miR-133表達的影響

與常規(guī)誘導組比較，添加淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合處理可明顯上調(diào)miR-1的表達，顯著下調(diào)miR-133的表達，見圖5。

注：與常規(guī)誘導組比較，△P＜0.05，△△P＜0.0

5 討論

心肌梗死在心血管疾病中最為嚴重，大部分心肌梗死由冠狀動脈堵塞導致。冠狀動脈堵塞后，局部心肌缺血缺氧，導致心肌細胞壞死，壞死的心肌組織膠原沉積，形成纖維化瘢痕，導致心肌收縮能力下降，甚至引起心力衰竭和死亡。雖然干細胞移植治療心肌梗死越來越受到重視，但也存在一些問題。如干細胞向心肌細胞分化和增殖問題，移植后干細胞在體內(nèi)存活，以及干細胞遷移和歸巢問題。干細胞治療可直接移植未分化的干細胞，也可在體外先將干細胞誘導分化為心肌細胞，再移植到體內(nèi)。在體外誘導干細胞分化為心肌細胞，得到的心肌細胞其成熟度不高，移植后與宿主心肌細胞不能形成電偶聯(lián)，可能導致宿主心律不齊、心律失常[13]。

iPS-CM成熟至關(guān)重要，它是衡量一個細胞具有生理功能的基礎(chǔ)，也是決定干細胞移植治療成功與否的關(guān)鍵因素之一。有研究發(fā)現(xiàn)，電刺激可提高iPS向心肌分化的效率并促進心肌細胞成熟。電刺激預處理心肌細胞成為臨床應用于心肌梗死治療的有前景的方法[14]?，F(xiàn)代藥理研究表明，淫羊藿苷通過Wnt信號通路調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細胞雙向分化（促進向成骨細胞分化，抑制向脂肪細胞分化）而發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用[15]；并可通過介導激酶信號傳遞途徑促進神經(jīng)干細胞的自我更新與分化[16]。淫羊藿苷可誘導小鼠ESC分化為搏動功能性心肌細胞[9]。淫羊藿苷能部分通過調(diào)節(jié)JP2促進心肌分化，并改善心肌細胞的Ca2+調(diào)節(jié)功能[8]。白藜蘆醇可抑制經(jīng)典Wnt信號通路，激活SRF-miR-1軸，促進人iPS向心肌細胞分化[17]。TNNI3和α-actinin作為心肌細胞的特異標志物，是檢測干細胞向心肌分化的重要指標[18-19]。此外，Cx43參與偶聯(lián)心肌細胞間的電、化學信號的傳遞，也可作為心肌發(fā)育晚期的標志物[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷和白藜蘆醇均可上調(diào)TNNI3、Cx43、α-actinin的表達，并且淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合誘導比淫羊藿苷和白藜蘆醇單獨誘導進一步上調(diào)α-actinin的表達。此外，與常規(guī)誘導比較，添加淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合處理可顯著上調(diào)α-actinin mRNA和cTnT蛋白的表達。

miR-1在心臟疾病中扮演著重要角色[21]。有研究表明，miR-1通過下調(diào)Dll-1-Hes-1/Notch信號調(diào)控間充質(zhì)干細胞向心肌樣細胞分化[22]。與miR-1相反，miR-133可通過靶向抑制SRF的表達促進成肌細胞的增殖并抑制其分化[23]。我們通過RT-qPCR檢測miR-1和miR-133的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合處理可明顯上調(diào)miR-1的表達，顯著下調(diào)miR-133的表達。這可能是淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合處理促進iPS-CMs成熟的作用機制之一。

此外，iPS在體外誘導分化的程度可影響iPS移植治療心肌梗死的效果。有研究比較誘導4、8、20、30 d后iPS-CMs移植的效果，發(fā)現(xiàn)誘導20 d后iPS-CMs在宿主小鼠心臟中具有最高的植入率、增殖力和治療潛力[24]。本研究將淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合處理誘導時間為7 d，淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合處理時間延長是否會有更好的效果值得進一步探討。

綜上所述，淫羊藿苷和白藜蘆醇聯(lián)合誘導可進一步促進iPS向心肌細胞的分化，其機制可能與上調(diào)miR-1和下調(diào)miR-133的表達有關(guān)。本研究為解決iPS-CMs移植治療心肌梗死等缺血性心臟病面臨的關(guān)鍵問題提供了新的策略和手段。

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Study on Effects and Mechanism of Icariin Combined with Resveratrol forDifferentiation of Induced Pluripotent Stem Cells into Cardiomyocytes

XUAN Shousong, LUO Zhirong, LI Han, ZHAO Tiantian, MOU Fangfang, SHAO Shuijin, GUO Haidong

To study whether the combination of icariin and resveratrol can further improve the effects of differentiation of induced pluripotent stem cells (iPS) into cardiomyocytes; To discuss its possible mechanism.CCK8 assay was used to detect the effects of icariin and resveratrol on the proliferation of iPS. Different concentrations of icariin and resveratrol were chosen to induce the differentiation of iPS into cardiomyocytes, and RT-qPCR was used to detect the changes of cardiomyocyte markers TNNI3, Cx43, α-actinin and stem cell marker Oct4. On the basis of conventional induction, the combination of 0.05 μmol/L icariin and 0.1 μmol/L resveratrol were added to induce iPS; the expression of cTnT was detected by western blot; the expression of miR-1 and miR-133 were detected by RT-qPCR.0.05 μmol/L icariin had no significant effect on the proliferation of iPS. 0.1 μmol/L, 1 μmol/L and 10 μmol/L icariin could promote the proliferation of iPS, while resveratrol could inhibit the proliferation of iPS. Different concentrations of icariin could down-regulate the expression of Oct4, but up-regulate the expressions of TNNI3, Cx43 and α-actinin; resveratrol also could decrease the expression of Oct4 and increase the expressions of TNNI3, Cx43 and α-actinin. Compared with the conventional induction method, the combination of icariin and resveratrol could significantly increase the expressions of α-actinin mRNA, cTnT protein and miR-1, but significantly inhibit the expression of miR-133.The combination of icariin and resveratrol can further promote the differentiation of iPS into cardiomyocytes, and the mechanism may be related to the regulation of expressions of miR-1 and miR-133.

icariin; resveratrol; induced pluripotent stem cells; differentiation; miRNA

R285.5

A

1005-5304(2020)08-0057-06

10.3969/j.issn.1005-5304.202004037

國家自然科學基金（81673729、81704157）；上海市進一步加快中醫(yī)藥事業(yè)發(fā)展三年行動計劃（ZY (2018-2020)-CCCX-2001-01）

國海東，E-mail：hdguo@shutcm.edu.cn

（2020-04-01）

（2020-04-22；編輯：華強）