王迪，成秀梅，李新華，任艷青，薛兵，任威威，方惠敏，楊彩瑞

加減溫經(jīng)湯對(duì)婦科寒凝血瘀證大鼠Rho/ROCK信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)的影響

王迪，成秀梅，李新華，任艷青，薛兵，任威威，方惠敏，楊彩瑞

河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050020

觀察加減溫經(jīng)湯對(duì)婦科寒凝血瘀證大鼠Rho/ROCK信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)的影響，探討其調(diào)節(jié)微血管的作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、BQ123組和溫經(jīng)湯組，冰水浴法建立婦科寒凝血瘀證大鼠模型，檢測(cè)大鼠全血血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)，ELISA檢測(cè)血清和卵巢組織內(nèi)皮素（ET）-1和一氧化氮（NO）含量，RT-qPCR和Western blot分別檢測(cè)卵巢組織Rho/ROCK信號(hào)通路關(guān)鍵因子RhoA、ROCK1、MLCK mRNA和蛋白的表達(dá)。與空白組比較，模型組大鼠全血血液流變學(xué)相關(guān)指標(biāo)均明顯升高（＜0.01，＜0.05），血清和卵巢組織ET-1含量明顯升高，NO含量明顯降低（＜0.01），卵巢組織RhoA、ROCK1、MLCK mRNA和蛋白表達(dá)明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，BQ123組和溫經(jīng)湯組大鼠血清和卵巢組織ET-1含量明顯降低，NO含量明顯升高（＜0.01，＜0.05），卵巢組織RhoA、ROCK1、MLCK mRNA和蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.01）。加減溫經(jīng)湯通過(guò)抑制Rho/ROCK信號(hào)通路相關(guān)因子的過(guò)度激活，改善卵巢子宮組織微血管調(diào)節(jié)的失衡，從而治療婦科寒凝血瘀證。

婦科寒凝血瘀證；微血管調(diào)節(jié)；加減溫經(jīng)湯；Rho/ROCK信號(hào)通路；大鼠

寒凝血瘀證是中醫(yī)婦科臨床常見證候，寒邪侵襲人體，沖任胞脈瘀阻，影響胞宮正常生理功能，血行不通，發(fā)為痛經(jīng)；胞宮經(jīng)血不能按時(shí)滿溢，可見行經(jīng)不暢、月經(jīng)量少、月經(jīng)延期、閉經(jīng)、不孕等表現(xiàn)，臨床可涉及現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多種婦科疾病，如痛經(jīng)、功能失調(diào)性子宮出血、子宮內(nèi)膜異位癥、多囊卵巢綜合征、盆腔炎等[1]。婦科寒凝血瘀證是指婦科疾病范圍內(nèi)的寒凝血瘀證，主要為寒客沖任胞宮導(dǎo)致的寒凝血瘀型月經(jīng)病。本課題組前期研究表明，婦科寒凝血瘀證可能存在微循環(huán)障礙和微血管調(diào)節(jié)失衡，微血管出現(xiàn)收縮、痙攣[2-3]。已知Rho/ROCK信號(hào)通路在血管內(nèi)皮細(xì)胞屏障的調(diào)節(jié)作用中擔(dān)任重要角色，如在血管收縮和舒張、血管重構(gòu)、血管通透性調(diào)節(jié)中發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用[4]。本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上觀察加減溫經(jīng)湯對(duì)婦科寒凝血瘀證大鼠Rho/ROCK信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)的影響，探討其調(diào)節(jié)微血管的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)雌性SD大鼠48只，體質(zhì)量（180±20）g，北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK（京）2016-0011。飼養(yǎng)于河北中醫(yī)學(xué)院科研中心清潔級(jí)實(shí)驗(yàn)室，室溫20～23 ℃，相對(duì)濕度45%～55%，光照12 h，自由攝食飲水。

1.2 藥物及制備

加減溫經(jīng)湯（肉桂10 g，吳茱萸10 g，當(dāng)歸10 g，川芎10 g，白芍10 g，莪術(shù)10 g，牡丹皮10 g，牛膝12 g，延胡索10 g，甘草6 g），免煎顆粒購(gòu)自河北中醫(yī)學(xué)院國(guó)醫(yī)堂。先將蒸餾水加熱至90 ℃以上，倒入免煎顆粒，攪拌并充分溶解，制成含3.42 g原藥材/mL藥液，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。BQ123（內(nèi)皮素A受體抑制劑），美國(guó)MCE公司，批號(hào)136553-81-6，生理鹽水稀釋，配制注射液濃度為200 μg/mL，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

RhoA兔抗（10749-AP）、ROCK1兔抗（21850-1-AP），美國(guó)Proteintech；MLCK兔抗（ab200809），美國(guó)Abcam；RNA提取試劑盒（R6934-01），美國(guó)Omega；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（R223-01）、RT-qPCR熒光試劑盒（Q111-02），南京Vazyme生物；GAPDH引物（A1894473）、RhoA引物（A1894473）、ROCK1引物（A1809660）、MLCK引物（A1847539），武漢Service生物；內(nèi)皮素（ET）-1 ELISA試劑盒（S14019020）、一氧化氮（NO）ELISA試劑盒（S16018020），武漢華美生物。LBY-N7500B全自動(dòng)血液流變儀（北京精密儀器廠），Versa max微孔板檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)美谷分子儀器），164-5052蛋白電泳和轉(zhuǎn)膜轉(zhuǎn)移儀（美國(guó)伯樂(lè)），ImageQuant LAS-4000化學(xué)發(fā)光成像分析儀（日本GE），Nanodrop 2000c超微量分光光度計(jì)（美國(guó)賽默飛世爾），PX2 PCR儀，7500-fast實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模和給藥

適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，48只大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、BQ123組、溫經(jīng)湯組，每組12只。采用冰水浴法（將大鼠置于0～1 ℃冰水20 min，每日1次，連續(xù)21 d）建立寒凝血瘀證大鼠模型[5]，大鼠出現(xiàn)蜷縮少動(dòng)，口、鼻、爪、尾、耳廓色紫黯，喜扎堆，反應(yīng)遲鈍，毛色黯淡，飲食量減少，小便清長(zhǎng)，大便溏薄等，即成功建立寒凝血瘀證候動(dòng)物模型。每日進(jìn)行大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片，動(dòng)情周期延長(zhǎng)則表明成功建立婦科寒凝血瘀證動(dòng)物模型。溫經(jīng)湯組每日給予溫經(jīng)湯（10.26 g/kg）灌胃，空白組和模型組給予等體積蒸餾水灌胃，給藥體積10 mL/kg，共21 d；BQ123組造模1周后每日腹腔注射400 μg/kg BQ123，共14 d。于21 d末大鼠正處于動(dòng)情間期時(shí)取材。

2.2 血液流變學(xué)檢測(cè)

采集大鼠全血樣本，自制抗凝采血管，即1%肝素鈉溶液0.1 mL放入10 mL采血管中，均勻浸濕管壁，于65 ℃烘箱烤干備用。大鼠禁食不禁水24 h，腹腔注射10%水合氯醛（200 mg/kg）麻醉，股動(dòng)脈取血，隨機(jī)抽取6只分離血清，另6只采血時(shí)將血液接入抗凝采血管，并輕搖使血液與肝素鈉充分混勻，30 min內(nèi)置于全自動(dòng)血液流變儀中，檢測(cè)全血血液流變學(xué)指標(biāo)。

2.3 卵巢和子宮組織HE染色

取新鮮組織，部分4%多聚甲醛固定，部分置于-80 ℃冰箱保存。將組織切片依次放入二甲苯、無(wú)水乙醇、梯度乙醇脫蠟至水，蒸餾水沖洗；蘇木精染細(xì)胞核后用水沖洗，1%鹽酸-乙醇分化，水洗返藍(lán)；伊紅染細(xì)胞質(zhì)；切片依次放入梯度乙醇和無(wú)水乙醇、二甲苯脫水、透明并封片，顯微鏡下觀察，并采集圖像進(jìn)行分析。

2.4 血清和卵巢組織內(nèi)皮素-1和一氧化氮含量檢測(cè)

一部分血液于室溫靜置2 h，4 ℃、3000 r/min離心15 min，吸取血清并分裝，置于-20 ℃冰箱保存。ELISA檢測(cè)血清和卵巢組織ET-1、NO含量，實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，終止反應(yīng)后5 min內(nèi)于酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量各孔光密度（OD值）。

2.5 卵巢組織RhoA、ROCK1、MLCK基因表達(dá)檢測(cè)

采用RT-qPCR檢測(cè)卵巢組織RhoA、ROCK1、MLCK基因相對(duì)表達(dá)量，引物序列見表1。組織總RNA提取按試劑盒說(shuō)明書操作。檢測(cè)RNA濃度及純度，測(cè)得1.8＜A260 nm/A280 nm＜2.0，表明所提樣本RNA濃度和純度較好。反轉(zhuǎn)錄cDNA按試劑盒說(shuō)明書操作，于PCR儀42 ℃、60 min，70 ℃、5 min滅活。RT-qPCR：取0.2 mL PCR八聯(lián)管，配制擴(kuò)增體系，按試劑盒說(shuō)明書操作進(jìn)行反應(yīng)擴(kuò)增。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃、10 min；熱循環(huán)40次、95 ℃，15 s→60 ℃，60 s；融解曲線95 ℃、15 s，60 ℃、15 s，95 ℃、15 s。反應(yīng)結(jié)束確認(rèn)RTq-PCR擴(kuò)增曲線和融解曲線。以GAPDH為內(nèi)參照，采用參照基因ΔCt法（2-ΔΔCt），根據(jù)Ct值計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 PCR各基因引物序列

基因名稱引物序列產(chǎn)物長(zhǎng)度/bp GAPDHR：5’-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3’138 F：5’-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3’ RhoAR：5’-TGTGGCAGATATTGAAGTGGACG-3’261 F：5’-CGCCTTGTGTGCTCATCATTC-3’ ROCK1R：5’-GGAAACGCTCCGAGACACTG-3’210 F：5’-CTGTTCTCACTGGGATTTGCTG-3’ MLCKR：5’-CGCCACTTCCAGATAGACTAC-3’139 F：5’-ACCTTCCTCCATCGTTTCC-3’

2.6 卵巢組織RhoA、ROCK1、MLCK蛋白表達(dá)檢測(cè)

組織總蛋白提取，卵巢組織用PBS沖洗，放入離心管，加入RIPA蛋白裂解液，置于冰上，超聲勻漿器組織勻漿和震蕩，冰上靜置30 min；4 ℃、12 000離心10 min，提取上清為總蛋白溶液；GAPDH、RhoA、ROCK1、MLCK抗體稀釋比例分別為1∶5000、1∶500、1∶500、1∶5000。檢測(cè)蛋白濃度后加1/4積蛋白上樣buffer，于＞95 ℃加熱5 min進(jìn)行蛋白變性，保存于-20 ℃或準(zhǔn)備上樣，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，于室溫5%脫脂牛奶中封閉1.5～2 h，滴加適量一抗，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜后，滴加二抗室溫孵育1 h，避光，PVDF膜浸入發(fā)光液并置于暗箱，自動(dòng)曝光，用Image J軟件進(jìn)行OD值分析，以目的蛋白和內(nèi)參蛋白OD值比值為目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

4 結(jié)果

4.1 一般狀況

模型組大鼠表現(xiàn)為寒戰(zhàn)、豎毛、多動(dòng)、煩躁、飲水增多等表寒發(fā)熱癥狀，說(shuō)明造模開始時(shí)大鼠生理功能代償性增強(qiáng)；繼而出現(xiàn)畏寒、喜扎堆、蜷縮少動(dòng)、反應(yīng)遲鈍、爪尾部紫黯、食少、運(yùn)動(dòng)遲緩、弓背豎毛、體形消瘦、體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢、毛發(fā)少榮無(wú)光澤、小便色清、大便增多、糞質(zhì)較軟等寒證相關(guān)癥狀；舌質(zhì)紫黯，舌下脈絡(luò)增粗、增長(zhǎng)，口唇、爪甲、耳緣微血管、尾部、鼻腔顏色紫黯，均提示大鼠存在脈絡(luò)瘀血，符合血瘀證的表現(xiàn)。

4.2 HE染色結(jié)果

空白組大鼠卵巢組織形態(tài)結(jié)構(gòu)無(wú)異常，可見各級(jí)卵泡和黃體組織；模型組大鼠卵泡數(shù)量減少，且少見成熟卵泡，微血管管徑變細(xì)；BQ123組和溫經(jīng)湯組大鼠卵巢組織可見各級(jí)卵泡，數(shù)量增多，但成熟卵泡較少，血管基本正常?？瞻捉M大鼠子宮內(nèi)膜狀態(tài)良好，內(nèi)膜上皮為柱狀上皮細(xì)胞，結(jié)構(gòu)完整，排列整齊，有一定厚度，固有層含豐富的基質(zhì)細(xì)胞和血管；模型組大鼠內(nèi)膜上皮細(xì)胞較薄，腺體稀少且狹窄細(xì)直，結(jié)構(gòu)排列混亂；固有層基質(zhì)細(xì)胞和血管減少，間質(zhì)層細(xì)胞致密；BQ123組子宮內(nèi)膜腺體數(shù)目增多，柱狀腺上皮屈曲度增加，血管豐富；溫經(jīng)湯組子宮內(nèi)膜腺體出現(xiàn)明顯增生和變厚。見圖1。

圖1 各組大鼠卵巢、子宮組織形態(tài)（HE染色，×200）

4.3 加減溫經(jīng)湯對(duì)模型大鼠血液流變學(xué)指標(biāo)的影響

與空白組比較，模型組大鼠全血黏度低中高切、全血還原黏度和紅細(xì)胞聚集指數(shù)明顯升高（＜0.01，＜0.05）；與模型組比較，BQ123組和溫經(jīng)湯組大鼠全血血液流變學(xué)指標(biāo)有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＞0.05）。結(jié)果見表2。

4.4 加減溫經(jīng)湯對(duì)模型大鼠血清和卵巢組織內(nèi)皮素-1和一氧化氮含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清和卵巢組織ET-1含量明顯升高（＜0.01），NO含量明顯降低（＜0.01）；與模型組比較，BQ123組和溫經(jīng)湯組大鼠血清和卵巢組織ET-1含量明顯降低，NO含量明顯升高（＜0.01，＜0.05）。結(jié)果見圖2。

4.5 加減溫經(jīng)湯對(duì)大鼠卵巢組織RhoA、ROCK1、MLCK mRNA表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織RhoA、ROCK1、MLCK mRNA表達(dá)均明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，BQ123組大鼠卵巢組織ROCK1、MLCK mRNA表達(dá)均明顯降低（＜0.01），RhoA下降不明顯，溫經(jīng)湯組RhoA、ROCK1、MLCK mRNA表達(dá)均明顯降低（＜0.05，＜0.01）。結(jié)果見圖3。

表2 各組大鼠全血血液流變學(xué)指標(biāo)比較（±s）

注：與空白組比較，*＜0.05，**＜0.01

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

4.6 加減溫經(jīng)湯對(duì)大鼠卵巢組織RhoA、ROCK1、MLCK蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織RhoA、ROCK1、MLCK蛋白表達(dá)明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，BQ123組和溫經(jīng)湯組大鼠卵巢組織RhoA、ROCK1、MLCK蛋白表達(dá)明顯降低（＜0.01）。結(jié)果見圖4。

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

注：與空白組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01

5 討論

寒邪侵襲人體血脈，血為寒凝，胞脈被阻，影響胞宮生理功能，故寒冷對(duì)大鼠卵巢和子宮的影響表現(xiàn)為婦科寒凝血瘀證的癥狀體征?？梢?，寒冷是婦科疾病的誘因之一，經(jīng)冰水浴法制作婦科寒凝血瘀證模型，可導(dǎo)致局部生殖器官組織形態(tài)和功能異常。HE染色結(jié)果顯示，模型大鼠卵巢濾泡總數(shù)和成熟卵泡數(shù)量減少，體積較小卵泡囊增多，子宮內(nèi)膜變薄，子宮間質(zhì)細(xì)胞增生，子宮內(nèi)膜腺體出現(xiàn)變厚、水腫和減少。

ET和NO作為一對(duì)內(nèi)皮依賴的血管舒-縮因子，二者相互拮抗、相互調(diào)節(jié)[6-7]。生理狀態(tài)下，二者維持著動(dòng)態(tài)平衡，共同維護(hù)正常的血管張力和血液循環(huán)狀態(tài)；而在病理狀態(tài)下，這種動(dòng)態(tài)平衡被打破，局部血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂甚至脫落壞死，血管壁結(jié)構(gòu)遭到破壞，啟動(dòng)血管重構(gòu)，最終導(dǎo)致血管痙攣、血壓升高、血栓形成、瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移等血管損傷性疾病重要的病理環(huán)節(jié)[8-9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，婦科寒凝血瘀大鼠全血血液流變學(xué)指標(biāo)異常，血清和卵巢組織出現(xiàn)血管收縮物質(zhì)ET-1升高和血管舒張物質(zhì)NO降低，均證實(shí)寒凝血瘀證大鼠存在微血管調(diào)節(jié)失衡和微血管循環(huán)障礙。

Rho/ROCK信號(hào)通路的激活與多系統(tǒng)急慢性血管痙攣和血管收縮有關(guān)[10-11]。有研究表明，Rho/ROCK信號(hào)傳導(dǎo)通路可能參與子宮內(nèi)膜異位癥內(nèi)膜異位侵襲和種植的過(guò)程；卵巢癌細(xì)胞中RhoA蛋白過(guò)度表達(dá)與上皮性卵巢癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力呈正相關(guān)，ROCK1活性提高可顯著增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞體外侵襲和遷移能力[12-13]。該信號(hào)通路關(guān)鍵信號(hào)分子有Rho GTP酶、ROCK和肌球蛋白磷酸酶[14-15]。當(dāng)Rho A受到血管緊張素2、白細(xì)胞介素-1β、ET-1等細(xì)胞因子作用時(shí)被激活，與下游ROCK結(jié)合，細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高，MLCK活化并作用于肌球蛋白，使磷酸化肌球蛋白輕鏈含量增多，導(dǎo)致血管通透性增高[16-17]，最終上調(diào)炎癥、氧化應(yīng)激、血栓形成和纖維化的因子，下調(diào)內(nèi)皮型一氧化碳合酶，參與多種疾病的發(fā)病機(jī)制[15，18]。本研究結(jié)果表明，婦科寒凝血瘀證大鼠卵巢組織RhoA、ROCK1、MLCK的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著升高，證實(shí)該信號(hào)通路可能通過(guò)ET-1激活進(jìn)而使RhoA及其下游效應(yīng)物表達(dá)，參與婦科寒凝血瘀證微血管調(diào)節(jié)失衡。

婦科寒凝血瘀證治宜溫經(jīng)散寒、祛瘀止痛?！秼D人大全良方》溫經(jīng)湯是治療沖任虛寒、瘀血阻滯月經(jīng)不調(diào)常用方劑，主要用于月經(jīng)不調(diào)，血海虛寒、氣血凝滯，臍腹得熱痛減，脈沉緊者[19]。本研究所用加減溫經(jīng)湯由溫經(jīng)湯化裁，方中肉桂溫經(jīng)散寒，當(dāng)歸養(yǎng)血活血、調(diào)經(jīng)止痛，川芎行血中之氣，三藥配伍，溫經(jīng)、散寒、調(diào)經(jīng)；吳茱萸溫經(jīng)散寒暖血，兼通血脈；莪術(shù)、牡丹皮、牛膝活血散瘀，且牛膝具有引血下行之功，助當(dāng)歸、川芎通行血滯；白芍、甘草緩急止痛?，F(xiàn)代藥理研究表明，方中藥物有鎮(zhèn)痛、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗凝血、中樞興奮、升高體溫、增加血流量、擴(kuò)張血管、降壓、調(diào)節(jié)子宮平滑肌等作用[20-23]。

有研究表明，活血化瘀中藥有下調(diào)Rho/ROCK信號(hào)通路而改善血管平滑肌功能的作用[24-26]。本實(shí)驗(yàn)加減溫經(jīng)湯干預(yù)后，婦科寒凝血瘀證大鼠血清和卵巢組織血管收縮物質(zhì)ET-1降低，血管舒張物質(zhì)NO升高，且卵巢組織Rho/ROCK信號(hào)通路關(guān)鍵因子RhoA、ROCK1、MLCK的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著降低，表明加減溫經(jīng)湯可通過(guò)抑制Rho/ROCK信號(hào)通路的過(guò)度激活而改善婦科寒凝血瘀證大鼠微血管的調(diào)節(jié)失衡。

綜上所述，婦科寒凝血瘀證大鼠可能存在局部微血管調(diào)節(jié)失衡，血管收縮，Rho/ROCK信號(hào)通路可能參與婦科寒凝血瘀證模型大鼠微血管調(diào)節(jié)失衡的機(jī)制；加減溫經(jīng)湯通過(guò)抑制Rho/ROCK信號(hào)通路的過(guò)度激活，從而改善卵巢子宮的微血管調(diào)節(jié)失衡，達(dá)到治療婦科寒凝血瘀證的目的。

[1] 劉小花.月經(jīng)病實(shí)寒癥患者卵巢子宮血流動(dòng)力學(xué)變化及對(duì)生殖內(nèi)分泌的影響[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué),2013.

[2] 成秀梅,杜惠蘭,李丹,路帥.寒凝血瘀證大鼠血管舒-縮因子變化及與卵巢功能的關(guān)系[J].中藥藥理與臨床,2009,25(6)：91-93.

[3] 王曉松,劉小花,路帥,等.溫經(jīng)湯對(duì)月經(jīng)病實(shí)寒證患者卵巢及子宮血流動(dòng)力學(xué)的影響[J].中華中醫(yī)藥雜志,2017,32(2)：861-863.

[4] ETO M, BARANDIéR C, RATHGEB L, et al. Thrombin suppresses endothelial nitric oxide synthase and upregulates endothelin- converting enzyme-1 expression by distinct pathways：role of Rho/ROCK and mitogen-activated protein kinase[J]. Circ Res,2001, 89(7)：583-590.

[5] 王曉松,王蓓,姚曉光,等.溫經(jīng)湯對(duì)婦科實(shí)寒證模型大鼠子宮HIF-1α、ET-1及VEGF表達(dá)的影響[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2017,28(1)：15-17.

[6] HU Y Y , CHEN X , DUAN H Q, et al. Pulsatilla decoction and its active ingredients inhibit secretion of NO, ET-1, TNF-α, and IL-1α in LPS-induced rat intestinal microvascular endothelial cells[J]. Cell Biochem Funct,2009,27(5)：284-288.

[7] NOGUCHI N, TERAMOTO K, OCHIAI T, et al. The close participation of ET-1 and NO in human hepatic hemodynamics[J]. Hepatol Res, 2006,36(2)：86-93.

[8] CHEN Y, MCCARRON R M, GOLECH S, et al. ET-1 and NO-mediated signal transduction pathway in human brain capillary endothelial cells[J]. Am J Physiol Cell Physiol,2003,284(2)：C243-249.

[9] OLVER T D, MCDONALD M W, KLAKOTSKAIA D, et al. A chronic physical activity treatment in obese rats normalizes the contributions of ET-1 and NO to insulin-mediated posterior cerebral artery vasodilation[J]. J Appl Physiol,2017,122(4)：1040-1050.

[10] PEARSON J T, JENKINS M J, EDGLEY A J, et al. Acute Rho-kinase inhibition improves coronary dysfunction in vivo, in the early diabetic micro-circulation[J]. Cardiovasc Diabetol, 2013,12(1)：111.

[11] TOYOTAKA Y, SHIMOKAWA H, HIRAMATSU O, et al. Beneficial effect of hydroxyfasudil, a specific Rho-kinase inhibitor, on ischemia/reperfusion injury in canine coronary micro-circulation in vivo[J]. J Am Coll Cardiol,2005,45(4)：599-607.

[12] 夏建妹.Rho/ROCK1在子宮內(nèi)膜異位癥患者異位和在位內(nèi)膜的表達(dá)及其意義的研究[D].杭州：浙江大學(xué),2011.

[13] NAKABAYASHI S, MOTOFUMI K, YOSHIOKA T, et al. Effect of intravitreal Rho kinase inhibitor ripasudil (K-115) on feline retinal micro-circulation[J]. Exp Eye Res,2015,139：132-135.

[14] AMIN E, DUBEY B N, ZHANG S C, et al. Rho-kinase：regulation, (dys) function, and inhibition[J]. Biol Chem,2013,394：1399-1410.

[15] HUTCHINSON J L, RAJAGOPAL S P, YUAN M, et al. Lipopolysaccharide promotes contraction of uterine myocytes via activation of Rho/ROCK signaling pathways[J]. FASEB J,2014,28：94-105.

[16] BOGATCHEVA N V, ZEMSKOVA M A, POIRIER C, et al. The suppression of myosin light chain(MLC) phosphorylation during the response to lipopolysaccharide (LPS)：beneficial or detrimental to endothelial barrier[J]. J Cell Physiol,2011,226：3132-3146.

[17] GOHAR E Y, YUSUF C, POLLOCK D M. Ovarian hormones modulate endothelin A and B receptor expression[J]. Life Sci,2016,159：148-152.

[18] SAMUEL M S, RATH N, MASRE S F, et al. Tissue-selective expression of a conditionally-active ROCK2-estrogen receptor fusion protein[J]. Genesis,2016,54(12)：636-646.

[19] 馬佳維,葉明,李榮群.《金匱要略》與《婦人大全良方》溫經(jīng)湯之異同[J].陜西中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2016,39(4)：82-84.

[20] 劉亞靜,張仲.中藥肉桂的藥理作用研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2011,20(23)：2989-2990.

[21] 胡婷婷,張振凌.中藥牛膝化學(xué)成分、藥理作用及儲(chǔ)藏保管[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2016,36(13)：3321-3322.

[22] 舒冰,周重建,馬迎輝,等.中藥川芎中有效成分的藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2006,22(9)：1043-1047.

[23] 金玉青,洪遠(yuǎn)林,李建蕊,等.川芎的化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中藥與臨床,2013,4(3)：44-48.

[24] 張紅珍,李麗,焦瑞,等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠主動(dòng)脈Rho激酶及NF-κB p65 mRNA表達(dá)的影響[J].中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志,2015, 35(12)：1495-1500.

[25] 李白坤.基于Rho/Rocks通路研究桃紅四物湯對(duì)產(chǎn)后病血瘀證大鼠活血祛瘀的作用機(jī)制[D].合肥：安徽中醫(yī)藥大學(xué),2013.

[26] 梁娜.IUD出血副反應(yīng)臨床中醫(yī)證候調(diào)查及宮寧顆粒調(diào)控模型大鼠子宮VSMC凋亡相關(guān)機(jī)制的研究[D].濟(jì)南：山東中醫(yī)藥大學(xué),2013.

Effects of ModifiedDecoction on Rho/ROCK Signaling Pathway Related Factors Expression inRats with Gynecological Cold Coagulation and Blood Stasis Syndrome

WANG Di, CHENG Xiumei, LI Xinhua, REN Yanqing, XUE Bing, REN Weiwei, FANG Huimin, YANG Cairui

To explore the effects of modifiedDecoction on Rho/ROCK signaling pathway related factors expression in rats with gynecological cold coagulation and blood stasis syndrome; To explore the mechanism of its role in regulating microvessels.The experimental rats were divided into blank group, model group, BQ123 group andDecoction group. Rat models of gynecological cold coagulation and blood stasis syndrome were established by ice-water bath method. Whole blood rheology was measured in each group. ET-1 and NO in serum and ovarian tissue were detected by ELISA. RT-qPCR and Western blot were used to detect the expression of RhoA, ROCK1, MLCK mRNA and protein, which were the key factors of Rho/ROCK signaling pathway in ovarian tissue.Compared with the blank group, the whole blood rheological indexes in the model group increased (<0.01,<0.05), the ET-1 content in serum and ovarian tissue increased, NO content decreased significantly (<0.01), and the RhoA, ROCK1, MLCK mRNA and protein expression in ovarian tissue increased significantly (<0.01). Compared with the model group, the ET-1 content in serum and ovarian tissue decreased significantly in BQ123 andDecoction groups, NO content increased significantly（<0.01,<0.05）, and RhoA, ROCK1, MLCK mRNA and protein in ovarian tissue significantly decrease (<0.01).ModifiedDecoction can improve the imbalance of microvascular regulation in ovary and uterus, and treat gynecological cold coagulation and blood stasis syndrome by inhibiting the over-activation of Rho/ROCK signaling pathway related factors.

gynecological cold coagulation and blood stasis syndrome; microvascular regulation; modifiedDecoction; Rho/ROCK signaling pathway; rats

R285.5

A

1005-5304(2020)08-0051-06

10.3969/j.issn.1005-5304.202001203

河北省研究生創(chuàng)新基金項(xiàng)目（CXZZBS2018156）；河北省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（ZD2018035）

成秀梅，E-mail：xiumeicheng123@126.com

（2020-01-13）

（2020-02-15；編輯：華強(qiáng)）