丁曉彥，俎龍輝， 王變利

(山東省中醫(yī)藥研究院 山東省中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250014)

黃芩是臨床常用中藥，有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的功效，主要用于上呼吸道感染、肺熱咳嗽、濕熱黃疸等癥。目前市場上黃芩野生品、不同生長年限的栽培品皆有，質(zhì)量差別大，這對黃芩相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量和臨床使用效果有著直接的影響。近幾年研究表明，除《中國藥典》[1]規(guī)定的定量指標(biāo)成分——黃芩苷以外，黃芩中的黃芩素、漢黃芩素等[2-3]也與其功效有關(guān)，是其主要特征成分。

對于多成分多指標(biāo)的中藥質(zhì)量評價(jià)研究，目前使用較多的方法是譜-效相關(guān)分析[4]，而合理的數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)和處理方法的選擇是譜-效相關(guān)分析中的重要部分[5]?，F(xiàn)在，應(yīng)用于該領(lǐng)域的數(shù)據(jù)分析處理方法有相關(guān)分析[6]、主成分分析[7]、灰色關(guān)聯(lián)度分析[8]、神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[9]、偏最小二乘回歸分析[10-11]等。這些分析方法各有特點(diǎn)和側(cè)重，其中，偏最小二乘回歸分析具有預(yù)測功能，適合在數(shù)據(jù)量小，甚至比變量維數(shù)還小，而相關(guān)性又比較大時(shí)使用。王艷輝等[12]采用該分析方法找到了不同產(chǎn)地穿心蓮樣品中4個(gè)與抑菌活性密切相關(guān)的化學(xué)成分，為建立其準(zhǔn)確、可靠的質(zhì)量評價(jià)方法提供了依據(jù)。

根據(jù)偏最小二乘回歸分析法的適用范圍和本研究的數(shù)據(jù)特點(diǎn)，擬采用該方法對黃芩抑菌作用的譜-效相關(guān)性進(jìn)行研究，并建立數(shù)學(xué)模型，以探尋黃芩中各主要成分對其抑菌作用的貢獻(xiàn)大小，并為完善黃芩譜-效相關(guān)質(zhì)量綜合評價(jià)系統(tǒng)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 儀器

電子天平(BP125D型，德國Sartorius)；Milli-Q7000純水機(jī)(美國Millipore)；Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2996紫外檢測器(美國Waters)；Waters Empower色譜工作站(美國Waters)；SpectraMax M5酶標(biāo)儀(美國 Molecular Devices)；TA-2XJP型細(xì)菌濁度計(jì)(北京天安聯(lián)合科技有限公司)。

1.2 材料

黃芩樣品購自藥店及飲片公司，經(jīng)山東省中醫(yī)藥研究院林慧彬研究員鑒別為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi的干燥根；葛根素對照品(批號(hào)：110752-200912)購自中國食品藥品檢定研究院；阿莫西林膠囊(產(chǎn)品批號(hào)：400170311) 購自石藥集團(tuán)；胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基(TSB，批號(hào)：20160106)，購自青島日水生物技術(shù)有限公司。

1.3 試劑配制

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基：稱取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基干粉30 g于1 L蒸餾水中，微溫溶解，分裝，121 ℃高壓滅菌15 min，于4 ℃冰箱冷藏，備用。

1.4 數(shù)據(jù)

本研究所用的數(shù)據(jù)共10批，每批由11個(gè)數(shù)據(jù)組成，包括指紋圖譜數(shù)據(jù)(前10個(gè))和抑菌率值(最后1個(gè))兩部分。其中，指紋圖譜數(shù)據(jù)來源于各黃芩樣品的HPLC指紋圖譜分析，是指紋圖譜10個(gè)共有峰與內(nèi)標(biāo)物峰的比值(相對峰面積值)。

2 方法與結(jié)果

2.1 指紋圖譜建立

2.1.1 色譜條件

采用Waters Symmetry C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相0.3%磷酸水溶液(A)-乙腈(C)梯度洗脫(0～30 min，15%C，1.0 mL/min；31～40 min，25%C，0.8 mL/min；41～70 min，40%C，0.8 mL/min；71～80 min，40%C，0.8 mL/min；81～90 min，60%C，0.8 mL/min；91～100 min，70%C，0.8 mL/min)，柱溫30 ℃，檢測波長275 nm，進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 供試品溶液的制備

2.1.2.1 黃芩樣品溶液的制備

四是組織實(shí)施《全國抗旱規(guī)劃》。《全國抗旱規(guī)劃實(shí)施方案》已上報(bào)國務(wù)院，批復(fù)后將盡快組織實(shí)施。重點(diǎn)加強(qiáng)小型水庫工程、引調(diào)提水工程、抗旱應(yīng)急備用井等抗旱應(yīng)急水源工程建設(shè)，確保旱區(qū)居民基本生活用水，保障基本口糧田作物生長關(guān)鍵期的用水需求。在有條件的地區(qū)，大力推進(jìn)抗旱重大骨干水源工程建設(shè)，逐步完善抗旱供水保障體系。

從冰柜中取出黃芩粉末樣品，放置至室溫。采用四分法，按比例分別稱取20～60目的黃芩粉末和過60目篩的黃芩粉末，共0.15 g，精密加入60 mL沸水，稱定重量，置沸水浴中保溫30 min，每隔10 min振搖一次，取出放至室溫，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心(轉(zhuǎn)速2500 r/min)15 min，取上清液1 mL，加水稀釋至10 mL，搖勻，用0.45 μm的微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

2.1.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液的制備

取葛根素對照品適量，加水制成30 μg/mL的對照品溶液。

2.1.2.3 供試品溶液的制備

精密量取黃芩樣品續(xù)濾液與內(nèi)標(biāo)溶液各0.5 mL，混勻，即得。

2.1.3 方法學(xué)考察

取2.1.2.3項(xiàng)下供試品溶液，按2.1.1項(xiàng)下條件連續(xù)進(jìn)樣6次，結(jié)果各共有峰與內(nèi)標(biāo)峰相對保留時(shí)間和相對峰面積值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于3.0%，表明儀器精密度良好。取同一供試液，在室溫放置0、2、4、8、12 h進(jìn)樣，測定指紋圖譜，結(jié)果各共有峰與內(nèi)標(biāo)峰相對保留時(shí)間和相對峰面積值的RSD均小于3.0%，表明供試液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。取同一批樣品制備供試液，重復(fù)制備6份，測定，結(jié)果各共有峰與內(nèi)標(biāo)峰相對保留時(shí)間和相對峰面積值的RSD均小于3.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.4 指紋圖譜的建立及色譜峰確定

1—白楊素-6-C-阿拉伯糖-8-C-葡萄糖苷；2—白楊素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷；3—黃芩苷；4—黃芩苷異構(gòu)體；5—5,7,8-三羥基-6-甲氧基黃酮-7-O-葡萄糖酸苷；6—千層紙素-7-O-葡萄糖酸苷；7—漢黃芩苷；8—黃芩素；9—漢黃芩素；10—千層紙素A圖1 黃芩HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of Scutellariae Radix

2.2 體外抑菌實(shí)驗(yàn)

采用96孔板法對黃芩樣品進(jìn)行體外抑金黃色葡萄球菌試驗(yàn)。將2.1.2.1項(xiàng)下不同樣品溶液的濃度調(diào)整至6.25 mg/mL，每孔加入50 μL液體培養(yǎng)基、50 μL樣品液和10 μL調(diào)整濃度的金黃色葡萄球菌液，平行4次，另設(shè)空白組、陽性藥物組(阿莫西林組)及菌液對照組，采用酶標(biāo)儀測定96孔板的OD值，置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)18～24 h后，分別測定其OD值，按式(1)計(jì)算抑菌率。

(1)

2.3 譜-效相關(guān)性分析

2.3.1 偏最小二乘回歸分析方程的建立

本研究采用偏最小二乘回歸分析法，對黃芩的體外抑制金黃色葡萄球菌作用效果進(jìn)行分析，利用SIMCA14.0(Umetrics，瑞典)軟件，選擇黃芩樣品的10個(gè)指紋圖譜色譜峰的相對峰面積數(shù)據(jù)作為自變量X，其抑菌率值作為因變量Y，采用偏最小二乘回歸分析方法進(jìn)行譜-效相關(guān)關(guān)系分析，探討指紋圖譜與抑菌藥效值數(shù)理關(guān)系，得到如下方程：

Y=0.092X1+0.616X2-0.277X3+0.08X4-0.05X5-0.142X6+0.135X7+ 0.295X8+0.248X9-0.167X10。

回歸系數(shù)結(jié)果見表1、圖2。其中，回歸系數(shù)的正、負(fù)代表各成分對抑菌率值的正相關(guān)或負(fù)相關(guān)，回歸系數(shù)絕對值越大，表明該自變量對抑菌率(藥效)影響越大。

表1 標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)及VIP值Table 1 Standardized regression coefficient and VIP value

圖2 標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)Fig.2 Standardized regression coefficient

2.3.2 變量投影重要性分析

變量投影重要性(VIP)代表各成分對藥效值的解釋能力大小，其值越大說明該自變量對因變量的解釋能力越強(qiáng)。VIP分析結(jié)果見表1、圖3。

圖3 各成分VIP值 Fig. 3 VIP value of different components

按照回歸系數(shù)絕對值大小排序，可知各成分對抑菌率作用的影響由大到小依次為：成分2、成分8、成分3、成分9、成分10、成分6、成分7、成分1、成分4、成分5，且成分2、3、8、9、10的變量重要性值較大，在解釋變量Y時(shí)具有顯著重要性，該5種成分有可能是黃芩抗金黃色葡萄球菌的活性物質(zhì)(群)，分別為：白楊素-6-C-葡萄糖-8-C-阿拉伯糖苷(2)、黃芩苷(3)、黃芩素(8)、漢黃芩素(9)、千層紙素A(10)。

2.4 黃芩對金黃色葡萄球菌體外抑制作用的數(shù)學(xué)模型建立

應(yīng)用偏最小二乘回歸分析方法所建模型，得到了黃芩抑菌藥效擬合值，計(jì)算擬合值與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的相對誤差，并使用Matlab 2012a軟件，對擬合數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行畫圖，其中x軸為實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，y軸為擬合數(shù)據(jù)，若兩者相等，則綠色點(diǎn)分布在直線y=x上。結(jié)果顯示，擬合數(shù)據(jù)與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的平均相對誤差為7.25%，由擬合圖可以看出，綠色點(diǎn)在直線y=x周圍均勻分布，該方法建立的數(shù)學(xué)模型的擬合值與實(shí)驗(yàn)值的擬合度較好，具體數(shù)據(jù)見圖4和表2。

圖4 擬合圖Fig.4 Fitting figure

表2 誤差計(jì)算結(jié)果Table 2 Results of the error calculation

3 討論

將中藥的藥效作用與成分相關(guān)聯(lián)是研究中藥藥效成分的一種方法，在明確藥物各主要成分的前提下進(jìn)行這種關(guān)聯(lián)研究，使各成分對藥效指標(biāo)的貢獻(xiàn)大小更加清晰，也能夠更加透徹地解析該藥物的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究在對黃芩樣品主要色譜峰進(jìn)行指認(rèn)的基礎(chǔ)上，采用偏最小二乘回歸分析法進(jìn)行譜效相關(guān)分析，得到了各主要成分對于抑菌作用的貢獻(xiàn)大小，說明了黃芩抑制金黃色葡萄球菌作用是多成分協(xié)同作用的結(jié)果，揭示了黃芩抑菌作用的藥效物質(zhì)(群)，提示在制定黃芩質(zhì)量控制方法時(shí)，應(yīng)考慮增加對藥效作用貢獻(xiàn)率較大的成分進(jìn)行相關(guān)研究。

偏最小二乘回歸分析方法將建模預(yù)測類型的數(shù)據(jù)分析與非模式的數(shù)據(jù)分析有機(jī)結(jié)合，具有擬合度高、預(yù)測能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。本方法建立的數(shù)學(xué)模型，可以初步預(yù)測抑菌藥效值，其預(yù)測結(jié)果的誤差較小，但仍有調(diào)整空間，下一步可以增大樣本量，對模型進(jìn)行修正，降低誤差值，以期采用該方法實(shí)現(xiàn)對黃芩抑菌藥效的準(zhǔn)確預(yù)測。